人分泌型肿瘤坏死因子相关激活诱导因子基因的克隆及测序

目的 克隆人分泌型肿瘤坏殛因子相关激活诱导因子（ｓＴＲＡＮＣＥ）的编码区ｃＤＮＡ片段。方法 从人淋巴结组织提取总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增人ｓＴＲＡＮＣＥ基因编码区序列,将其克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载体中,并行序列测定。结果 克隆获得的７４４ｂｐ片段与文献报道的人ｓＴＲＡＮＣＥ基因编码区ｃＤＮＡ序列一致。结论 本研究为进一步研究ｓＴＲＡＮＣＥ的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性打下了基础。     

人类抗砷相关基因（hARRG）的克隆和表达

克隆并表达人类抗砷基因ｈｕｍａｎ ａｒｓｅｎｉｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ（ｈＡＲＲＧ）。方法。从人胎脑中获得ｍＲＮＡ,建立ｃＤＮＡ文库,通过大规模测序克隆出一人类新基因。结果：该基因全长１１７０ｂｐ,读框为（ＯＲＦ）７２３ｂｐ,经序列分析,与中国仓鼠抗砷基因ａｒｓｅｎｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ（ａｓｒ２）同源性达８８％。根据ＯＲＦ上物,ＰＣＲ扩增,扩增产物酶切后     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的克隆、表达及重新折叠

目的 :人的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TNF relatedapoptosisinducingligand ,TRAIL)基因经扩增后 ,克隆在大肠杆菌中表达并重新折叠并获得有活性的TRAIL蛋白。方法 :用PCR的方法从人胎盘cDNA文库中扩增TRAIL基因 ,经序列分析鉴定 ,再克隆到原核表达载体 pET11a ,经E .coliBL2 1(DE3)表达 ,电泳鉴定后 ,柱层析纯化 ,重新折叠 ,流式细胞术等方法检测其促凋亡活性。结果 :得到了TRAIL基因 ,并构建了可在大肠杆菌中表达的载体 pET11 TRAIL1(含TRAILcDNA序列 418 933)及可在真核细胞中表达的载体pLNCX TRAIL2 (含TRAILcDNA序列 88 933)。取前者在E .coliBL2 1(DE3)中表达 ,经纯化 ,重新折叠得到了复性的TRAIL蛋白。检测其对人白血病细胞株Jurkat有诱导凋亡的作用。结论 :从人胎盘cDNA文库中扩增TRAIL基因 ,在大肠杆菌中表达、重新折叠、纯化后 ,经检测得到了有活性的TRAIL蛋白     

人甲胎蛋白基因转录调控元件的改造

目的 为构建高效利用甲胎蛋白（ＡＦＰ）基因转录调控元件（ＴＲＥｓ）,驱动治疗基因在肝癌细胞中特异性表达的基因治疗载体,对天然人ＡＦＰＴＲＥｓ进行改建和鉴定。方法 采用亚克隆技术,删除了天然人ＡＦＰＴＲＥｓ中含有沉默子活性的－０．８７－－３．０６ｋｂ区域,将具有增强子活性的－３．０６－－５．１ｋｂ片段和调控ＡＦＰ基因表达的启动子“核心”区域＋２９－８７０ｂｐ片段连接,获得经人工改造后的基因转录调控元     

人端粒重复序列结合因子1^33—277在大肠杆菌中的？…

目的：建立能高效表达人端粒重复序列结合因子１第＾３３－２７７位（ＴＲＦ１＾３３－２７７）氨基酸的菌株并制备多抗。方法：设计一对引物,分别带有Ｋｐｎ Ｉ和ＥｃｏＲＩ位点,从已经克隆了ＴＲＦ１ｃＤＮＡ全长的重组质粒ｐＣＲⅡ－ＴＯＰＯ－ＴＲＦ１扩增ＴＲＦ１＾３３－２７７ｃＤＮＡ片段,克隆入ＰＧＥＭ－Ｔ质粒,测序和酶切图谱鉴定,ＥｃｏＲＩ酶切后亚克隆入ｐＧＥＸ－３Ｘ的ＥｃｏＲＩ位点之间,筛选在向插入重组子     

人肝脏再生增强因子cDNA的克隆、表达及纯化

克隆人肝脏再生增强因子（ｈＡＬＲ）ｃＤＲＮＡ,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法：提取胎儿肝组织总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ｈＡＬＲｃＤＮＡ,克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,酶切鉴定后亚克隆至表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３,测序证实序列正确并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白ＧＳＴ－ｈＡＬＲ,表达物通过谷胱甘肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化后进行Ｔｈｒｏｍｂｉｎ酶切,     

