培养神经元缺氧后PKC活性变化与细胞凋亡关系的研究

目的：探讨蛋白激酶C（PKC）对神经元缺氧凋亡的影响及作用机制。方法：建立体外培养大鼠皮层神经元模型及培养神经元缺氧模型，用三种不同浓度的PKC催化亚基特异性抑制剂Clphostin C预孵育培养神经元后进行缺血处理，观察神经元胞膜PKC（mPKC)活性，Bcl-2表达和TUNEL表达（细胞凋亡）的规律。结果：随着缺氧时间的延长mPKC活性显著增加，同时伴随缺氧时间的延长和ClphostinC 浓度的增加，培养神经元Bcl-2的表达显著下降，TUNEL荧光染色阳性率显著升高，结果：（1)mpKC的活化和Bcl-2表达均参与了缺氧神经元凋亡；（2）缺氧和PKC抑制剂Clphostin C可加重缺氧神经元凋亡，且该作用是通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达实验的；（3）PKC的激活在缺氧神经元凋亡中起保护作用。     

利用RNAi沉默KIAA0280后对缺氧诱导大鼠神经元凋亡的影响

目的利用RNA干扰(RNAi)技术,观察脑缺血相关新蛋白KIAA0280被特异性沉默后对正常神经元和缺氧诱导神经元凋亡的影响。方法取新生大鼠培养至5~7 d的神经元,经由密闭容器引起缺氧诱导神经元凋亡模型。采用RNAi技术封闭KIAA0280的表达,观察该基因被封闭后对正常神经元的生长以及缺氧诱导神经元凋亡的作用和影响。结果脂质体转染KIAA0280基因特异性siRNA12、24 h后对正常细胞生长具有一定的影响;在此基础上缺氧4、8 h,发现RNAi组的神经元对缺氧诱导的神经元凋亡比对照组对缺氧更加敏感,更易受损伤。结论KIAA0280对正常神经元具有一定的作用,并且对缺氧诱导凋亡神经元具有一定的保护作用。     

磷酸酶PTEN在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经元凋亡中的作用

目的 观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 （hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)时,大脑皮层第10号染色体上磷酸酶及张力蛋白同源缺失的基因（PTEN）蛋白、磷酸化（p）-PTEN蛋白、促凋亡蛋白Bim mRNA及蛋白表达变化,探讨抑制PTEN活性对新生大鼠缺氧缺血（HI）神经元凋亡的保护作用机制。 方法 将128只10日龄SD大鼠随机分为4组:缺氧缺血组、假手术组、PTEN脂质磷酸酶抑制剂双过氧化钒 (bisperoxovanadium, bpv)干预组和生理盐水溶剂组。缺氧缺血组在乙醚麻醉下行右侧颈总动脉结扎,氮氧混合气 （92% N2、8% O2）中缺氧2.5 h;假手术组不结扎颈总动脉,不作缺氧处理。bpv干预组和溶剂对照组予腹腔内注射bpv和生理盐水,30 min后做缺氧缺血处理。各组分别于建模后0.5 h及24 h处死动物取大脑皮层,应用Western blot检测PTEN、p-PTEN及Bim的蛋白含量。实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）定量检测Bim mRNA表达水平,应用TUNEL染色法检测凋亡细胞。 结果 缺氧缺血组于HI后0.5 h 及24 h,PTEN蛋白无明显变化,p-PTEN蛋白表达降低。HI后0.5 h,Bim mRNA及蛋白表达增加,与假手术组比较差异有统计学意义 (P<0.05),HI后24 h,Bim mRNA及蛋白恢复至基线水平。bpv干预组PTEN蛋白无明显变化,p-PTEN蛋白表达增加,Bim mRNA及蛋白表达降低,与生理盐水组和缺氧缺血组相比,差异有统计学意义 (P<0.05)。bpv干预组于HI后24 h,TUNEL染色阳性细胞数较生理盐水组和缺氧缺血组减少,凋亡指数降低,差异有统计学意义 (P<0.05)。结论 新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时,PTEN发生去磷酸化,活性增高,抑制PTEN活性可下调前凋亡蛋白Bim mRNA及蛋白表达,减少神经细胞凋亡。     

培养不同时间大鼠皮质在缺糖缺氧损伤中神经元凋亡的观察

目的 观察培养不同时间的大鼠脑皮质神经元对缺糖缺氧的敏感程度,探讨培养时间在皮质神经元损伤中的作用.方法 首先分离孕18天胎鼠的皮质神经元,分为对照组和实验组.实验组于培养6天、8天、12天时分别进行缺糖缺氧(OGD)2h,然后培养24h;采用DAPI染色,荧光显微镜下观察细胞的形态变化.对照组除不进行OGD的损伤外,其他条件与实验组一致.结果 培养12天较培养8天的皮质神经元细胞凋亡率增高,差异有统计学意义(P＜0.05);培养6天的皮质神经元的细胞凋亡率与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 不同培养时间的皮质神经元对OGD损伤反应不同;未成熟的皮质神经元对OGD不敏感,具有耐受性;成熟的皮质神经元随成熟程度的增加,对OGD敏感性增强.     

