双重实时荧光PCR在手足口病快速检测中的应用

目的 探讨双重实时荧光PCR 技术检测手足口病肠道病毒的应用效果.方法 用单一实时荧光PCR先检测标本中的肠道病毒通用病毒核酸,肠道病毒通用病毒核酸阳性再分别用双重实时荧光PCR及单一实时荧光PCR检测CoxA16型和EV71型特异性核酸,比较两种方法检测结果.结果 240份标本中肠道病毒通用型核酸阳性157份,双重实时荧光PCR法CoxA16阳性111份,EV71阳性1份,其他肠道病毒45份,单一实时荧光PCR法CoxA16阳性109份,EV71阳性1份,CoxA16+EV71阳性2份,其他肠道病毒45份.EV71和其他肠道病毒符合率为100%.结论 双重实时荧光PCR 检测技术可以准确检测手足口病肠道病毒,且特异性强、灵敏度高,又可以快速得到检测结果,是一种快速检测手足口病病毒的方法.     

肠道病毒71型实时荧光RT-PCR检测方法的建立及临床评价

目的 利用实时荧光RT-PCR技术,并通过系统的分析性能和临床性能评价,建立一种早期快速检测肠道病毒71型(EV71)的方法.方法 根据EV71基因组中编码衣壳蛋白VP1基因保守区序列设计一对引物和一条荧光探针,利用实时荧光RT-PCR技术建立了检测EV71的方法,并对扩增产物进行分析,同时进行灵敏度、特异性、精密度评价.在此基础上利用不同标本类型共1104例临床样本对本方法和RT-PCR方法进行对比分析.结果 本方法可以特异性的检测EV71,而对种属相近的或引起症状相似的其他病毒均无交叉反应.本方法检测灵敏度达到9.22×102 PFU/ml,不同浓度样本的Ct值的变异系数在1.4%～2.9%之间.1104例临床样本的研究显示本方法与RT-PCR方法检测结果的总符合率达到96.74%,阳性样本的检出率要高于RT-PCR方法.结论 本方法检测EV71具有灵敏度高、特异性强、精密度高、快速简便的特点,并与RT-PCR方法具有很好的符合率,在手足口病的早期快速诊断和疫情监测方面具有很好的应用前景.     

实时荧光定量PCR技术在手足口病检测中的应用

目的探讨实时荧光定量PCR技术在手足口病检测中的应用。方法选择本溪市疾病预防控制中心2018年2月～2019年6月收治的120例手足口病患儿作为研究对象,根据检测方法不同分为对照组和观察组。对照组利用常规PCR技术检测手足口病组,实时荧光定量PCR技术检测手足口病为观察组。比较两组的检出肠道病毒分型EV、EV71、CoxA16阳性率,特异性和灵敏度。结果采用实时荧光定量PCR技术与常规PCR技术检测手足口病肠道病毒分型EV、EV71、CoxA16的阳性率及两组特异性和灵敏度相比,观察组检测阳性率为66.67%,明显高于对照组检测阳性率的21.67%,观察组检出阳性率高于对照组,两组均有特异性,观察组灵敏度优于对照组,对照组最低检测限均为4.11×10~3cfu/mL。而观察组均为4.11×10~2cfu/mL。结论荧光定量PCR技术在检测肠道病毒中不仅具有特异性高,还具有灵敏度高、检测时间快的特点,有助于更快诊断手足口病,更好的服务于临床。     

实时荧光PCR技术在手足口病原学检查中的应用

目的：采用实时荧光PCR法检测手足口病患儿病原体。方法：收集40例本市确诊手足口病患儿的肛拭子样本,进行肠道病毒筛选和柯萨奇病毒16型与肠道病毒71型鉴别与分析。结果：实时荧光PCR法检测40例患儿肛拭子标本使用通用型试剂盒检出22例阳性,其中9例为CVA-16感染,12例为EV71感染,发病3 d内采集标本检出阳性患儿占75%。结论：CVA-16和EV71肠道病毒是手足口病的主要病原体,手足口病病毒检出率与标本的采集时间相关性,实时荧光PCR技术对手足口病的病原诊断具有重要价值。     

