Fas诱导MML-1凋亡时活化caspase-3表达与细胞周期的关系

目的研究Fas诱导的B淋巴细胞瘤细胞株MML-1凋亡过程中,细胞内活化caspase-3表达与细胞周期的关系。方法抗Fas抗体孵育MML-1不同时间以诱导细胞凋亡,流式细胞仪检测凋亡率并验证MML-1对Fas诱导凋亡的敏感性。采用PI—Triton X和FITC—active caspase-3双染色分析经Fas诱导凋亡的MML—1内活化caspase-3的表达。以细胞周期蛋白cyclin A、B1、E标记Fas诱导凋亡的处于不同增殖周期MML-1（S、G2／M和G1期细胞）,流式细胞术检测细胞内活化caspase-3的表达。结果Fas诱导6h后,MML-1凋亡率达到56％。Fas诱导4h后,活化caspase-3在G1期细胞内表达显著升高,仅有少量S期和G,／M期细胞表达活化caspase-3。Cyclin A、B1阴性而cyclinE阳性MML-1表达活化caspase-3。结论Fas诱导MML-1凋亡过程中,细胞内活化caspase-3的表达与细胞周期有关。G1后期和S早期的MML-1最先表达活化caspase-3,且对Fas诱导凋亡的敏感性最高。     

MML-1细胞G《,1》期阻断对Fas诱导细胞凋亡的抑制作用

目的 分析Fas诱导的B淋巴瘤细胞株MML-1凋亡过程中,PMA阻断MML-1进入细胞周期后细胞凋亡敏感性降低的原因.方法 采用10 nmol/L PMA预处理MML-1细胞24 h,用流式细胞仪检测PMA阻断细胞周期前后50 ng/mL抗Fas抗体诱导的MML-1细胞凋亡率的变化.采用PI-Triton X和active caspase-3/8双染色、Western blotting技术分析PMA处理前后,经抗Fas抗体诱导的MML-1细胞内活化caspase-3/8的表达.通过Western blotting技术检测G1期细胞的凋亡相关蛋白caspase-3/8、Bcl-2、FLIP和Akt的表达.结果 PMA预处理MML-1细胞24 h后,G1期细胞比例显著升高,达93.77%.PMA预处理前,抗Fas抗体诱导6 h后的MML-1细胞凋亡率为56%;经PMA预处理,抗Fas抗体诱导6 h后的MML-1细胞凋亡率为14%.流式细胞术和Western blotting检测发现经PMA预处理,抗Fas抗体诱导后活化caspase-3和caspase-8蛋白的表达受到显著抑制.Westernblotting检测显示G1期细胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达上调.结论 将MML-1细胞阻断在G1期能够抑制Fas诱导的细胞凋亡,可能与凋亡抑制分子Bcl-2在G1期的表达上调有关.     

MML-1细胞G_1期阻断对Fas诱导细胞凋亡的抑制作用

目的分析Fas诱导的B淋巴瘤细胞株MML-1凋亡过程中,PMA阻断MML-1进入细胞周期后细胞凋亡敏感性降低的原因。方法采用10 nmol/L PMA预处理MML-1细胞24 h,用流式细胞仪检测PMA阻断细胞周期前后50 ng/mL抗Fas抗体诱导的MML-1细胞凋亡率的变化。采用PI-Triton X和active caspase-3/8双染色、Western blotting技术分析PMA处理前后,经抗Fas抗体诱导的MML-1细胞内活化caspase-3/8的表达。通过Western blotting技术检测G1期细胞的凋亡相关蛋白caspase-3/8、Bcl-2、FLIP和Akt的表达。结果 PMA预处理MML-1细胞24 h后,G1期细胞比例显著升高,达93.77%。PMA预处理前,抗Fas抗体诱导6 h后的MML-1细胞凋亡率为56%;经PMA预处理,抗Fas抗体诱导6 h后的MML-1细胞凋亡率为14%。流式细胞术和Western blotting检测发现经PMA预处理,抗Fas抗体诱导后活化caspase-3和caspase-8蛋白的表达受到显著抑制。Westernblotting检测显示...     

