庆大霉素诱导LLC-PK1细胞凋亡与p27Kip1表达关系的研究

目的　观察庆大霉素对体外培养的肾小管上皮细胞凋亡的诱导作用 ;研究细胞周期调节蛋白 p2 7Kip1蛋白和mRNA表达在凋亡过程中的变化 ;并探讨细胞凋亡与p2 7Kip1之间的关系。方法　对体外培养的猪肾近端小管上皮细胞株 (LLC PK1细胞 )予以不同浓度的庆大霉素溶液分别作用 2 4～ 96h ,以MTT法测定庆大霉素对LLC PK1细胞增殖的抑制率 ,抽提细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡条带 ,流式细胞术测定细胞凋亡率和细胞增殖动力学 ,WesternBlot法检测细胞内p2 7Kip1的蛋白表达 ,RT PCR法检测细胞p2 7Kip1mRNA表达的变化。结果　庆大霉素对LLC PK1细胞增殖有抑制作用 ,具诱导LLC PK1细胞凋亡的作用 ,凋亡率呈药物浓度和作用时间依赖性 ;庆大霉素致细胞周期停滞于G1期。p2 7Kip1蛋白在细胞内的表达随着干预的庆大霉素浓度增加而逐渐上调 ,蛋白水平与凋亡率之间呈正相关 ,其mRNA表达趋势与其蛋白表达一致。结论　庆大霉素诱导的LLC PK1细胞凋亡与细胞周期蛋白p2 7Kip1表达密切相关。     

大黄酸抑制转化生长因子β1诱导的肾小管上皮细胞肥大及细胞外基质积聚

目的：观察大黄酸对TGFβ1诱导的肾近端小管上皮细胞肥大及细胞外基质的影响。方法：在体外以TGFβ1（2μg/L）刺激LLC－PK1细胞,诱导细胞肥大和细胞外基质合成的增加。同时,以不同浓度的大黄酸处理细胞,检测细胞体积、蛋白质含量以及[^3H]亮氨酸掺入以观察细胞肥大的变化。此外,检测细胞培养上清液中的纤维素增生（FN）含量。[^3H]脯氨酸掺入以及细胞胶原IV及FN mRNA的表达以观察大黄酸对细胞外基质的影响。结果：TGFβ1（2μg/L）刺激可以导致LLC－PK1细胞出现细胞肥大,表现为细胞体积、细胞内蛋白量及[^3H]亮氨酸掺入量明显增加,大黄酸治疗后细胞体积及细胞内蛋白量降低。TGFβ1也能明显增加LLC－PK1细胞[^3H]脯氨酸掺入量,培养上清液中FN含量,以及细胞内胶原IV和FN mRNA的表达。大黄酸则能抑制上述细胞外基质合成的影响,明显降低细胞内胶原IV和FN mRNA表达水平。结论：大黄酸可以逆转TGFβ1诱导的近端肾小管上皮细胞肥大,抑制TGFβ1刺激的细胞外基质合成,这可能是大黄酸预防或改善糖尿病肾脏病变、延缓糖尿病肾病进展的作用机制之一。     

庆大霉素致大鼠肾近端小管上皮细胞凋亡的超微结构研究

目的探讨庆大霉素对实验性大鼠肾近端小管上皮细胞凋亡的影响。方法通过给大鼠腹腔注射庆大霉素100mg／Kg／d,分别在连续用药第5天、8天、10天等不同天数处死大鼠,取肾脏制备超薄切片,在透射电镜下观察肾近端小管上皮细胞凋亡的情况。结果大鼠连续注射庆大霉素5天、8天、10天后肾近端小管上皮细胞均有凋亡的发生,注射庆大霉素10天的大鼠肾小管上皮细胞出现较多坏死。结论庆大霉素肾毒性作用部分是通过肾近端小管上皮细胞凋亡而实现的,细胞凋亡的发生与庆大霉素肾毒性作用强弱有关。     

多毛孢菌菌粉抑制庆大霉素诱导的猪肾小管上皮细胞凋亡及纤维化生长因子的表达

目的：研究人工培养的多毛孢菌菌粉水提物对庆大霉素诱导的近端肾小管上皮细胞损伤、凋亡的保护作用及对碱性纤维化生长因子(basic fibro-blast growth factor，bFGF)mRNA表达的影响。方法：将猪近端肾小管上皮细胞株(LLCPK)复苏培养，分成正常对照组、庆大霉素组和多毛孢菌组，除对照组外，用庆大霉素刺激，多毛孢菌组同时加多毛孢菌菌粉水提物干预。以MTT法观测存活细胞数；并测定细胞上清液N-乙酰-β-D-氨基糖苷酶(NAG)浓度；荧光标记细胞表面Annexin V，以细胞流式法测定其表达；RT-PCR检测细胞碱性纤维化生长因子mRNA的表达。结果与结论：庆大霉素可引起细胞存活率的显降低，N-乙酰-β-D-氨基糖苷酶浓度显增高；并提高细胞Annexin V的表达，即诱导白细胞调亡，和诱导LLCPK细胞bFGF mRNA的表达。多毛孢菌菌粉水提物能提高肾小管上皮细胞LLCPK存活率，降低细胞调亡数，并显抑制bFGF mRNA的表达。     