缺氧条件下新生大鼠皮质神经元凋亡的机制

目的探讨Bcl-2家族促凋亡成员和抗凋亡成员对CoCl2诱导的新生大鼠皮质神经元缺血缺氧模型中神经元存活的影响及其调节机制。方法体外培养原代皮质神经元并建立CoCl2诱导大鼠皮质神经元缺血缺氧模型,用聚合酶链反应和Western免疫印迹技术,检测皮质神经元凋亡时Bcl-2家族促凋亡成员和抗凋亡成员的表达变化。结果促凋亡蛋白Bax在CoCl2模拟缺血缺氧时蛋白上调;而抗凋亡蛋白Bcl-2下降,总体蛋白水平下调(P<0.05)。结论 Bcl-2家族促凋亡成员Bax和抗凋亡成员Bcl-2比例的上升是缺血缺氧过程中神经元凋亡的关键因素。     

蛋白激酶C与培养神经元缺氧后caspase-3表达及细胞凋亡关系的研究

目的 探讨蛋白激酶C（PKC）对神经元缺氧调亡的影响及作用机制。方法 建立体外培养Wistar胎鼠皮层神经元模型及培养神经元缺氧模型,用3种不同浓度的PKC催化亚基特异性抑制剂Calphostin C预孵育培养神经元后进行缺血处理,观察神经元下述指标的改变;神经元存活率、caspase-3（CPP32）和细胞凋亡的规律。结果 随着缺氧时间的延长和Calphostin C浓度的增加,培养神经元的存活数量显著下降、caspase-3和TUNEL荧光染色阳性率及平均荧光强度均显著升高。结论 ①PKCt caspase-3均参与了缺氧神经元调亡;②PKC抑制剂Calphostin C可加重缺氧神经元凋亡;且该作用是通过caspase-3信号转导途径实现的。③PKC的激活在缺氧神经元凋亡中起保护作用。     

大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧致细胞凋亡模型的建立

目的建立大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧致细胞凋亡模型。方法在大鼠鼠胚海马神经元培养基础上,给予不同时间的缺氧复氧,应用Wright-Giemsa染色、TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果随着缺氧和复氧时间的延长神经细胞凋亡数逐渐增加,其中缺氧4 h复氧48 h大鼠海马神经细胞凋亡最为显著。结论缺氧复氧可诱导培养的大鼠海马神经细胞发生凋亡,缺氧4 h复氧48 h可作为细胞凋亡模型。     

还原型辅酶I对缺氧复氧诱发大鼠脑皮层神经元凋亡的保护作用

目的通过建立大鼠脑皮层神经元缺氧复氧模型,探讨还原型辅酶Ⅰ(reduced nicotinamide adenine dinu-cleotide,NADH)对缺氧复氧诱发神经元凋亡的保护作用。方法原代培养新生大鼠脑皮层神经元,随机分成正常对照组,缺氧复氧组和NADH组。用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡,计算凋亡率,检验各试验组细胞凋亡率的差异。用透射电镜观察凋亡细胞超微结构。结果正常对照组各阶段细胞凋亡率间差别无统计学意义(P0.05)。缺氧复氧组和NADH组凋亡率均较正常对照组调亡率大,差异有统计学意义(P0.01),缺氧复氧组较NADH组凋亡率大,差异有统计学意义(P0.01)。在复氧12 h内给予NADH,对于神经元凋亡抑制作用优于其余复氧时间点。结论缺氧复氧可诱发体外培养神经元发生凋亡,NADH对此有明显抑制作用。在复氧12 h内给予NADH对凋亡的抑制作用较明显。     

银杏内酯对缺氧诱导的大鼠皮层神经元早期凋亡的影响

目的：观察银杏内酯(ginkgolide,Gin)对缺氧诱导的大鼠皮层神经元凋亡的保护作用。方法：选用胎龄14～16d的SD胎鼠的大脑皮层细胞进行原代培养,建立缺氧神经元损伤模型。实验分为药物实验组(Gin组)、空白对照组、阳性对照组(MK-801),每组均进行有糖和无糖培养两种处理。应用MTT法分析细胞存活率、AnnexinV-PE双标流式细胞仪法定量分析细胞早期凋亡。结果：MTT结果显示,Gin使皮层神经元存活率明显增加,且有糖的缺氧组皮层神经元存活率优于无糖组;流式细胞仪测定结果显示,预先加入Gin(终浓度37．5μg／m1)的一组神经元的凋亡峰明显低于空白组,而无糖处理组凋亡峰均高于有糖处理组。结论：银杏内酯(37．5μg/ml)对缺氧损伤的皮层神经元具有保护作用,可拮抗缺氧条件下体外培养的皮层神经元的早期凋亡。     

