两种玻璃化胚胎冷冻方法对不同品系小鼠胚胎冷冻结果比较

目的 探讨EFS和DAP两种玻璃化冷冻方法对不同品系小鼠胚胎冷冻的效果。方法6个品系小鼠（KM、ICR、BALB/c、C57BL/6J、OB/OB、LAP/rtTA0F59）的2-cell胚胎分别用EFS和DAP两种玻璃化冷冻方法进行冷冻和复苏,比较两种冷冻方法的胚胎复苏率和着床率。结果 6个品系小鼠冷冻胚胎EFS方法的平均复苏率为69.97%（47.9%～83.6%）,DAP方法的平均复苏率47.23%（26.3%～76.7%）EFS方法明显优于DAP方法。其中KM、ICR和BALB/c小鼠EFS方法的冷冻复苏率显著高于DAP方法（P<0.01）;冻融胚胎移植后EFS方法的平均着床率27.23%（1.75%～45.0%）,DAP方法的平均着床率31.43%（7.0%～46.3%）。除KM、ICR小鼠外,其他4个品系小鼠的着床率DAP方法高于EFS方法。结论 KM和ICR远交群小鼠胚胎适合用EFS方法冷冻保存;C57BL/6J、OB/OB、LAP/rtTA0F59三个品系小鼠DAP方法优于EFS方法,但差异不大; BALB/c小鼠两种玻璃化冷冻方法的冻融胚胎着床率均较低,需进一步研究。     

小鼠胚胎玻璃化冷冻的研究进展

玻璃化冷冻是继常规冷冻方法之后发展起来的一种冷冻方法,它操作简单且不需要高精度的冷冻仪。玻璃化冷冻的效果与玻璃化溶液的种类、冷冻方法及胚胎的不同品种及时期有关。本文综述了近年来有关胚胎玻璃化冷冻的研究进展。     

近交系小鼠胚胎玻璃化冷冻技术研究

目的 对近交系小鼠体内受精的胚胎在三种不同处理温度(20℃、25℃、28℃)进行玻璃化冷冻保存。方法 不同温度下,胚胎在10％EG溶液中预处理5min,再投入EFS40玻璃化溶液中1min,平衡后冷冻。结果 与20℃和28℃相比,三个品系小鼠的胚胎都在25℃冷冻时获得最佳效果,解冻后培养观察发育率分别是87．77％、90．00％、87．18％。结论 该结果对近交系小鼠胚胎保存具有重要意义。     

胚胎发育期和冷冻保护剂剂量对Nakagata小鼠胚胎冷冻效果的影响

目的利用不同剂量的冷冻保护剂,对ICR和Km小鼠不同发育期的胚胎进行冷冻和解冻实验。探讨Nakagata小鼠胚胎玻璃化冷冻管方法,使用不同剂量的冷冻保护剂等因素对冷冻效果的影响。方法2细胞期胚胎在KSOM微滴培养液内分别培养到2细胞4、细胞和8细胞期胚胎,分别加入50μL,100μL,200μL的DAP213冷冻保护剂,利用Nakagata方法冷冻,解冻以及观测解冻后培养至囊胚期胚胎的冷冻效果。结果冷冻保护剂DAP213剂量和ICR,KM小鼠胚胎不同细胞发育期对冷冻效果具有显著的交互影响(P<0.01)。相对而言,冷冻保护剂剂量对结果的影响(P>0.05)低于胚胎细胞发育期对冷冻效果的影响(P<0.01)。结论冷冻保护剂的剂量和胚胎细胞发育期均会影响冷冻实验的结果。胚胎的细胞发育期对冷冻效果的影响更大。对2细胞期,4细胞期和8细胞期的胚胎进行冷冻。8细胞期胚胎的冷冻效果最好,4细胞期胚胎冷冻效果最差。利用Nakagata冷冻管方法建立小鼠胚胎冷冻库,100μL冷冻保护剂效果较好。不同小鼠的品系也可影响冷冻结果。     

FVB小鼠超排卵及胚胎冷冻技术的研究

目的为制备FVB转基因小鼠及保种繁殖提供最佳超排周龄及胚胎冷冻方法。方法对4—6周、6．8周、8．10周FVB小鼠进行超数排卵效果的比较及采用体外培养受精卵至2-cell法和输卵管吹卵法两种不同方法收集2-cell受精卵进行胚胎冷冻。结果4．6周雌鼠经超排后回收的受精卵（24．6个）明显高于6—8周龄、8—10周龄的FVB雌鼠（14．5个、16．2个），差异有显著性；两种方法回收的2-cell受精卵经冷冻保存后，Ⅱ组受精卵解冻后2-cell形态正常的胚数（106个）高于I组解冻后2-cell形态正常的胚数（90个），但两者无显著性差异。结论本研究将为制备FVB转基因小鼠及转基因动物的种系保存和繁殖提供了基础。     