人肾小管上皮细胞及正常肝细胞在药物毒性器官选择中的应用

目的：探讨人肾小管上皮细胞（HK－2）及人正常肝细胞（L－02）在药物毒性器官选择中的应用。方法以肾毒性药物庆大霉素、顺铂、环孢素A及肝毒性药物硫唑嘌呤作用于HK－2及L－02细胞24 h,考察并比较药物对2种细胞的形态、存活、凋亡及酶学指标变化的影响。结果肾毒性药物在较低浓度下即可引起HK－2细胞的形态、存活、凋亡及酶学指标的显著性变化,肝毒性药物则在较低浓度下即可引起L－02细胞相关指标的显著性变化;比较4种药物的IC10值发现：3种肾毒性药物对HK－2的IC10值均小于对L－02的IC10值;而肝毒性药物硫唑嘌呤的IC10值则HK－2大于L－02。结论基于HK－2及L－02细胞评价药物的毒性器官选择性是可行性的。     

细胞色素C对庆大霉素致大鼠肾小管上皮细胞毒性的影响研究

目的:探讨细胞色素C对庆大霉素致大鼠肾小管上皮细胞毒性的影响及其可能的作用机制。方法:取大鼠随机分为溶媒对照组、庆大霉素组、庆大霉素+细胞色素C组,每组10只,前2组分别腹腔注射生理盐水和庆大霉素(100mg·kg-1·d-1),第3组先静脉注射细胞色素C100mg·kg-1·d-1,30min后腹腔注射庆大霉素100mg·kg-1·d-1。单剂量给药后24h处死大鼠,以荧光偏振免疫发光技术测定后2组大鼠肾脏中庆大霉素的含量,用TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡情况,用MIAS医学图像分析系统计算凋亡阳性细胞数密度,以苏木精-伊红染色法观察肾脏组织病理学变化。结果:与溶媒对照组比较,庆大霉素组肾小管上皮细胞凋亡的阳性细胞数密度明显增加(P<0.01);与庆大霉素组比较,庆大霉素+细胞色素C组肾脏中庆大霉素的含量降低了33.86%((335.16±99.18)μg·g-1vs.(221.67±71.12)μg·g-1),肾小管上皮细胞凋亡的阳性细胞数密度明显下降((637.78±169.64)n·mm-2vs.(404.75±135.57)n·mm-2,P<0.05),肾小管上皮细胞水肿、空泡变性、肾间质内炎细胞浸润、肾小球充血肿胀等均有所好转。结论:细胞色素C可能通过抑制庆大霉素在肾脏中蓄积来减轻其肾毒性。     

酸性成纤维细胞生长因子对庆大霉素诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用

目的研究酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对庆大霉素引起的体外培养的大鼠肾小管上皮细胞损害的保护作用。方法大鼠肾皮质经研磨、过网、胰蛋白酶消化,进行肾小管上皮细胞的体外培养。用庆大霉素建立损伤模型,观察aFGF对损伤的肾小管上皮细胞的保护作用。结果①经形态学观察、GM组与对照组比较,CAT、SOD、Na~+,K~+-ATP酶活性下降,而NAG活性和MDA升高(P<0.01),提示肾小管上皮细胞的培养和庆大霉素损伤的建模成功。②aFGF+GM组与GM组比较,各生化和酶学指标差异均有显著性(P<0.01);而aFGF+GM组与对照组比较,CAT、NAG、Na~+,K~+-ATP酶活性差异无显著性,但SOD活性下降、MDA升高差异仍有显著性(P<0.05)。结论aFGF对庆大霉素诱导的肾小管上皮细胞损伤有明显的保护作用。     