蛋白激酶A在培养胎鼠皮层神经元缺氧凋亡中的作用

目的：探讨培养神经元缺氧后蛋白激酶A（PKA）活性变化及其与神经元凋亡的关系。方法：建立体外培养大鼠皮层神经元及培养神经元缺氧模型，用3种不同浓度的PKA抑制剂（Rp-cAMP）在不同的缺氧时相点观察神经元下述指标的改变神经元细胞和细胞质中PKA的活性，caspase-3(CPP32)和TUNEL表达（细胞凋亡）的规律。结果：随着缺氧时间的延长，培养神经元细胞膜PKA的活性显著增加，同时caspase-3和TUNEL荧光染色阳性率及平均荧光强度均显著升高，而应用Rp-cAMP后细胞凋亡，且该作用是通过caspase-3信号转导途径实现的；（3）PKA的激活在缺氧诱导的神经元凋亡中起促发作用。     

大鼠大脑中动脉供血区梗死后小脑皮质neurocan动态表达

目的观察大鼠大脑中动脉闭塞后小脑皮质neurocan的变化。方法采用Longa的大鼠大脑中动脉内栓线阻断法(MCAO)制备动物模型;用实时定量PCR法检测neurocan表达。结果本研究结果显示持续性大脑中动脉闭塞后,neurocan在小脑皮层有动态表达,第1d和3d较假手术组轻度增高(P0.05),7d、10d和14d较假手术组明显增高(P0.05)。结论大鼠大脑中动脉闭塞后,小脑皮质出现neurocan的动态表达,因此远离梗死灶的相关部位脑组织继发损害机制可能与神经抑制因子有关。     

基于核磁共振技术研究脑缺血再灌注大鼠脑皮质代谢物组水平变化的分子机制

目的 研究脑卒中大鼠脑皮质代谢物组水平与脑缺血再灌注时间的关系,探讨缺血再灌注损伤导致的脑皮质代谢紊乱的分子机制.方法 采用大脑中动脉闭塞法(MCAO)制备大鼠局灶性左脑缺血的脑卒中模型,运用基于核磁共振的代谢物组分析技术,研究MCAO大鼠脑缺血再灌注3、6、24 h时左脑皮质代谢物水平变化.结果 大鼠左脑皮质缺血再灌注3h时出现能量不足、糖酵解加剧、神经递质紊乱等代谢途径的改变,再灌注6h时因机体自身调节作用,上述现象均有所缓解;然而再灌注24 h时,能量代谢、无氧酵解、神经递质代谢紊乱等均加重.结论 再灌注不同时间点引起了不同程度的大脑皮质代谢紊乱,该结果将有助于探索脑缺血再灌注损伤的病理分子机制,可为临床上调控脑卒中发生后不同时间点的代谢紊乱提供理论基础.     

BrdU-labelled neurons regeneration after cerebral cortex injury in rats

Mechanical injuries to the external regions of the brain including the cerebral cortex and other parts of the telencephalon are common yet relatively untreatable. The predicament in recovery from brain injury is that the adult central nervous system is generally thought to be incapable of replacing dead neurons. As the subventricular zone （SVZ） is now known to be neurogenic and is in close proximity to the cerebral cortex and other functionally important forebrain areas, the neurogeny of SVZ brings hope to the repair of brain injury. Because of the high frequency of injuries to the cerebral cortex and its functional importance in humans, many laboratories have studied the results of unilateral aspiration or percussion injury of the cerebral cortex. However,     

三磷酸腺苷诱导体外培养的胚胎大鼠皮层神经细胞凋亡

目的：研究不同浓度三磷酸腺苷（ATP）溶液（0.1、10、100?mmol/L）对体外培养的胚胎大鼠皮层神经细胞的作用。方法：应用倒置显微镜和活细胞计数观察神经细胞死亡性质和细胞存活量;采用Neuron Specific Enolase (NSE) 和cleaved caspase 3免疫组织化学方法了解各实验组NSE阳性神经元的数量和凋亡特异蛋白caspase 3活化情况。结果：10?mmol/L及100?mmol/L ATP溶液作用细胞4?h,存活细胞数与NSE阳性神经元数量呈浓度依赖性减少,与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.01）。10?mmol/L ATP作用细胞4?h,活化的 caspase 3蛋白表达较对照组显著性增加（P＜0.05）。结论:ATP对体外培养的胚胎大鼠皮层神经细胞具有浓度依赖性的细胞毒性作用,细胞凋亡蛋白caspase 3活化机制参与该过程。     