小鼠胚胎冷冻保存技术研究进展

随着生物工程小鼠的大量出现，建立一种完善的胚胎冷冻保存技术体系保存这些资源至关重要。自20世纪70年代对小鼠胚胎冻存成功以来，胚胎冷冻技术已得到飞速发展。目前研究焦点在于寻找更好的冷冻保护剂和简化操作方法等方面。本文对小鼠胚胎冷冻保存技术的冷冻保护剂、冷冻方法及所涉及的主要原理和目前的研究进展进行了评述。     

抗冷冻蛋白Ⅲ对小鼠胚胎冷冻保护的作用

目的将抗冷冻蛋白III(AFPIII)应用于小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻保存,观察其对细胞微丝骨架结构和冷冻复苏后发育潜能是否有保护作用。方法收集小鼠2-细胞期胚胎1 200枚,随机分为新鲜对照组、玻璃化冷冻组和添加AFPIII玻璃化冷冻组(AFPIII终浓度为500 ng/mL),每组400枚,其中200枚胚胎进行复苏后囊胚培养,200枚进行细胞微丝的免疫荧光染色,比较各冷冻组胚胎复苏存活率和其后的囊胚形成率以及各组微丝完整胚胎比率。结果添加AFPIII玻璃化冷冻组胚胎复苏率高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05)。新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组囊胚形成率、微丝完整胚胎比率均高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05);新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 AFPIII对小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻有保护作用。     

HBV—C转基因小鼠快速胚胎冷冻方法的建立

目的 建立用于转基因小鼠种质保存的快速胚胎冷冻方法。方法 用乙二醇作为抗冻保护剂,对携带HBV—C基因的转基因小鼠模型进行了玻璃化胚胎冷冻保存的研究。结果 发现含体积分数30％乙二醇的冷冻液可达到最佳的冷冻效果,有81．54％的冷冻胚胎在体外可进一步发育,其中69．81％达到孵化阶段,比较不同发育阶段的胚胎的冷冻效果发现,致密桑椹胚解冻后的孵化率显著高于囊胚。不同的装管方法对胚胎的回改率也有影响,五段法的胚胎回收率显著高于二段法。将解冻后形态正常的胚胎82枚移植给8只假孕母鼠,5只怀孕,怀孕率为62．5％,产下28只小鼠,产仔率为54．9％。结论 一步法玻璃化冷冻方法可用于转基因小鼠的种质保存。     

针刺对超排卵小鼠胚胎质量的影响?

目的探讨电针对超排卵小鼠胚胎发育状况的影响。方法将雌性小鼠随机分成自然组、阴性对照组、超排卵组和电针组,取三阴交、关元、中极行电针治疗,每天1次。根据胚胎发育情况及囊胚评价系统观察胚胎的质量变化。结果超排卵组获得的胚胎数最多,优质胚胎率较低,且3~6级囊胚率最低;电针组与超排卵组相比,获得囊胚率虽无统计学意义(P0.05),但优质囊胚率及3~6级囊胚率均高于超排卵组,且差异有统计学意义(P0.05)。结论针刺可以改善超排卵小鼠的胚胎质量,从而提高着床率。     

一氧化氮对小鼠胚胎着床的作用

为探讨一氧化氮（NO）在胚胎着床中可能发挥的作用及其机制,进行小鼠胚胎着床实验,分3个实验进行。实验1及实验2,于小鼠妊娠第3d和第1－6d分别腹腔内注射N－硝基－L－精氨酸甲酯[L－NAME,一氧化氮合酶（NOS）的非特异性竞争抑制剂]0.5-5mg和3mg,观察其对胚胎着床的影响。实验3,给予L－NAME＋L－精氨酸（NO的前体）,观察L－精氨酸对L－NAME作用的影响,并评价胚胎发育情况。上术3个实验均取子宫内膜行组织学检查。结果发现：与对照组相比,妊娠第3d腹腔注射L－NAME1－5mg可减少胚胎的着床位点数（P＜0.05）,腹腔注射4、5mg的L－NAME可完全抑制小鼠胚胎着床的发生。围着床期（妊娠3－5d）给予L－NAME均可减少胚胎着床位点数。此时,子宫内膜血管通透性的改变被抑制,缺少蜕膜样变,同时胚胎发育阻滞。L－NAME的这种抑制作用可被同时给予的L－精氨酸抵消。提示NO通过增加子宫内膜的血管通透性、子宫内膜的蜕膜化以及胚胎的发育而促进小鼠胚胎着床的发生。     