手足口病样本类别间检测结果的差异比较

目的 探索手足口病病毒核酸检测多类型样本间的阳性率差异,为手足口病病毒核酸检测样本类型选择提供依据.方法 选取2017年1月至2019年12月本院收治的385例手足口患儿为研究对象.采用荧光定量RT-PCR实时荧光探针技术同步进行病毒核酸检测肠道病毒EV通用型、肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)、柯萨奇病毒A组16型(coxsackie virus A16,CV-A16)及其他肠道病毒型,并统计分析结果.结果 第一组279例患儿肛拭EV通用型、EV71、CV-A16和肠道病毒其他型阳性率为81.00％、43.72％、30.47％、6.81％,高于咽拭子的67.38％、34.40％、26.52％、6.45％.肛拭标本肠道病毒检测的EV通用型和EV71的阳性检出率均明显高于同步检测的咽拭标本,差异有统计学意义(P<0.05).第二组106例患儿肛拭EV通用型、EV71、CV-A16和肠道病毒其他型阳性率为79.24％、42.45％、30.18％、6.60％,低于疱疹液的92.45％、56.60％、29.24％、6.60％,肛拭标本肠道病毒EV通用型,EV71阳性检出率均明显低于同步检测的疱疹液标本,差异有统计学意义(P<0.05).结论 3种类型标本间检出率存在明显差异,建议今后手足口病病毒核酸检测在患者实际条件允许的情况下,尽量同步送检两个类型的标本,首选疱疹液标本送检,肛拭标本次之,咽拭子为末选.     

病毒性脑炎患者脑脊液肠道病毒和EV71检测与分析

目的 探讨肠道病毒和EV71所致脑炎的发病情况及荧光定量PCR诊断病毒性脑炎的意义.方法 收集银川市118例临床诊断病毒性脑炎、脑膜炎患者脑脊液和血清,用荧光定量PCR检测肠道病毒和EV71阳性率及病毒拷贝数,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）定性检测血清EV71病毒IgM抗体.结果 荧光定量PCR检测肠道病毒阳性病例42例,检测阳性率为35.6％;EV71阳性病例22例,检测阳性率为18.6％,占EV阳性病例的52.3％;ELISA定性检测EV71病毒IgM抗体,阳性病例30例,检测阳性率25.4％,肠道病毒和EV71病毒性脑炎患者6岁以内幼儿明显多见于其他年龄组.结论 肠道病毒是本地区病毒性脑炎、脑膜炎患者最常见的病原体,EV71可能是本地区肠道病毒性脑炎中最多见的一种,肠道病毒和EV71感染所致脑炎都以6以内幼儿为主;荧光定量PCR对EV71检测特异性高于ELISA.     

实时荧光RT-PCR法在手足口病患儿病原检测中的应用

目的:了解核酸检测(RT-PCR)法在抚顺市手足口病患儿病原谱调查中的应用价值,为疾病防控提供依据。方法:在全市范围内收集2013年和2014年疑似手足口病患儿咽拭子、肛拭子标本,使用人肠道病毒通用引物、肠道病毒71型(EV71)引物和萨奇病毒A组16型(Cox A16)引物,采用实时荧光RT-PCR方法进行病原核酸检测。结果:2013年检测标本461份,其中EV71阳性16份,Cox A16阳性316份,其他肠道病毒阳性46份。2014年检测标本253份,其中EV71阳性112份,Cox A16阳性57份,其他肠道病毒阳性35份。两年标本肠道阳性率平均为81.51%,其中EV71型和Cox A16型占阳性标本总数的86.08%。结论:实时荧光RT-PCR方法因具有操作简便、快速和特异性高的优点,非常适合于手足口病患儿病毒核酸的快速分型。EV71型和Cox A16型肠道病毒是抚顺市近两年引起手足口病患儿感染的主要病原体。     