甘草次酸对K562细胞增殖抑制作用及其机制研究

目的 研究甘草次酸对髓系白血病细胞系K562体外增殖抑制作用,分析其引起细胞周期的变化及探讨其可能的抗癌机制.方法 MTT法检测甘草次酸对K562细胞增殖活性的影响;Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡形态学改变;流式细胞术分析细胞周期的变化以及cyclin D1和cyclin E蛋白表达的变化;RT-PCR测定细胞中cyclin D1和cyclin E mRNA表达的改变.结果 甘草次酸对K562有增殖抑制作用,其抑制作用呈现为量效和时效依赖性,作用48 h的IC50值为(93.1±3.7)μmol/L.甘草次酸可以诱导细胞发生凋亡,Hoechst染色可见细胞核内凋亡小体.甘草次酸可以诱导K562细胞周期阻滞于G0/G1期,同时G2/M期细胞比例减小,S期变化不明显,仅在最大浓度组稍有降低.甘草次酸可以同时下调K562细胞内cylin D1和cyclin E蛋白和基因的表达,下调作用与剂量呈正相关.结论 甘草次酸能明显抑制K562细胞增殖,并诱导其周期阻滞于G0/G1期.该效应可能与其下调周期蛋白cyclin D1和cyclin E表达有关,有望成为新型抗肿瘤中药.     

Cyclin B1的启动子在HeLa细胞cyclin B1蛋白调控中的作用

目的 通过检测细胞周期素B1(cyelin B1)的启动子在HeLa细胞的不同细胞周期的活性变化,探讨其对cyclin B1蛋白的调味控作用.方法 采用PCR法获得HeLa细胞cyclin B1的启动子,通过基因重组插人pGL3 promoter vector 从而获得质粒pGL3/cyelin B1 promoter.采用羟基脲(hydroxyurea,HU)对HeLa细胞进行细胞周期G_1、S、G_2/M期的同步化,通过流式细胞术法确认.用短暂转染的方法,将重组的质粒转染至HeLa细胞.通过双萤光素酶活性检测分析cyelin B1的启动子在HeLa细胞周期G_1、S、G_2/M期的活性的变化.结果 双荧光素酶活性检测cyelin B1的启动子活性在G_1期最高,S期最低,G_2期中等.结论 在HeLa细胞巾cyclin B1的启动子活性和cyclin B1蛋的的表达并不同步.     

奥沙利铂抗人肝癌细胞株QGY增殖及其机制的研究

目的观察抗肿瘤药物奥沙利铂对人肝癌细胞株QGY体外增殖的影响并探讨其机制,为其能否应用于肝癌的临床治疗提供理论依据.方法采用人肝癌细胞株QGY作为研究对象,MTT法检测不同浓度和作用时间的奥沙利铂对细胞增殖的抑制效应;光镜及透射电镜观察细胞形态和超微结构的改变;流式细胞仪分析细胞周期的分布及凋亡;免疫细胞化学法检测细胞周期蛋白及凋亡相关基因蛋白的表达.结果奥沙利铂对QGY细胞的增殖均有抑制作用而且呈时间和剂量依赖性.光镜观察发现细胞体积缩小,变圆,胞浆浓缩,核固缩深染,呈现凋亡早期的形态学改变.电镜可见凋亡细胞及凋亡小体.流式细胞仪检测到细胞阻滞于细胞周期的S期和G2/M期,G0/G1期细胞减少及凋亡峰.奥沙利铂作用72 h后,免疫细胞化学表明cyclin A、Bax表达增强,突变型P53蛋白(MTP53)、Bcl-2、Myc表达减弱,Fas表达无差异.结论奥沙利铂对QGY肝癌细胞的增殖都有一定的抑制作用,阻滞细胞周期于S期及G2/M期,它通过上调Bax的表达,下调MTP53、Bcl-2、Myc的表达而诱导细胞凋亡,该药可能不是通过Fas途径诱导细胞凋亡.     