小鼠品系影响胚胎移植成功率的比较研究

目的:探讨不同受体鼠和供体鼠品系对胚胎移植成功率的影响以及不同品系胚胎混合移植的可行性. 方法:以Balb/c雄鼠和C57BL/6雌鼠杂交F1代(B6CF1)小鼠24只和昆明鼠(KM鼠)14只作为供体鼠,共取状态良好的受精卵362颗,分别或混合回种于8只B6CF1和16只KM受体鼠输卵管内,比较两种品系鼠的产仔率. 结果:除同品系回种可产仔外,KM鼠和B6CF1杂交鼠受精卵交叉回种B6CF1或KM受体鼠以及两品系受精卵混合回种均可产仔. 其中B6CF1受体鼠产仔率(29.0%)明显高于KM受体鼠(7.0%),B6CF1供体鼠产仔率(16.0%)也略高于KM供体鼠(11.0%);杂交B6CF1受精卵同品系回种产仔率最高(32.0%),KM鼠受精卵同品系回种产仔率仅4.0%,而B6CF1和KM鼠作为受体鼠混合回种两品系受精卵的产仔率分别为25.0%和15.0%. 结论:不同品系小鼠胚胎可交叉或混合回种,小鼠胚胎移植技术不受品系限制,但同品系胚胎移植成功率更高;B6CF1作为胚胎移植实验动物明显优于KM鼠.     

两种冷冻载体对人胚胎玻璃化冷冻效果的影响

目的探讨不同载体对人早期胚胎玻璃化冷冻复苏的效果。方法采用半封闭式载体冷冻复苏胚胎的患者共265个周期,采用封闭式载体冷冻复苏胚胎的患者共136个周期,均采用玻璃化冷冻办法冷冻体外精-胚胎移植第3日的可利用胚胎,观察胚胎复苏和临床妊娠情况。结果半封闭式麦管冷冻复苏胚胎的患者移植周期258个,取消周期7个;复苏率、临床妊娠率和种植率分别为96．88％、48．44％和32．20％。封闭式麦管冷冻复苏胚胎的患者移植周期132个,取消周期4个;复苏率、临床妊娠率和种植率分别为95．31％、47．72％和32．28％。、两组患者的平均年龄、不孕年限、不孕类型、不孕原因、体外受精或卵胞质内单精子注射（IVF／ICSI）构成比以及胚胎复苏率、移植胚胎数、临床妊娠率和种植率比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论 封闭式冷冻载体能获得与半封闭式载体同样的冷冻效果,同时能避免胚胎受病原微生物的交叉污染,是冷冻人早期胚胎的理想方法。     

胚胎冷冻保存技术及进展

随着冷冻保存技术的发展,胚胎的冷冻保存在生殖医学中的地位越来越重要,已成为辅助生殖的核心步骤及生育力保存的重要方法。过去几年中,全球范围内胚胎冷冻周期数呈指数级增长。胚胎冷冻的优点不断凸显,冻胚移植越来越受人们的关注。如何完善胚胎冷冻技术及如何改善临床结局是目前关注的重点及努力的方向。因此,本文从胚胎冷冻技术的发展历程、应用、分类及目前研究进展几个方面进行全面述评。     

影响冻融胚胎复苏率和移植成功率因素分析

目的 探讨影响冻融胚胎复苏率和移植成功率的相关因素.方法 回顾性分析573个冷冻胚胎移植(FET)周期的临床资料,按冷冻前胚胎质量、胚胎发育时间、解冻后胚胎复苏程度和冷冻方法分别进行分组,分析不同分类各组间的胚胎复苏情况和(或)临床妊娠率差异.结果 冷冻当天胚胎中有优质胚胎者的临床妊娠率显著高于无优质胚胎者(31.8% vs 20.0%)(P<0.05).受精第2天冷冻者与受精第3天冷冻者的胚胎复苏率和临床妊娠率差异无统计学意义(79.1% vs 82.9%和25.5% vs31.2%)(P>0.05).解冻后完全移植100%卵裂球完整者和混合移植者的临床妊娠率显著高于完全移植部分卵裂球损伤者(36.7% vs 24.1%和29.2% vs 24.1%)(P<0.05).冷冻方法改进后的胚胎复苏率和全胚复苏率显著高于冷冻方法改进前(82.0% vs 66.3%和50.0% vs 27.5%)(P<0.05).结论 胚胎质量与胚胎复苏率和临床妊娠率密切相关,冷冻胚胎解冻后全胚复苏率与临床妊娠率正相关,冷冻过程中的操作细节是胚胎实验室保证冻融胚胎复苏、移植成功的重要因素.     

