miRNA-26a抑制ox-LDL介导的HAECs凋亡作用的机制研究

目的：探究miR‐26a在ox‐LDL介导内皮细胞HAECs凋亡中的作用及其调控机制。方法采用不同浓度的氧化低密度脂蛋白（ox‐LDL）在体外作用于HAECs细胞,噻唑蓝（MTT）和TUNEL染色检测ox‐LDL作用HAECs后细胞的活性与凋亡率,定量实时聚合酶链反应（qRT‐PCR）检测ox‐LDL作用HAECs后细胞中miR‐26a的表达水平。在HAECs中过表达miR‐26amimic,MTT和TUNEL染色检测ox‐LDL作用后细胞的活性和凋亡率。构建荧光素酶报告载体pMIR‐PTEN的3′UTR,利用荧光素酶活性检测鉴定miR‐26a的预测靶基因。qRT‐PCR和蛋白质印迹法（Westernblot）分别检测PTEN的mRNA和蛋白表达水平。结果ox‐LDL能够介导HAECs细胞的毒性死亡和细胞凋亡,并且降低了HAECs细胞中miR‐26a的表达水平。过表达miR‐26amimic能够抑制ox‐LDL作用HAECs后细胞的毒性和凋亡。转染miR‐26amimic显著抑制荧光素酶的活性（P＜0．05）。转染miR‐26amimic显著下调HAECs细胞中PTEN的mRNA和蛋白表达水平（P＜0．05）。结论miR‐26a能够抑制抑制ox‐LDL作用HAECs后细胞的毒性和凋亡,其可能的作用机制是下调了PTEN的表达。miR‐26a可能成为治疗凋亡相关的动脉粥样硬化的潜在靶点。     

微小RNA204在人肾透明细胞癌中的表达及临床意义

目的：研究微小RNA204（miR‐204）在人肾透明细胞癌（RCCC）中的表达及临床意义。方法收集泌尿外科行手术切除的RCCC及对应癌旁正常肾脏组织标本共65例,运用qRT‐PCR技术检测miR‐204在RCCC及癌旁组织中的表达水平,统计分析miR‐204表达水平与患者临床病理资料间的相关性;采用人工合成的miR‐204模拟物转染人RCCCCaki‐1细胞,分别采用qRT‐PCR及Western‐Blot检测转染后 miR‐204下游潜在靶点Bcl‐2及SIRT1 mRNA 及蛋白的表达变化。结果 miR‐204在RCCC组织中表达水平显著低于对应癌旁正常肾组织（P＜0．05）;miR‐204低表达与肿瘤体积增大（＞3 cm ,P＜0．05）、肿瘤淋巴结转移（P＜0．05）及高TNM分期（Ⅲ＋Ⅳ期,P＜0．05）显著相关;miR‐204转染人RCCCCaki‐1细胞后可显著降低细胞内Bcl‐2及SIRT1 mRNA及蛋白的表达水平（P＜0．05）。结论 miR‐204在RCCC组织中表达下调并与肿瘤恶性临床病理特征有关, miR‐204可能通过下调Bcl‐2及SIRT1的表达来抑制RCCC的发生、发展过程。     

siRNA沉默Livin基因对乳腺癌MCF-7细胞化学治疗增敏作用的研究

目的：观察小干扰RNA（siRNA）沉默Livin基因对人乳腺癌细胞MCF‐7细胞生物学影响及siRNA沉默MCF‐7细胞Livin基因对4种化学治疗药物的增敏作用。方法 Lipofectamine 2000脂质体转染法转染MCF‐7。分组：空白组（无转染）、脂质体组、反义组、错义组、联合组。MTT法测定氟尿嘧啶（5‐FU）、表柔比星（EPI）、多西紫杉醇（DXT）、吉西他滨（GEM）单药（单药组）对乳腺癌细胞MCF‐7增殖的抑制作用。免疫组织化学检测Livin蛋白在MCF‐7细胞中的表达及转染联合化学治疗药物对Livin蛋白的表达变化。实时荧光定量PCR（RT‐PCR）检测转染Livin siRNA后乳腺癌MCF‐7细胞的Livin基因表达变化。同时利用Annexin‐V检测乳腺癌细胞的凋亡及siRNA Livin联合5‐FU、EPI、DXT、GEM 诱导乳腺癌细胞凋亡的影响。结果 Livin在MCF‐7细胞中高表达,4种化学治疗药物对 Livin表达无明显影响,转染Livin基因48、72 h后联合4种药物后能明显下调Livin蛋白表达,差异有统计学意义（P＜0．05）。5‐FU、EPI、DXT、GEM治疗乳腺癌MCF‐7细胞48、72 h均能明显的引起细胞的凋亡,且呈剂量依赖性。转染Livin基因48 h联合4种药物后乳腺癌MCF‐7细胞的凋亡率明显高于单药处理的细胞,差异有统计学意义（P＜0．01）。结论 siRNA沉默Livin基因能促进由化学治疗药物5‐FU、EPI、DXT、GEM引起的细胞凋亡,具有化学治疗增敏作用。     

