乙肝病毒表面抗原G145R变异单克隆抗体的制备及其初步鉴定

目的:研制抗乙肝病毒G145R变异表面抗原的单克隆抗体(mAb).方法:将重组乙肝病毒G145R变异表面抗原以Al(OH)3佐剂化, 常规免疫BALB/c小鼠, 采用细胞融合技术制备抗乙肝病毒G145R变异表面抗原的mAb.采用ELISA对制备物的效价与特异性进行鉴定, 将其用于部分临床标本的检测, 并与德国抗HBs mAb GL2.001进行比较.结果:获得1株稳定分泌抗G145R HBs mAb的杂交瘤细胞, 命名为4-E12.该细胞株染色体数目为90条, 所分泌mAb属IgG1亚类.其培养上清与腹水抗G145R HBs ELISA效价为(0.5～1)×103及(1～10)×106.经持续3月培养, 低血清适应以及反复冻存与复苏后, 其细胞增殖能力与上清抗G145R HBs效价与克隆化结束时大致相似.将其与德国抗G145R HBs mAb GL2.001相比, 二者对重组乙肝表面抗原G145R变异S蛋白的反应性大致相当, 灵敏度前者稍低于后者(分别为2.0 μg/L与1.0 μg/L).对野生株表面抗原的检测前者在实验浓度范围内未显示有意义的反应信号, 后者在与高浓度(1 mg/L及以上)抗原反应时S/N值达到或高于3.9.将二者用于对一组特定患者的临床检测, 其阳性率前者(17/200, 8.5%)较后者(11.5%)略低, 其差别经统计学比较无统计学意义(P>0.05).结论:成功地制备了1株抗乙肝表面抗原G145R变异体的mAb, 为乙肝G145R变异的基础、 临床与流行病学研究提供了进一步的物质基础.     

一株识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的单克隆抗体的研制及其生物学功能研究

目的:以本科室发现肿瘤细胞上表达的CD40 787AA突变为基础,研制识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的单克隆抗体(mAb),并对其生物学特性作初步分析.方法:以转人CD40突变体转基因细胞L929-CD40mu为免疫原,免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞融合技术,将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0融合,以L929-CD40mu转基因细胞为抗体筛选阳性细胞,免疫荧光标记法对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养;采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析该mAb的亚类及抗原识别位点;免疫印迹法对该mAb进行鉴定;采用MTT法分析mAb在体外对肿瘤细胞的抑制增殖效应以及PI-annexin V方法进行细胞凋亡测定.结果:获得1株稳定分泌鼠抗人CD40mu mAb的杂交瘤细胞株(命名为10C5),该mAb能特异性地识别人肿瘤细胞株H08910表达的CD40突变体分子,而不识别正常扁桃体B淋巴细胞及血管内皮细胞表达的CD40分子,并且能够在体外促进肿瘤细胞凋亡.结论:成功地研制出1株特异性识别肿瘤细胞上CD40突变体分子的mAb,该mAb具有体外抑制肿瘤细胞生长并促进其凋亡的作用.     

血清标本中HBsAg免疫复合物对检测HBsAg的影响

０．５ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ处理１ｈ后解离ＨＢｓＡｇ－抗ＨＢｓ免疫复合物，并变性抗ＨＢｓＡｇ抗体而对ＨＢｓＡｇ免疫反应性无影响，３４例临床抗ＨＢｓ＾＋血清样品经ＨＣｌ处理前后，常规ＥＬＩＳＡ检测ＨＢｓＡｇ比较，结果；酸处理前ＨＢｓＡｇ阳性率为１１．７６％，处理后增加至４１．１８％，实验表明血清样品经酸处理后能明显提高临床乙肝ＨＢｓＡｇ检出率。     

抗二羰基/L-木酮糖还原酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗人二羰基/L-木酮糖还原酶(Dicarbon-yl/L-xylulosereductase,DCXR)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Westernblot及免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAPXR表达文库筛选鉴定抗原。结果获得1株可稳定分泌抗人DCXRmAb的杂交瘤细胞系。mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),该mAb可用于ELISA检测、Westernblot、免疫组化和免疫沉淀实验。结论成功制备了抗人DCXR的mAb,为DCXR的研究提供了有力的工具。     

ELISA差减分析——一种简便实用的免疫逃逸变异HBsAg检测新方法

目的:立足现有实验技术与试剂,建立一项血清免疫逃逸变异HBsAg检测的新方法。方法:以市售ELISA试剂筛选其检测信号在灰区范围的HBV感染者;采用2种不同免疫逃逸变异HBsAg检测能力的ELISA试剂对选留血清进行检测,以"ELISA差减分析"方式确认免疫逃逸变异HBsAg阳性者;以中和实验及雅培化学发光试剂验证检测结果的特异性;并对部分免疫逃逸变异HBsAg阳性者以PCR及直接测序做HBV DNA分析。结果:自10231例受检者中筛选HBsAgELISA检测信号灰区标本244例;复核检测显示G6ELISA、市售ELISA两者对野生HBsAg检测敏感性分别为0.0625ng/ml,与0.125ng/ml;检测阳性率分别为16.80%(G6ELISA)及5.73%(市售ELISA)。ELISA差减分析确定免疫逃逸变异HBsAg阳性者27例,阳性率为11.07%。对部分免疫逃逸变异HBsAg阳性血清做进一步考核,抗HBs中和强度为(84.07%±6.32%),中和率100%(13/13);雅培化学发光试剂复核阳性率为94.4%(17/18,阳性者中包括两份单项G6-ELISA检测最低阳性信号标本);HBV DNA阳性率36.9%(7/19),略低于同期HBsAg低信号阳性者(6/14,42.9%,P0.05);直接测序发现其中"a"区变异3例,分别为P142L、T126A及M133T/K160T;S蛋白亲水区非"a"决定簇变异1例,变异类型为L109Q。结论:ELISA差减分析法能有效地用于部分免疫逃逸变异HBsAg的临床诊断,其诊断能力视所依托试剂免疫逃逸变异检测能力不同而有显著差别。     