白藜芦醇诱导肺癌细胞凋亡和细胞周期阻滞的分子机制

目的探讨白藜芦醇对肺癌细胞系A549和H1299细胞增殖与细胞周期阻滞及细胞凋亡之间的联系。方法采用MTT法检测白藜芦醇对A549和H1299细胞增殖的影响;用Western印迹法检测白藜芦醇作用后A549和H1299中凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-7、cleaved-caspase-9、cleaved-PARP及细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin D3和CDK2、CDK4、CDK6、p53、p18、p21、p27的表达情况;通过流式细胞仪技术检测白藜芦醇诱导A549和H1299细胞凋亡率以及细胞周期阻滞的影响。结果白藜芦醇对A549和H1299的生长均有抑制作用,呈浓度依赖性;经白藜芦醇处理后,A549和H1299的周期蛋白cyclin D1、cyclin D3和CDK2蛋白的表达水平上调,而周期蛋白CDK4、CDK6、p53、p18、p21、p27的表达水平下调;A549和H1299的凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-7、cleaved-caspase-9、cleaved-PARP的表达水平上调;流式细胞仪检测A549和H1299的细胞凋亡率随白藜芦醇的浓度上升而增加,流式细胞仪检测细胞周期即可观察到随白藜芦醇的浓度的增加,细胞周期明显阻滞于G1/S期。结论白藜芦醇可能是通过促进caspases通路的活化,从而促进细胞凋亡;周期蛋白cyclin D1、cyclin D3和CDK2蛋白的表达水平的上调和CDK4、CDK6、p53、p18、p21、p27的表达水平的下调可能是白藜芦醇诱导人肺癌细胞发生G1/S期阻滞的关键机制。     

白桦脂酸对人Raji淋巴瘤细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的 研究D类细胞周期蛋白(cyclin D3)在Burkitt淋巴瘤细胞Raji中的表达及白桦脂酸对其的影响.方法 MTT法检测细胞增殖活性,Annexin-V/PI双标法检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期分布,RT-PCR法分析白桦脂酸作用于Raji细胞后cyclin D3 mRNA表达的变化,Western blotting法检测细胞内cyclin D3的蛋白表达.结果 白桦脂酸对Raji细胞有明显的增殖抑制作用,Annxin-V/PI双标法显示,白桦脂酸诱导细胞凋亡呈剂量依赖性.随着白桦脂酸剂量的加大,凋亡率增高.白桦脂酸作用Raji细胞后主要使细胞周期阻滞于G0/G1期,G0/G1期细胞比例随白桦脂酸剂量增大而逐渐增高,而S期细胞比例随白桦脂酸剂量增大而逐渐降低,对G2/M期细胞作用不明显.RT-PCR结果显示白桦脂酸作用于Raji细胞使cyclin D3 mRNA表达减少,并与其剂量呈正相关.Western blotting结果显示白桦脂酸使cyclin D3蛋白表达降低,呈剂量依赖性.结论 白桦脂酸抑制Raji细胞增殖并诱导细胞凋亡,可使细胞阻滞于G0/G1期,其可通过下调cyclin D3表达而发挥抗肿瘤作用.     

昆明山海棠总生物碱对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究昆明山海棠总生物碱(total alkaloids of tripterygium hypoglaucum hutch,THHta)对人结肠癌HCT116细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用MTT法检测THHta对HCT116细胞增殖的抑制作用;用倒置及荧光显微镜观察THHta作用后HCT116细胞形态的变化;流式细胞术检测THHta对HCT116细胞周期及凋亡的影响,Western bolt检测凋亡相关caspase-3及PARP蛋白表达.结果 THHLa能显著抑制HCT116细胞增殖,抑制率与剂量和时间呈依赖关系.THHta作用HCT116细胞48、72 h的IC_(50)值小于20 μg/ml.THHta(10μg/ml)能诱导HCT116细胞G_0/G_1期比例增加及细胞凋亡,caspase-3活化及PARP蛋白剪切显著增强.结论 THHta能显著抑制HCT116细胞增殖,并可诱导HCT116细胞G_0/G_1期阻滞及细胞凋亡.     