10-羟基喜树碱诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的探讨

目的：为筛选新的凋亡诱导剂，并对其机制进行研究。方法：用10－羟基喜树碱（10－hydroxycamp-tothecin,10-HCPT）以不同终浓度（0－150μm），不同作用时间（0－24h)诱导体外培养的SMMC－7721人肝癌细胞，按设计时间（24－140h）收集悬浮细胞，贴壁细胞和对照组进行各组间凋亡率，残存率、克服形成率观察。结果：当10－HCPT终浓度＞2．0μm时，部分细胞出现典型凋亡特征，随浓度及作用时间增加，凋亡率也随之升高，残存率下降，克隆形成率明显下，当10＝HCPT浓度＞50μm时，大量凋亡细胞中出现坏死，结论：10－HCPT能诱导SMMC－7721细胞凋亡，其效果与剂量和时间密切相关。     

阿魏酸钠和维拉帕米对庆大霉素肾毒性的保护作用

目的研究中药阿魏酸钠（ＳＦ）和维拉帕米（Ｖｅｒ）对庆大霉素（ＧＭ）肾毒性的保护作用。方法采用原代近端肾小管上皮细胞培养技术制作体外ＧＭ损伤模型，观察细胞丙氨酸氨基转移酶（ＡＬＴ）、过氧化氢酶（Ｃａｔ）、ＮＡＧ酶活性、ＤＮＡ合成，细胞内游离钙浓度以及形态学变化，同时观察ＳＦ、Ｖｅｒ的防治作用。结果ＧＭ组表现为ＡＬＴ、Ｃａｔ活性下降，ＮＡＧ活性增加。同时细胞ＤＮＡ合成下降，细胞内游离钙浓度升高。光镜发现近端小管上皮细胞有大量空泡和溶酶体髓样体形成。给予ＳＦ能使上述异常指标明显改善，组织学损害也明显减轻。Ｖｅｒ仅能保护ＡＬＴ活性和降低细胞内游离钙浓度。结论ＳＦ能有效保护ＧＭ对肾小管上皮细胞的损害。     

阿魏酸钠对培养近端肾小管细胞庆大霉素毒性保护机理探讨

目的 研究阿魏酸钠（SF）对庆大霉素（GM）肾毒性的保护作用。方法 采用近端肾小管上皮细胞原代培养技术制作GM损伤模型，观察细胞丙氨酸氯基转换酶（ALT）、过氧化氢酶（Cat)、NAG酶活性，DNA合成，细胞内离子钙浓度以及形态学变化，同时观察SF的保护作用。结果 GM组表现为ALT，Cat酶活性下降，NAG酶活性增加，细胞DNA合成下降，胞内游离钙浓度升高。光镜发现近端小管上皮细胞内有大量空泡变性和溶酶体髓样体形成。给予SE能使上述异常指标明显改善，组织学损害也明显减轻。结论 SF能有效保护GM对肾小管上皮细胞的损害。     

阿魏酸钠对培养近端肾小管细胞庆大霉素毒性保护机理探讨

目的 研究阿魏酸钠（ＳＦ）对庆大霉素（ＧＭ）肾毒性的保护作用。方法 采用近端肾小管上皮细胞原代培养技术制作ＧＭ损伤模型，观察细胞丙氨酸氨基转换酶（ＡＬＴ）、过氧化氢酶（Ｃａｔ）、ＮＡＧ酶活性，ＤＮＡ合成，细胞内离子钙浓度以及形态学变化，同时观察ＳＦ的保护作用。结果 ＧＭ组在现为ＡＬＴ，Ｃａｔ酶活性下降，ＮＡＧ酶活性增加，细胞ＤＮＡ合成下降，胞内游离钙浓度升高。光镜发现近端小管上皮细胞内有大量空泡变性和溶酶体髓样体形成。给予 ＳＦ能使上述异常指标明显改善，组织学损害也明显减轻。结论 ＳＦ能有效保护ＧＭ对肾小管上皮细胞的损害。     

基因芯片技术研究威替米星及庆大霉素对HK-2细胞毒作用的机制

目的:研究威替米星和庆大霉素对体外培养的人肾小管上皮细胞系(HK-2)毒性作用的分子机制。方法:利用基因芯片技术检测3.2 mg.mL-1威替米星和庆大霉素作用于HK-2细胞48 h后基因表达的变化。结果:威替米星诱导HK-2细胞87个基因发生显著的上调,10个基因发生明显的下调。庆大霉素则引起62个基因表达显著上调,18个基因明显下调。差异表达的基因的功能涉及细胞生长增殖调控、凋亡、细胞周期、应激反应、转运及代谢酶等方面。结论:威替米星和庆大霉素改变细胞凋亡、应激反应及转运等相关基因表达可能参与其细胞毒性作用过程。     