罗丹明B单克隆抗体的的制备及鉴定

目的制备抗罗丹明B[9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)]小鼠单克隆抗体(mAb),初步鉴定其特性,为罗丹明B快速检测方法的开发奠定基础。方法采用活性酯法使罗丹明B偶联于载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA),合成免疫抗原罗丹明B-BSA和检测抗原罗丹明B-OVA。将罗丹明B-BSA免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术获得杂交瘤细胞株17F2,并通过对添加回收率的测定初步建立了罗丹明B的快速检测方法。结果将该细胞株注射Balb/c小鼠制备腹水mAb,腹水纯化后效价为1∶1.28×105,属于IgG1型。罗丹明B mAb的灵敏度为0.05μg/L,IC50为0.42μg/L。mAb与丁基罗丹明B、异硫氰酸罗丹明B、罗丹明6G、5-羧基四甲基罗丹明、罗丹明110、丽丝胺罗丹明B、罗丹明123的交叉反应率均小于0.3%。辣椒油中罗丹明B的添加回收率在80.6%～104.4%之间,变异系数在16.0%～28.8%之间。结论制备出的罗丹明B mAb为研制罗丹明B的快速检测方法奠定了基础。     

抗创伤弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及特性鉴定

目的:制备高效、特异的抗创伤弧菌的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:用创伤弧菌菌体蛋白抗原免疫小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术,制备抗创伤弧菌的杂交瘤细胞株。用ELISA法及Western blot等筛选、鉴定其与创伤弧菌溶血素蛋白(vvhA)及其他重要海洋细菌的交叉反应性和效价。结果:共获得5株抗创伤弧菌的mAb,鉴定结果表明,5株mAb均具有良好的特异性和免疫反应性。结论:获得5株抗创伤弧菌的特异性mAb,为建立创伤弧菌快速检测试剂盒提供了重要制剂。     

抗丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗人丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(pyruvate dehydrogenase complex E2,PDC-E2)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Western blot及免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原.结果 获得1株可稳定分泌抗人PDC-E2 mAb 的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ), 该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化和免疫沉淀实验.结论 成功制备了抗人PDC-E2的mAb,为PDC-E2的研究提供了有力的工具.     

抗嗜水气单胞菌单克隆抗体的制备及初步鉴定

嗜水气单胞菌是养殖及野生鱼、虾、蛙、甲鱼等生物常见的细菌性病原体[1],可通过受伤的皮肤及伤口感染,并可通过食物链感染人,造成腹泻、败血症等疾病而严重威胁人类健康,是我国沿海地区人群中最常见的致病性弧菌之一[2].     

抗人LSECtin单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的:制备抗肝脏、淋巴结窦内皮细胞C型凝集素(LSECtin)单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:采用原核表达的LSECtin免疫BALB/c小鼠,以间接ELISA法筛选分泌特异性mAb的杂交瘤细胞,采用蛋白印迹、间接免疫荧光、流式细胞术和免疫组化染色法鉴定mAb的特异性。结果:共获得8株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。mAb的Ig亚类均为IgG,效价达1∶106~1∶107。这些mAb均可识别转染3T3细胞膜上的人LSECtin,6株mAb可特异识别肝脏窦内皮细胞。结论:成功地制备8株抗LSECtin的mAb,经免疫印迹、流式细胞术和免疫组化染色检测,这些mAb的特异性良好,为研究LSECtin的功能提供了有力的试剂。     

抗人白细胞介素15单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的 :制备鼠抗人白细胞介素 15(hIL 15)单克隆抗体 (mAb) ,并鉴定其特性。方法 :自重组人白细胞介素 15(rhIL 15)基因工程菌中 ,提取融合蛋白GST IL 15,以 12 0g/LSDS PAGE分离鉴定 ,切取含有目的条带的凝胶 ,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 / 0骨髓瘤细胞常规融合 ,依次进行HAT选择培养 ,间接ELISA法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞及克隆化。对杂交瘤细胞株的稳定性及其分泌的mAb的特性进行鉴定。另外 ,以rhIL 15包涵体蛋白 (rhIL 15IBP)免疫新西兰白兔 ,制备抗hIL 15的多克隆抗体 (多抗 )。用抗hIL 15的mAb与多抗建立双抗体夹心间接ELISA。结果 :获得 1株可稳定分泌特异性抗hIL 15mAb的杂交瘤细胞。建立了双抗体夹心间接ELISA ,检测rhIL 15蛋白的敏感性达 10 μg/L。结论 :成功地制备抗hIL 15mAb ,并建立了一种可用于hIL 15检测的双抗体夹心间接ELISA。