体外人巨细胞病毒感染细胞细胞周期素表达改变与细胞病变的关系

目的探讨人巨细胞病毒( human cytomegalovirus, HCMV)感染的人胚肺成纤维上皮细胞( human embryo lung fibroblast, HEL)细胞周期素 E (cyclin E)、 D (cyclin D)、 A (cyclin A)、 B (cyclin B)表达的改变与细胞病变的关系.方法建立体外 HCMV感染细胞膜型,观察感染细胞感染 12、 48h后细胞病变( cytopathologic effects, CPE);并在相同时间点收获细胞,用乙醇固定 HCMV感染的宿主细胞后用 PI染色,经流式细胞术( FACSVantage)根据细胞 DNA倍性分选出 G1、 S、 G2/M期细胞,然后分别取等量细胞裂解, 用 Western blot分析上面各不同时相细胞中 cyclins的表达.结果 ①培养 12h,仅病毒感染组在电镜可观察到细胞肿胀,其余各组未见明显病变;②培养 48h,与 HCMV169感染组相比,药物干预 HCMV169感染 HEL两组细胞中,光镜及电镜 CPE程度较轻,正常组细胞无 CPE;③乙醇固定细胞经流式细胞术分选,感染 12、 48h细胞均以 G1为主,少见 S期细胞、未见 G2期和 M期的细胞,与正常对照组比较有显著差异( P< 0.05);根据细胞 DNA倍性分选出的各期细胞裂解行 Western blot检测,正常细胞未检测到 cyclins,感染细胞中 cyclin E、 cyclin D有明显表达,未见 cyclin A、 cyclin B的表达.④ Western blot对分选后的感染细胞中 cyclin E、 cyclin D表达的检测与流式细胞术分析的结果一致.结论体外 HCMV感染细胞细胞周期进程受阻与细胞病变关系密切,细胞周期进程异常可能是导致细胞病变的病理学基础.     

人肝细胞生长因子基因表达对CCl4损伤的人肝细胞及大鼠肝星状细胞株的影响及其机制

目的：探讨人肝细胞生长因子(hHGF) 基因的表达对CCl4损伤的人肝细胞及大鼠肝星状细胞株（CFSC-2G）生物学效应的影响及其对CCl4损伤的人正常肝细胞株（HL-7702）的保护作用,进一步探讨凋亡产生的机制。方法：将获得的稳定转染HL-7702细胞克隆,分为4组,Ⅰ组为转染PCI-neo-hHGF实验组,Ⅱ组为转染PCI-neo空载体对照组,Ⅲ组为仅加入脂质体的对照组,Ⅳ组为空白对照组。采用MTT法测定细胞增殖活性。采用Western blotting测定转染PCI-neo-hHGF的HL-7702细胞和CFSC-2G细胞中hHGF、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白质的表达。结果：HL-7702细胞转染PCI-neo-HGF并培养48 h后,细胞的增殖活性明显高于PCI-neo空载体对照组、脂质体转染对照组和空白对照组HL-7702细胞（P<0.01）,而且随着转染PCI-neo-HGF剂量增加,细胞的增殖活性有一定的增长趋势,但各组间比较差异无显著性（P>0.05）;PCI-neo-HGF转染的HL-7702细胞caspase-3蛋白质表达量较CCl4损伤的HL-7702细胞和PCI-neo转染的HL-7702细胞明显降低,未检测到caspase-8和caspase-9蛋白质的表达;PCI-neo-HGF转染的CFSC-2G细胞caspase-3蛋白质表达量较CCl4诱导的CFSC-2G增加,caspase-9蛋白质表达也呈阳性。结论：PCI-neo-HGF可促进体外培养的HL-7702细胞的生长增殖,能够抑制CCl4损伤的HL-7702细胞的凋亡,促进大鼠CFSC-2G细胞的凋亡,其作用机制可能与上调caspase-3和caspase-9蛋白质表达有关。     