实时荧光PCR法和病毒分离培养法在手足口病病毒检测中的应用分析

目的 筛选快速准确的检测方法,为手足口病监测与防控工作提供及时可靠的病原学依据。方法 采用病毒分离培养法和实时荧光PCR检测法对2014年牡丹江市手足口病监测哨点医院采集的手足口样病例标本进行检测,比较检测结果。结果 2014年采集的206份标本中,实时荧光PCR法检测肠道病毒EV 71型42例、Cox A16型9例、肠道病毒通用型37例,阴性118例。病毒分离培养法检测肠道病毒EV 71型4例、Cox A16型4例、肠道病毒通用型6例。实时荧光PCR法、病毒分离培养法检测阳性率分别为42.72%和6.80%;与实时荧光PCR法相比,病毒分离培养法灵敏度、特异度分别为15.91%、100.00%。结论 实时荧光PCR法比病毒分离培养法更灵敏快捷、特异性强、敏感度高等,适用于手足口病病原体的检测。     

荧光定量RT—PCR快速检测手足口病病原研究

目的建立荧光定量RT—PCR技术用于检测手足口病的肠道病毒。方法利用TaqMan技术，设计一对共引物及探针，建立、优化反应体系后，构建质粒标准品，利用10倍稀释法建立相对定量标准曲线，根据TCID。倍比稀释，建立灵敏度曲线。特异性检验后利用临床标本与传统的RT—PCR法进行比较。结果定量标准曲线的灵敏度为10^5／μl（R^2=0．999），PCR扩增效率为94％。灵敏度曲线显示检测到的最低浓度值为5．0TCID50／ml（R^2=0．99），PCR扩增效率为97．6％。荧光RT—PCR检出率为80．9％，显著高于RT—PCR（检出率为62．92％）。结论研究建立的荧光定量RT—PCR方法检测肠道病毒敏感性高、特异性好、效率高，可以作为肠道病毒的快速检测方法。     

贵阳地区2015年手足口病柯萨奇病毒A6、A10型的检测分析

目的 了解贵阳地区2015年引起手足口病(HFMD)的柯萨奇病毒(CV) A6、CVA10型肠道病毒(EV)的病原构成情况,为本地区HFMD防治提供依据.方法 根据GenBank上的CVA6和CVA10序列,分别设计特异性引物,建立荧光定量RT-PCR方法体系,用基因测序法进行验证,然后利用该方法对607例HFMD临床病例标本进行检测.结果 共检测HFMD疑似病例607例,总阳性率为59.47％(361/607),其中EV71占7.25％ (44/607),CVA16占11.37％ (69/607),EV71和CVA16双阳性占0.16％ (1/607),其他EV占40.69％(247/607).用建立的实时荧光RT-PCR法检测出CVA6、CVA10和CVA6+CVA10型阳性样本分别为11、71和1例[总阳性率13.67％ (83/607)],且与基因测序法结果完全符合.结论 CVA6、CVA10是贵阳地区2015年HFMD新发的主要病原,应加强对其型别的监测.     

湘潭市手足口病原学流行特征分析

目的：针对湘潭市20102013年手足口病监测实验室检测结果分析该病病原学流行特征,为本市手足口病防控提供参考依据。方法：收集湘潭市20102013年国家疾病监测报告管理系统手足口病疫情基本资料及实验室检测结果进行统计分析;实验室检测采用 RT-PCR 实时荧光法检测肠道病毒、肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒 A 组16型（CoxA16）.结果：20102013年,检样1079份,肠道病毒阳性569例,阳性率52.73％;EV71型阳性211份,占37.08％,;CoxA16阳性110份,占19.33％;其他型阳性248份,占43.59％;997份轻症病例中 EV71阳性率30.12％、CoxA16阳性率22.09％、其他型阳性率47.79％;重症病例67份,EV71阳性率84.48％、其他型率15.52％;死亡病例15份,EV71阳性率92.31％、其他型率7.69％。结论：2010-2013年,湘潭市手足口病以 EV71型和其他型为优势流行株;重症、死亡病例主要由 EV71引起;EV71型引起的手足口病比其他肠道病毒更容易引起流行,导致重症的比例也较高。     