重组人单链白细胞介素12融合基因（rhscIL—12）的构建和真？…

目的 克隆人ＩＬ－１２（ｈＩＬ－１２）ｐ４０和ｐ３５亚单位ｃＤＮＡ，构建人单链ＩＬ－２（ｒｈｓｃＩＬ－２）融合基因，并在哺乳动物细胞中进行表达。方法从经ＰＤＢｕ刺激的ＥＢＶ转化的人Ｂ淋巴细胞株ＮＣ３７中提取ｍＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ分别获得ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位编码序列的ｃＤＮＡ，运用重组ＰＣＲ技术将两段基因通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＤＮＡ序列进行体外基因重组，构建ｒｈｓｃＩ     

人脑胶质细胞来源神经营养因子基因的克隆及测序

为研究人脑胶质细胞来源的神经营养因子（ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ, ＧＤＮＦ） 在神经系统疾病中的作用,根据ＧＤＮＦ 的ｃＤＮＡ 序列设计并合成引物,以流产胎儿脑组织为来源,分别提取ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 作模板,经ＲＴ ＰＣＲ 和ＰＣＲ 技术扩增人ＧＤＮＦ 基因片段,采用ＤＮＡ 重组技术将其克隆于ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ 载体中并测序。结果：ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 体外扩增得到的片段均是４１０ ｂｐ ,两者无差异。ＰＧＥＭ ＧＤＮＦ 经酶切鉴定正确,测序结果与Ｇｅｎｅｂａｎｋ 比较基本相同。由于ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 扩增得到的片段大小相同,证实该基因片段内无内含子插入,该片段可用于真核及原核表达。     

人白细胞介素—2基因真核表达载体pDORIL—2的构建

构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体。方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆入表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ。结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲ     

HSV-tk基因特异性杀伤大肠癌细胞的实验研究

目的：探讨单纯疮疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－tk)ad基因在大肠癌组织细胞中特异地表达, 以达到靶向基因治疗的作用。方法：构建以ＣＥＡ基因顺式转录调控序列（ＴＲＳ）驱动tk基因的组织特异性重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡtkＮa,然后以重组逆转录病毒上清染法将重组组织特异性载体及非组织特异性载体分别转导入高分泌ＣＥＡ的大肠癌ＬoＶo细胞中,以Ｇ４１８筛选阳性克隆扩增后给予前药更昔洛韦（ＧＣＶ）进行敏感试验。结果：转导     

T—载体在聚合酶链反应扩增产物克隆中的应用

目的 探讨克隆聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增产物的简便方法。方法 用ＰＣＲ方法分别特异性扩增Ｗｉｌｍｓ瘤基因ｗｔ１和尿激酶受体（ＵＰＡＲ）基因,并利用Ｔａｐ聚合酶具有的延伸酶活性将扩增产物直接克隆入Ｔ－载体,ＥｃｏＲＩ酶切鉴定阳性重组子。结果设计的引物可分别扩增ｗｔ１基因锌指区（３４３ｂｐ）和ＵＰＡＲ基因编码区全长（１０８３ｂｐ）;未经修饰的常规ＰＣＲ和高保真ＰＣＲ扩增产物可被直接克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ     

信号分子GRF的PH结构域基因片段的克隆与表达

目的：从大鼠脾脏克隆信号分子ｇｕａｎｉｎｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＦＲ）的ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｂｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）结构域基因并进行谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）融合表达,为进一步寻找其新配基、研究其功能打下基础。方法：采用一步法从大鼠新鲜脾组织中提取总ＲＮＡ,反转录合成ｃＮＤＡ,ＰＣＲ方法扩增目的基因片段,并克隆到载体ｐＵＣ１９中。引物末端标记后,以双脱氧终止法     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

人血管内皮生长因子165的克隆和在大肠杆菌中的表达

克隆和在大肠杆菌中表达人血管内皮生长因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）。方法利用ＰＣＲ的方法从胎脑ｃＤＮＡ库扩增得到人ＶＥＧＦ１６５的全长ｃＤＮＡ并测定其核酸序列。利用基因重组技术构建ＶＥＧＦ１６５的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达产物。结果经测序表明，克隆的ＶＥＧＦ１６５与文献报道相符，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明经用ＩＰＴＧ诱导后，ＶＥＧＦ１６５在大肠杆菌中表达出。结论克隆和表达出ＶＥＧＦ１６５，为以后进一步研究ＶＥＧＦ１６５的功能奠定了基础     

重组人白介素2卡介苗的构建及表达

采用聚合酶链反应及基因工程技术,克隆卡介苗（ＢＣＧ）的主要分泌抗原Ａｇ８５Ｂ基因的５’端第９４～２１１的核苷酸的信号肽序列和构建重组人ＩＬ－２穿梭表达质粒,并用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）鉴定外源基因在ＢＣＧ中的表达。结果表明,构建的ＢＣＧ重组体能表达和分泌人ＩＬ－２。此将试用于临床治疗膀胱癌病人。     