秋水仙碱对大鼠肾细胞NRK体外毒性机制初步探讨

目的:考察秋水仙碱体外肾毒性及其主要机制。方法:体外培养大鼠肾细胞NRK,通过MTT试验、细胞形态学改变、乳酸脱氢酶释放率、Hoechst/PI双染色法、流式细胞术考察秋水仙碱对大鼠肾细胞NRK是否具有毒性作用,进而阐明秋水仙碱肾毒性产生的可能机制。结果:秋水仙碱在0.1~10μmol/L浓度范围内,对NRK细胞的抑制率呈浓度依赖性。1μmol/L处理组细胞形态学发生明显改变,乳酸脱氢酶释放率随着给药浓度的增加也逐渐增加。Hoechst/PI双染荧光观察10μmol/L处理组细胞处于晚期凋亡及坏死状态,Annexin V-PI双染流式检测细胞凋亡率随着给药浓度的增加而升高。结论:秋水仙碱在0.1~10μmol/L的浓度范围内具有较强的体外肾毒性,其机制可能是秋水仙碱将细胞阻滞在G2/M期,影响细胞的分裂从而诱导细胞凋亡,对细胞产生毒性。     

2种静脉铁剂对肾小管上皮细胞及脐静脉内皮细胞的毒性作用

目的：接受血液透析治疗的终末期肾衰患者常接受多种静脉用铁剂，这些铁剂具有潜在的毒性，本实验比较了右旋糖酐铁及蔗糖铁对肾小管上皮细胞（HK-2）及脐静脉内皮细胞的细胞毒性。方法：使用不同剂量的静脉铁剂（0～1．2g·L^-1），分别加入体外培养的人肾小管上皮细胞及脐静脉内皮细胞，孵育0．5～72h。通过检测HDL释放率、MTT吸收率，观察两种铁荆对HK-2细胞及脐静脉内皮细胞的细胞毒性。结果：2种静脉铁剂均能引起细胞致死性损伤；蔗糖铁组的乳酸脱氧酶（LDH）释放率显著高于对照组及低分子右旋糖酐铁组，而低分子右旋糖酐铁组与对照组之间无明显差异。MTT法测细胞生长抑制率结果发现：两种铁剂刺激72h后活细胞数均下降，蔗糖铁组质量浓度不小于0．12g·L^-1时MTT吸收率显著下降，而低分子右旋糖酐铁组浓度为1．2g·L^-1时才出现显著下降。结论：蔗糖铁及低分子右旋糖酐铁均引起剂量依赖性细胞致死性损伤，不同的复合铁剂对肾小管上皮细胞及脐静脉内皮细胞发挥致死性作用的剂量不同，而蔗糖铁的细胞毒性大于低分子右旋糖酐铁。     

诱生型一氧化氮合酶抑制剂对TNF—α诱导的人成骨细胞凋亡的保护作用

目的：探讨TNF－α对体外培养人成骨细胞的凋亡影响及iNOS抑制剂对其保护作用。方法：对流产胎儿颅骨分离培养人成骨细胞后分3组：对照组：TNF－α组（不同浓度），TNF－α加L－NMMA组。通过细胞计数绘制生长曲线，流氏细胞仪检测，电镜下观察超微结构的变化，三项指标检测成骨细胞凋亡情况。结果：TNF－α可诱导成骨细胞凋亡，并呈时间剂量依赖性，iNOS抑制剂L－NMMA可有效抑制TNF－α对成骨细胞的损伤作用。结论：iNOS抑制剂对TNF－α诱导的成骨细胞凋亡具有一定的保护作用。     

镉通过氧化应激机制诱导LLC-PK1细胞损伤

目的：探讨镉诱导猪肾近曲小管上皮细胞（LLC-PK1）毒性及氧化应激在其中的作用。方法用不同浓度的氯化镉刺激细胞9h和25μmol/L的氯化镉刺激细胞不同时间,采用Formazan 分析细胞存活率反映镉对细胞的损伤程度;以还原型谷胱甘肽（GSH）为靶点,影响GSH浓度的两个试剂BSO和NAC,观察镉诱导细胞损伤中氧化应激的作用。结果随着氯化镉染毒时间延长,细胞存活率下降,同样,随着剂量的增加,细胞的存活率逐渐也下降。同时BSO加重镉诱导的细胞损伤,NAC完全抑制镉诱导的细胞损伤。结论氯化镉对LLC- PK1细胞具有明显的毒性,细胞损伤是通过氧化应激介导,且与细胞内的谷胱甘肽的水平有着密切关系。     