肠道病毒71型特异性单克隆抗体的制备及其在病毒鉴定中的应用

目的：建立肠道病毒71型（ EV71）特异性检测的免疫荧光方法用于病毒分离培养后的EV71鉴定,为EV71生物学特征研究和疫苗株的筛选奠定基础。方法：以EV71 VP1为免疫原制备单克隆抗体,用经测序鉴定的肠道病毒毒株建立EV71特异性免疫荧光方法;将不同地区收集的手足口病患儿的临床标本进行病毒分离,利用EV71特异性单抗进行分离培养后的病毒鉴定。结果：制备获得2株单抗,经鉴定其中1株3 E12为EV71特异性单抗;以此单抗建立的免疫荧光方法对EV71感染细胞呈阳性反应,而与柯萨基病毒A16和埃可病毒6等非EV71肠道病毒不反应。从104份手足口病临床标本中共分离到35株病毒,产生肠道病毒典型的细胞病变;用3E12特异性单抗免疫荧光鉴定分离病毒,其中29株为EV71,与RT-PCR验证结果完全一致。结论：成功制备获得EV71特异性单克隆抗体,以此单抗建立的EV71特异性免疫荧光方法敏感性高、特异性强,可用于分离培养EV71的鉴定。     

2012年贵阳地区住院患儿手足口病的病原学研究

目的：了解2012年贵阳地区儿童手足口病住院患者的病原体分布情况,为手足口病的诊断、治疗及预防提供依据。方法收集3179例手足口病患儿资料,用荧光定量PCR法进行肠道病毒通用型、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）定量分型。结果共检测手足口病病例标本3179份,CA16阳性151份,占4．75％;EV71型331份,占10．41％;CA16和EV71混合感染7份,占0．22％;其他型肠道病毒897份,占28．22％。全年有2个发病高峰,分别为4～7月及10～11月,发病年龄主要集中在5岁以下儿童,其中0～3岁发病最高;男性患儿多于女性。结论2012年贵阳地区儿童手足口病住院患者的病原学分布以其他型肠道病毒和EV71型为主。     

2010年聊城地区手足口病病原学检测结果分析

目的 了解聊城地区2010年手足口病病原情况.方法 2010年6月采集聊城地区240例手足口病病人(包括27例重症病人)咽拭子并提取病毒RNA.采用Real-time RT-PCR方法,以肠道病毒5'UTR区通用引物及探针对240份临床标本进行初步筛查,初筛阳性标本进一步采用CA16及EV71 VP1区特异性引物及探针...     

简并PCR技术在肠道病毒血清型鉴定中的应用

目的 探讨共有序列简并杂合寡核苷酸引物PCR（CODEHOP-PCR）在肠道病毒血清型鉴定中的临床应用价值。方法 以CODEHOP-PCR检测经实时荧光RT-PCR鉴定为EV71和CA16 手足口病患者的临床样本和病毒分离培养细胞上清的肠道病毒VP1基因片段，经琼脂糖凝胶电泳并回收、测序，与Genbank提供的序列比较，确定肠道病毒的血清型。结果 CODEHOP-PCR后的序列分析表明，所有的EV71毒株和CA16毒株与近几年国内报道的部分毒株同源性在96%以上，其血清分型结果验证了实时荧光RT-PCR分型结果的准确性。结论 CODEHOP-PCR合并测序用于肠道病毒血清型的准确鉴定，与传统的病毒分离及血清中和试验相比，具有更快速、准确的优点。     