人白细胞介素-15 cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的高效稳定表达

目的　在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中表达人白细胞介素１５（ＩＬ１５）,为ＩＬ１５ 的功能研究提供有利条件。方法　采用ＰＣＲ技术扩增人ＩＬ１５ 编码区ｃＤＮＡ片段,构建重组真核表达载体,再以脂质体法转染至ＣＨＯ 细胞进行表达,鉴定表达产物的生物学活性。结果　共获得８ 株高效表达ＩＬ１５ 的阳性克隆,其平均活性为（３１８５４±３２７２）Ｕ／（１０６ ｃｅｌｌｓ·ｄ）,稳定传代６ 个月后仍保持其表达活性。结论　人ＩＬ１５ ｃＤＮＡ在ＣＨＯ细胞中获得高效稳定表达     

丙型肝炎病毒HCV E1区基因的真核表达载体构建及序列分析

建立丙型肝炎病毒包膜区基因的真核表达载体，并通过对其序列分析阐明其作为基因接种的可能性。方法：经常规ＲＴ－ＰＣＲ法从ＨＣＶ ＲＮＡ阳性病人的血清中扩增出ＨＣＶ Ｅ１区的基因片段，经ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ双酶发后将其克隆到真核表达载体ＰｃＤＮＡ３中，阳性克隆经ＳｍａⅠ和ＸｂａⅠ双酶切鉴定以脱氧终止法测序，同时利用计算机软件对其推定的氨基酸序列进行分析。     

基因重组构建MDR基因表达载体及其表达研究

利用基因重组技术，成功地构建了ＭＤＲ Ｉ基因片断的表达载体ｐＧＥ－Ｈｍｄｒ－１，用氯化钙方法转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１，挑选２０个克隆扩增培养，经提质粒，酶切，Ａｇａｒｏｓｅ电泳检测证实：其中４个克隆含有重组质粒，选用含重组质粒载体的菌株扩增培养，经ＩＰＴＧ诱导，超声波破碎，抽提蛋白，ＧＳＨ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测证实：此重组载体已表达所需的目的蛋白（ＧＳＴ－ｍｄｒ     

人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模随机测序体系的建立

建立人树突状细胞（ＤＣ）的ｃＤＮＡ文库,通过大规模随机测序克隆免疫新分子。方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体外经ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－４培养,扩增出高纯度的ＤＣ,抽取纯化ｍ ＲＮＡ,转录成ｃＤＮＡ,定向插入ｐＳＰＯＲＴ２．０载体,建立人ＤＣ的ｃＤＮＡ 质粒文库;用ＡＢＩ３７７全自动测序仪对该文库进行同源性比较,筛选出代表未知基因ＥＳＴ,然后在ＧＣＧ 软件中进行分析,对重要的未知ＥＳＴ克隆其全长ｃＤＮＡ。结果：所扩增的ＤＣ经流式细胞仪分析高表达ＭＨＣ－Ⅰ,ＭＨＣ－Ⅱ,Ｂ７,ＣＤ１ａ 和ＣＤ８３等表面标志,能强烈刺激同种异体Ｔ淋巴细胞的体外增殖反应;建立的ＤＣｃＤＮＡ 文库９２％ 以上克隆有平均１．６ ｋｂ 大小的插入片段;从所测的１２ ０００余条ＥＳＴ中筛选出代表未知基因的３ ０００余条,克隆到１０９条全长新基因,包括属于细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和粘附分子等家族的免疫新分子,部分全长基因已在Ｇｅｎｅｂａｎｋ 中登录。结论：成功建立了人ＤＣ的ｃＤ－ＮＡ 基因文库及其大规模随机测序体系,并克隆到免疫分子。建立人树突状细胞（ＤＣ）的ｃＤＮＡ文库,通过大规模随机测序克隆免疫新分子。方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体     

产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因克隆及表达

目的 研究克隆并表达产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素Ｂ亚单位。方法 合成２条引物用ＰＣＲ法扩增包括产毒性大肠杆功不耐热肠毒素（ＥＴＥＣ，ＬＴ）Ｂ亚单位基因编码区及起始密码子上游７９３ｂｐ的ＤＮＡ片段，ＰＣＲ产物克主ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ＾（一）并转化进入ＸＬ－Ｂｌｕｅ工程菌中。结果 经ＥＬＩＳＡ，Ｗｅｓｔｒｎｋ－ｂｌｏｔ测定共获得２２株菌表达ＬＴ－Ｂ表达水平比Ｈ１０４０７高２～３倍。克隆的基因经测序