影响冻融胚胎复苏率和移植成功率因素分析

目的探讨影响冻融胚胎复苏率和移植成功率的相关因素。方法回顾性分析573个冷冻胚胎移植（FET）周期的临床资料,按冷冻前胚胎质量、胚胎发育时间、解冻后胚胎复苏程度和冷冻方法分别进行分组,分析不同分类各组间的胚胎复苏情况和（或）临床妊娠率差异。结果冷冻当天胚胎中有优质胚胎者的临床妊娠率显著高于无优质胚胎者（31．8％vs20．0％）（P〈0．05）。受精第2天冷冻者与受精第3天冷冻者的胚胎复苏率和临床妊娠率差异无统计学意义（79．1％vs82．9％和25．5％vs31．2％）（P〉0．05）。解冻后完全移植100％卵裂球完整者和混合移植者的临床妊娠率显著高于完全移植部分卵裂球损伤者（36．7％vs24．1％和29．2％vs24．1％）（P〈0．05）。冷冻方法改进后的胚胎复苏率和全胚复苏率显著高于冷冻方法改进前（82．0％vs66．3％和50．0％vs27．5％）（P〈0．05）。结论胚胎质量与胚胎复苏率和临床妊娠率密切相关,冷冻胚胎解冻后全胚复苏率与临床妊娠率正相关,冷冻过程中的操作细节是胚胎实验室保证冻融胚胎复苏、移植成功的重要因素。     

转录因子Bach1在小鼠胚胎发育时期的生物信息学分析

目的 研究转录因子Bach1在小鼠胚胎发育时期的表达情况并对其表达和调控机制进行生物信息学分析。方法 获取小鼠胚胎发育不同时期的转录组数据[来自Gene Expression Omnibus（GEO）数据库GSE92634],使用权重基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）方法进行分析。利用来自10个小鼠胚胎样品的8 933个基因构建17个共表达模块,并对含有Bach1特定模块的共表达基因进行Gene Ontology（GO）功能富集分析。结果 转录因子Bach1被鉴定为重要的时空监管中枢基因,其与Bach1在小鼠胚胎中共表达的基因与胚胎发育、血管发育密切相关,包括Vegfb、Tcf15、Znf622和Fam105b等,提示Bach1可能在小鼠胚胎发育和血管发育中起重要作用。小鼠胚胎发育过程中Bach1与Vegfb基因从胚胎E5.5到E7.5天表达趋势基本一致,用小鼠胚胎发育的另一个转录组数据库（GSE120963）分析发现Bach1与Vegfb基因表达趋势类似。Bach1在人胚胎干细胞Tcf15、Znf622和Fam105b基因启动子或增强子区具有较高的富集,可能直接调控这些基因的转录。分析与Bach1共表达基因的GO富集发现,Bach1与Wnt信号通路、蛋白修饰和翻译、染色质重塑、DNA损伤反应、细胞周期调节、泛素化修饰等密切相关。结论 通过生物信息学分析发现,Bach1在小鼠胚胎发育中可能起重要作用,并与血管发育密切相关。     

胚胎因素对冻融胚胎移植结局影响

目的探讨胚胎质量与冻融胚胎移植结局的关系。方法对367个冻融胚胎移植周期中胚胎分为优质胚胎和非优质胚胎2组,并在胚胎解冻后根据其卵裂球损伤程度在2组内分别进行妊娠率和胚胎种植率比较。结果367个FET治疗周期中,优质胚胎组的临床妊娠率和种植率明显高于非优质组（P〈0．05）,分别是37．81％和20．72％与22．86％和10．57％。每组无损伤组胚胎临床妊娠率和胚胎种植率均优于损伤组。但优质胚胎组中损伤卵裂球少于2个其临床妊娠率和胚胎种植率与无损伤组无差异。损伤卵裂球多于2个则差异显著（P〈0．05）。结论胚胎质量是影响冻融胚胎种植率的重要因素。     