Neurocyte Apoptosis and Expressions of Caspase-3 and Fas after Spinal Cord Injury and Their Implication in Rats

Spinal cord injury (SCI) is a serious injury com-monly seen in surgical patients, for which there is no established treatment available at present. After spinal injury, neurocytes and tissues undergo necrosis and apoptosis. Apoptosis is a complex pathophysilogical process, mainly involving protease cascade mediated by the members of caspase family, among which caspase-3 plays a key role. Caspase-3 (CPP32) belongs to the cystine-aspartic proteinase family and plays the central role in the exe…     

熊果酸抑制胃癌细胞BGC-823增殖并诱导凋亡

目的:探讨熊果酸对人胃癌细胞BGC823的增殖抑制和诱导凋亡作用及其机制。方法:运用MTT法检测细胞的增殖;Hoechest33258荧光染色观察DNA片段化;流式细胞术分析细胞周期和凋亡率;Westernblot检测BGC823细胞内细胞色素C(cytochromeC,cytC)、survivin、caspase3的表达。结果:熊果酸对BGC823细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用,并呈浓度和时间依赖性,作用24h的IC50为43.10μmol·L-1;在熊果酸作用下BGC823细胞呈凋亡征象;G1期细胞数减少,细胞主要阻滞在S期;同时cytC释放和caspase3酶原活化增加,survivin表达降低。结论:熊果酸能够在体外抑制人胃癌细胞BGC823增殖并诱导其凋亡,而促进cytC释放增加,下调survivin表达,继而引起caspase3的活化可能是其作用机制之一。     

顺铂致豚鼠耳毒性作用中细胞凋亡及caspase-3表达的研究

目的：通过顺铂（CDDP）致豚鼠耳毒性作用中细胞凋亡及caspase-3表达的观察,探讨CDDP致耳毒性的作用机制。方法：实验组和对照组豚鼠各10只,前者以CDDP 2.0 mg/（kg.d）连续腹腔注射6 d,后者以等量生理盐水替代。通过ABR测试用药前后豚鼠听力的变化,应用TUNEL法检测耳蜗凋亡细胞,免疫组化法检测caspase-3在耳蜗中的表达。结果：实验组耳蜗凋亡细胞明显增多,caspase-3的表达亦明显增强。结论：caspase-3介导的信号传导机制,可能参与了CDDP所致的耳蜗细胞凋亡过程,导致耳毒性的发生。     

曲古抑菌素A对人胃癌细胞SGC-7901生长及bcl-2、caspase-3mRNA表达的影响

目的研究曲古抑菌素A（TSA）对人胃癌细胞的增殖、凋亡及bcl-2、caspase-3 mRNA表达的影响及其意义。方法体外培养人胃癌细胞株SGC-7901,MTT法检测不同浓度TSA作用不同时间后细胞的增殖情况;流式细胞术检测不同浓度TSA作用48 h后的细胞凋亡情况;RT-PCR检测胃癌细胞中bcl-2、caspase-3 mRNA表达情况。结果不同浓度TSA作用不同时间后,随着时间延长及浓度增高,细胞的增殖抑制明显,呈现明显时间-效应关系及剂量效应关系;与阴性对照组比较,随着TSA浓度的增加,胃癌细胞SGC-7901的早期凋亡率逐渐增高,差异有统计学意义（P〈0.05）;与阴性对照组比较,胃癌细胞中bcl-2 mRNA随TSA浓度的增高,表达逐渐下调,而caaspase-3mRNA随TSA浓度的增高表达逐渐上调,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 TSA对人胃癌细胞SGC-7901具有明显生长抑制作用,呈时间与剂量依赖性;能诱导人胃癌细胞SGC-7901发生早期凋亡能诱导胃癌细胞株SGC-7901细胞发生早期凋亡;TSA抑制人胃癌细胞SGC-7901增殖与诱导凋亡作用可能与bcl-2 mRNA表达下调、caspase-3mRNA表达上调有关。     