碱性成纤维细胞生长因子对庆大霉素肾损害保护作用的体外实验研究

目的　研究碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对庆大霉素引起的体外培养的大鼠肾小管上皮细胞损害的保护作用。方法　大鼠肾皮质经研磨、过网、胰蛋白酶消化,进行肾小管上皮细胞的体外培养。经Cytokeratin18抗体进行鉴定后,用庆大霉素建立损伤模型,观察bFGF对损伤的肾小管上皮细胞的保护作用。结果　①经形态学观察、Cytokeratin18免疫细胞化学方法鉴定;GM组与对照组比较,CAT、Na+,K+ ATP酶活性下降,而NAG活性和MDA升高 (P<0 01),提示肾小管上皮细胞的培养和庆大霉素损伤的建模成功。②bFGF+GM组与GM组比较,各生化和酶学指标差异均有显著性(P<0 01 );而bFGF+GM组与对照组比较,CAT、Na+,K+ ATP酶、NAG酶活性差异无显著性 (P>0. 05 ),但MDA增高差异仍有显著性(P<0 05)。结论　bFGF能保护损伤的肾小管上皮细胞。     

沉默调节蛋白1过表达通过抑制结缔组织生长因子改善转化生长因子-β_1诱导人肾小管上皮细胞株的凋亡

目的观察沉默调节蛋白1(Sirt1)过表达对转化生长因子(TGF)-β1诱导人肾小管上皮细胞凋亡的影响及其机制研究。方法将体外培养人肾小管上皮细胞分为正常对照组、TGF-β1刺激组及TGF-β1+Sirt1过表达组。采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡;流式细胞术及hoechst33258染色法分别检测细胞凋亡百分比;蛋白质印迹法检测Sirt1、结缔组织生长因子(CTGF)、Bax、Bcl-2的表达;实时荧光定量聚合酶链反应(Real time-PCR)检测Sirt1、CTGF、Bax、Bcl-2m RNA水平;活性比色法检测Sirt1活性;免疫细胞化学方法检测Sirt1表达。结果与正常对照组相比,TGF-β1刺激组肾小管上皮细胞Sirt1表达及活性均显著下降,同时CTGFm RNA及蛋白水平显著上升,细胞凋亡百分比明显增加(P<0.01),Bax/Bcl-2比率明显升高(P<0.05)。Sirt1过表达能够显著抑制TGF-β1诱导的CTGF水平升高,降低肾小管上皮细胞凋亡百分比,减少Bax/Bcl-2比率(P<0.05)。结论 Sirt1过表达能够抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞凋亡,并且该作用的实现可能是部分通过抑制CTGF实现的。     

解毒复肾逐淤方对TGF—β1诱导人肾小管上皮细胞纤维化的作用

目的探讨解毒复肾逐淤方对人肾小管上皮细胞纤维化的干预作用及可能的作用机制。方法建立转化生长因子β1（TGF—β1）诱导人肾小管上皮细胞纤维化模型,采用MTT、Western Blot和流式细胞检测方法,观察解毒复肾逐淤方对细胞增殖、细胞外基质的变化及结缔组织生长因子表达的影响。结果解毒复肾逐淤方能明显改善TGF—β1导致的人肾小管上皮细胞凋亡,减少细胞外基质的分泌,降低α平滑肌肌蛋白（α—SMA）阳性细胞数,抑制结缔组织生长因子（CT—GF）、纤连蛋白（FN）的表达。结论解毒复肾逐淤方能减轻肾间质纤维化的损伤,可能与调控TGF-β1-CTGF信号通路有关。     

SB203580对缺氧/复氧损伤诱导的大鼠肾小管上皮细胞凋亡的保护作用及其机制

目的研究SB203580(吡啶咪唑类抗炎药)对大鼠肾小管上皮细胞凋亡的保护作用及机制。方法SD大鼠肾小管上皮细胞原代培养,取第2代细胞实验;共分为3组:对照组,正常培养细胞;模型组,细胞缺氧1 h后,复氧6、12、24、48 h培养;SB203580预处理组,在缺氧损伤前1 h,用不同剂量SB203580(0.2、2、20μmol·L~(-1))预处理细胞,尔后进行缺氧/复氧损伤处理,各细胞用Hoechst 33258、Tunnel染色、流式细胞仪及Western blot方法,观察缺氧/复氧后细胞凋亡及p38MAPK的磷酸化水平。结果与对照组相比,缺氧/复氧后,实验组细胞的凋亡率显著增加,且细胞内p38MAPK磷酸化水平明显升高;而应用SB203580预处理细胞,可显著降低实验组细胞的凋亡率及细胞内p38MAPK的磷酸化水平。结论SB203580通过抑制p38MAPK的活性,对缺氧/复氧诱导的肾小管上皮细胞凋亡有保护作用。