EDS-40玻璃化冻存小鼠卵母细胞的研究

目的设计研究玻璃化液EDS一40对冻贮小鼠卵母细胞的效果。方法①按随机分组原则，分为实验组和对照组，实验组（a）采用自行设计的EDS一40玻璃化液进行玻璃化冷冻（其配方为：40％乙二醇＋18％葡聚糖），对照组（b）采用国际上已证实效果较好的EFS-40J~璃化溶液进行玻璃化冷冻，对照组（c）采用以PROH为基础的程序冷冻液进行程序冷冻。首先对EDS一40和EFS-40玻璃化溶液，行玻璃化测试；再随机选用小鼠卵母细胞，在室温25℃下分别加入EDS-40和EFS．40玻璃化溶液，玻璃化后装管并迅速投入液氮中。对照组（c）置于程序冷冻仪中进行程序化冷冻。各组均冻存2mo-3mo后，在25℃的水浴中复温后，用培养液反复洗涤后移入培养孔板培养，观察卵母细胞的成活率。将成活的卵母细胞行体外受精，观察其受精率。结果①两种玻璃化溶液能达到玻璃化效果；②EDS一40、EFS一40及对照组冷冻复温后的存活率依次为：79．34％、67．94％、56．34％；⑤EDS一40、EFS-40及对照组冻卵的受精率分别：79．17％、66．29％、51．25％。结论①EDS一40可以用来玻璃化冷冻小鼠卵母细胞；②EDS一40较EFS一40玻璃化溶液冻存小鼠卵母细胞效果更好；③玻璃化技术比传统冷冻法效果更好。     

Comparison of Efficacy of Two Vitrification Solutions for Mouse Morulae

Objective To study the efficacy of two vitrification solutions for mouse morulae Methods Good morulaes of NIH mice were collected and used to test toxicity of the vitrification solutions EDS40 （40% ethylene glycol, 18% dextran and 0.5 tool sucrose） and EFS40 （40% ethylene glycol, 18% ficoll and 0.5 tool sucrose）. Fine vitrified morulae were packaged in 0.25 mL plastic straws and immersed into liquid nitrogen and cryopreserved for about 2-3 months. Then the straws were heated rapidly, washed in Ham＇s F12 medium and cultured. The viability was determined by morphology and blastocyst formation after being cultured for 48 h. Some embryos were transplanted to recipients after being cultured for 12-14 h. The number of pregnant recipients and young born was counted and analyzed by Chi-squared test. Results The toxicity of EDS40 solution was significantly lower than that of EFS40 （P〈0.05） and the number of embryos developed to the blastocysts after vitrification in EDS40 was significantly higher than in EFS40 （P〈0.05）. The number of zona pellucida and the number of pregnancy and birth integrated after vitrification cryopreservation had no significant difference between EDS40 and EFS40 （P〉0.05）. However, the embryo fineness rates after vitrification in EDS40 was significantly better than in EFS40 （P〈0.01）. Conclusion EDS40 solution has less toxicity and better cryoprotect effect on embryos than EFS 40.     

氨基酸浓度对昆明小鼠胚胎体外发育的影响

目的探讨培养液中氨基酸成分对植入前昆明小白鼠胚胎发育的影响,摸索植入前胚胎体外培养氨基酸的最佳浓度。方法从超排昆明小鼠输卵管中取出的630枚受精卵均分为7组,分别在经添加不同浓度Eagle's氨基酸的去牛血清白蛋白KSOM培养液(mKSOM、mKSOM 1/16AA、mKSOM 1/8AA、mKSOM 1/4AA、mKSOM 1/2AA、mKSOM AA、mKSOM 2AA)中培养,对比观察各组胚胎体外发育的过程。用卡方检验分析添加各浓度氨基酸的培养液培养效率的差别,并将8细胞发育率和囊胚发育率分别与相应的氨基酸浓度进行曲线拟合分析。结果与未添加氨基酸组对比,添加氨基酸组胚胎发育率高,8细胞胚和囊胚的形成率与培养液中氨基酸的浓度关系均符合三次模型,在氨基酸为1/2浓度时8细胞胚和囊胚的形成率均达到最高。结论氨基酸对胚胎的体外发育有促进作用,但含有高浓度氨基酸的培养液培养效果反而有所下降,可能是由于高浓度的氨基酸影响胚胎的代谢和渗透压的改变,且氨基酸分解及胚胎代谢所产生的铵对胚胎有毒性作用。