贵阳地区2013年手足口病非 EV71、非 CVA16型肠道病毒的检测分析

目的：了解贵阳地区引起手足口病（HFMD）的非肠道病毒71型（EV71）、非柯萨奇病毒 A（CVA）16型肠道病毒的病原构成及优势型别,为贵阳地区 HFMD 防治工作提供依据。方法收集2013年4～6月检测为非 EV71、非 CVA16型肠道病毒的 HFMD 患者肛拭子标本共107例。提取病毒核酸,用巢式 RT-PCR 法扩增病毒 VP4区序列,对 PCR 阳性扩增产物进行测序,通过与 GenBank 收录的序列 BLAST 比对确定病毒型别;并对优势型别进行序列和进化分析。结果107例标本中共有100例标本巢式 RT-PCR 检测为阳性（93％）,其中100例 PCR 产物测序成功,经 BLAST 比对后,100例标本病毒型别均得到确定：CVA6为46例,CVA10为30例,CVA5为10例,CVA2为6例,CVA3和 CVA4各2例,CVB2和 ECHO16各2例。 CVA6在型别确定的非 EV71、非 CVA16型肠道病毒中占42．99％,为优势肠道病毒型别。结论贵阳地区引起 HFMD 的肠道病毒型别多样,CVA6为非 EV71、非 CVA16型肠道病毒中的优势型别。     

BD MAX全自动工作站在肠道病毒检测中的优势

目的 比较常规检测方法与BD MAX全自动工作站在手足口病病原学检测中的差异,探讨应用BD MAX全自动工作站检测肠道病毒的可行性。 方法 收集2017年1月—2020年9月昆明市临床诊断为手足口病病例的标本,随机选择136份,以实验室常规采用的实时荧光PCR检测方法和BD MAX全自动工作站方法,对结果进行Cohen′s kappa一致性分析;用无酶水对检测试剂盒提供的U/CA16/EV71假病毒阳性对照做10倍梯度稀释,记录各稀释度检测结果;随机取两份阳性标本,分别用两种方法平行重复检测10次,计算 Ct值的平均值和变异系数,进行重复性分析。 结果 两种方法对肠道病毒U/CA16/EV71的检测结果一致性好,Cohen′s kappa值为0.889,95%置信区间（95%CI）为0.803~0.976;两种方法检测CA16的敏感性一致,常规方法检测EV71和U的敏感性略高于BD MAX方法;在CA16标本的检测中,常规检测方法变异系数CV（通用型）=1.07%、 CV CA16=0.62%,BD MAX方法CV（通用型）=1.63%、CV CA16=2.19%;在EV71标本的检测中,常规检测方法变异系数CV（通用型）=1.28%、 CV EV71=1.20%,BD MAX方法CV（通用型）=2.37%、CV EV71=1.73%。 结论 BD MAX全自动工作站检测结果较为准确,敏感性、重复性好,人工操作少,便于标准化推广,且耗时短,在小批量标本的病原检测及暴发疫情或应急检测中具备较好优势。     

2011-2012年深圳市重症手足口病的病原学和流行病学分析

目的了解深圳市手足口病(HFMD)重症病例的病原学类型和流行病学特征,为本地区手足口病的预防控制提供理论依据。方法收集2011-2012年深圳市各医院送检的220例手足口病重症病例的粪便样本,应用Real-time RT-PCR技术检测肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)、肠道病毒通用型(EN)。结果 2011-2012年深圳市共发现220例重症手足口病病例,其中,2012年HFMD重症患者数量为2011年的32.53%。220例重症手足口病病例中,EV71型占80.45%,CA16型占5.00%,其他肠道病毒则占13.19%。2011年5、6月为深圳市手足口病重症的高发月份,而2012年5月和7月为高发月份。1岁组重症病例最多有82人,占重症病例总数的37.27%。重症病例人群男性多于女性(1.62∶1)。结论 EV71是引起深圳市手足口病重症病例的最主要原因,其他肠道病毒比CA16更容易引起手足口病重症。