全脑缺血再灌注后海马神经元凋亡及组织NO含量动态变化的研究

目的:观察全脑缺血15 m in后再灌注不同时间点海马神经元凋亡及海马组织NO含量的动态变化。方法:采用4血管闭塞法制备大鼠全脑缺血再灌注模型,采用DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测缺血15 m in后再灌注1 d、2 d、3 d、5 d、7 d时海马神经元凋亡情况;硝酸还原酶法检测各时间点海马组织中NO含量。结果:DNA琼脂糖凝胶电泳显示:在再灌注1 d时呈大致正常条带,2 d、3 d呈“梯状条带,”5和7 d出现了代表部分神经元坏死的涂抹状条带;流式细胞仪检测结果显示:在脑缺血再灌注1 d时,海马神经元凋亡率即明显增加,再灌注3 d时凋亡率达高峰,随后凋亡率逐渐下降,7 d时大致达正常水平;海马组织中NO含量于再灌注后2 d明显升高,3 d达峰值,以后逐渐下降,7 d降至接近对照组水平。结论:全脑缺血再灌注后海马神经元凋亡和NO含量均于再灌注3 d时达高峰,7 d大致恢复至正常水平,提示NO增多可能是诱导海马神经元凋亡的机制之一。     

缺氧缺血大鼠脑细胞凋亡的研究

目的探讨脑细胞凋亡在缺氧缺血脑病（ＨＩＥ）发病机理中的作用。方法用ＨＥ染色、电镜、原位末端标记（Ｔｕｎｅｌ）手段,分别对缺氧３小时后缺血１、４、１８、２４、４０及７２小时和７天组大鼠的脑组织中凋亡细胞的形态、出现时间及密度进行观察和比较。结果光、电镜下显示实验侧脑皮质、海马及丘脑神经元皱缩、染色质凝集并出现凋亡小体;Ｔｕｎｅｌ方法证实有裂解ＤＮＡ存在;缺氧缺血后１８小时皮质凋亡最明显。结论在ＨＩＥ大鼠,脑细胞凋亡出现不但早于坏死,而且与坏死存在着诱导剂量相关性     

食蟹猴脑缺血过程中皮层谷氨酸水平动态变化的研究

目的 探讨食蟹猴脑缺血过程中皮层细胞外谷氨酸水平动态变化.方法 取3只(7.3±1.5)岁的食蟹猴,将大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA) M1段近端夹闭1h后放开,建立食蟹猴脑缺血性模型,并通过磁共振成像检查(MRI)、神经功能缺损评分评价临床表现.在MCA M1夹闭前、夹闭过程中、夹闭放开后和术后第1、2周于手术同侧大脑皮层运动区同一部位,运用电化学微电极传感器技术检测该部位谷氨酸水平.结果 短期夹闭MCA M1段的食蟹猴大脑皮层运动区谷氨酸水平在MCA M1夹闭过程中较夹闭前上升(P =0.003);夹闭放开后较夹闭过程中的变化差异无统计学意义(P =0.877);术后第1周较夹闭放开后下降(P =0.004);术后第2周较术后第1周的变化差异无统计学意义(P =0.085).结论 脑缺血时可能加速皮层细胞外谷氨酸的释放,再灌注后谷氨酸的释放可能有所减弱或处于动态平衡.     

替勃龙对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡的影响

目的:研究雌激素对缺血性脑损害的神经保护作用是否与抗神经元凋亡有关。方法:30只雌性成年SD大鼠,随机分为假手术组(sham),手术对照组(OVX),替勃龙组\[0.25 mg/(kg·d)\];采用大鼠大脑中动脉闭塞制成局灶性脑缺血模型。在缺血2 h、再灌注24 h后立即断头取脑,应用2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC)染色观察脑梗死体积,TUNEL法检测凋亡细胞,链酶菌抗生物素蛋白过氧化物酶(SP)法检测抗凋亡基因Bcl-2、细胞凋亡诱导因子Bax和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶caspase-3的表达。结果:替勃龙用药组较手术对照组脑梗死体积显著缩小(P<0.05),TUNEL阳性细胞数减少(P<0.01),Bcl-2阳性细胞增多(P<0.01),Bax及caspase-3阳性细胞减少(P<0.01)。结论:替勃龙可抑制去卵巢大鼠局灶性脑缺血再灌注时神经细胞凋亡,具有神经保护作用。