平阳霉素对大鼠脾脏组织的作用及其机制

目的:以大鼠脾脏为模型,探讨平阳霉素治疗海绵状血管瘤的机制.方法:观察平阳霉素注射于大鼠脾脏后不同时段的病理变化,采用末端转移酶介导的缺口末端标记法结合透射电镜检测凋亡,图像分析技术选择性地比较不同作用时段的凋亡率,免疫组化结合图像分析仪定量分析凋亡相关蛋白Caspase-3的变化.结果:注射生理盐水不引起大鼠脾脏结构破坏.注射平阳霉素后第2天、第5天脾脏仅有轻微肿胀;第8天、第14天呈萎缩改变,脾窦内皮细胞受损伤;注射平阳霉素后不同时间电镜检查均可见到凋亡细胞;TUNEL标记结果显示凋亡广泛发生于脾窦内皮细胞及其他脾细胞;注射后一定时间内,凋亡率随作用时间延长而增加;Caspase-3蛋白表达逐渐增强,与细胞凋亡的增加一致.结论:平阳霉素主要通过诱导脾窦内皮细胞凋亡为主,并导致一定程度的坏死,少量的成纤维细胞增生等.其发生机制是通过Caspase-3活化途径来诱导细胞凋亡.     

黄芩素对人子宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用

目的:探讨黄芩素对人子宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用及可能机制。方法:采用磺酰罗丹明B(SRB)法检测黄芩素对HeLa细胞生长的抑制作用;Hoechst 33258荧光染色法观察黄芩素对HeLa细胞凋亡的诱导作用;比色法测定黄芩素对HeLa细胞内caspase-3活性的影响。结果:不同浓度黄芩素作用24、36、48h后均可抑制HeLa细胞生长(P<0.05~P<0.01);黄芩素作用24h后,HeLa细胞凋亡率增加(P<0.01),细胞内caspase-3活性增强(P<0.05~P<0.01)。结论:黄芩素能抑制HeLa细胞生长,其机制可能与诱导细胞凋亡及增强caspase-3活性有关。     

毒胡萝卜素对小鼠肺成纤维细胞内钙离子水平及caspase-3蛋白表达的影响

目的 探讨钙泵抑制剂毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)对体外小鼠肺成纤维细胞内钙离子（Ca2+）水平及凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）表达的影响。方法 小鼠肺成纤维细胞(L929)分为3组:空白对照组(不做处理)、转化生长因子β₁（TGF-β₁）组、TG组,后两组均用5 ng/mL TGF-β₁诱导24 h,TG组在诱导后再用4 μmol/L TG作用24 h。细胞处理48 h后,分别收集各组细胞,采用透射电子显微镜观察细胞超微结构变化,激光共聚焦显微镜观察各组细胞内Ca2+水平,免疫细胞化学方法检测caspase-3蛋白表达。结果 透射电子显微镜示,空白对照组细胞凋亡较少,TGF-β₁组无明显凋亡细胞,TG组有大量成纤维细胞凋亡。TGF-β₁组Ca2+水平和caspase-3蛋白水平均低于空白对照组（P<0.05）,TG组细胞内Ca2+水平和caspase-3蛋白水平均较TGF-β₁组、空白对照组升高（P<0.05）。结论 TG可使小鼠肺成纤维细胞细胞内钙稳态失衡,增加caspase-3蛋白表达,促进细胞凋亡。