miR-335及ROCK1在骨肉瘤中表达及相互关系研究

目的：探讨miR‐335及rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1（ROCK1）在骨肉瘤组织及细胞系中表达的情况及两者的相关性。方法临床选取18例骨肉瘤组织标本及配对正常骨骼肌组织标本;设定人正常成骨细胞为对照组,骨肉瘤细胞系M G‐63和U2‐OS为实验组,RT‐PCR检测骨肉瘤组织与各组细胞中 miR‐335与 ROCK1 mRNA 的表达差异;miR‐335 mimic转染MG‐63和U2‐OS两细胞系,检测miR‐335过表达对 ROCK1 mRNA和蛋白表达的影响。结果 miR‐335在骨肉瘤组织及细胞系中特异性低表达,而ROCK1则呈高表达,两者呈负相关;转染miR‐335 mimic后,miR‐335 mRNA过表达,ROCK1 mRNA和蛋白表达在MG‐63和U2‐OS两细胞系中受到显著抑制。结论 miR‐335与ROCK1表达在骨肉瘤组织学水平和细胞学水平均成负相关;过表达miR‐335可降低ROCK1的表达。     

m iR30a体外干预乳腺癌腋窝肿大淋巴结中肿瘤干细胞相关基因表达和侵袭力的变化

目的：探讨肿瘤干细胞在乳腺癌患者腋窝肿大淋巴结中微转移灶及微小RNA30a（miR30a）对其侵袭能力的影响,初步探讨miRNAs抗乳腺癌治疗的可行性。方法从乳腺癌患者腋窝肿大淋巴结中分离、培养肿瘤干细胞样乳腺癌细胞。合成miR30a寡核苷酸片段,应用腺病毒将该片段转染人原代乳腺癌细胞,同时设乳腺癌MDA‐MB‐231细胞株为试验对照,每组细胞均设空载体组、空白对照组,以荧光显微镜评估转染效率。以 T ransw ell小室体外侵袭试验检测转染前后肿瘤细胞增殖和侵袭力的变化。以Western blot分别检测ALDH1、Vimentin和N‐Cadherin蛋白表达。结果 Transwell小室体外侵袭试验显示空白对照组中原代乳腺癌细胞较 MDA‐MB‐231细胞株侵袭力强,其侵袭指数分别为（75．3±3．2）％,（58．4±2．8）％,两者差异有统计学意义（P＜0．05）,而转染miR30a后这两种细胞体外侵袭力均明显减弱,其侵袭指数分别为（21．4±1．9）％,（28．2±2．3）％,与各自空白对照组相比差异有统计学意义（P＜0．05）。结论乳腺癌患者部分腋窝增生肿大的淋巴结中ALDH表达增高,可能存在肿瘤微转移,术中应完全清扫为宜。miR30a抑制了肿瘤干性基因表达和侵袭能力。     

长链非编码 RNALOC100288637在原发性肝癌中差异性表达的生物学意义及相关机制研究

目的：研究长链非编码 RNA （LncRNA ） LOC100288637在肝癌中的表达差异,对肝癌细胞增殖的影响及相关机制。方法分析GEO数据集GSE58043和GSE10694,得出LOC100288637及hsa‐miR‐101‐3p在肝癌组织中差异表达,RNA‐hy‐brid分析LOC100288637与hsa‐miR‐101‐3p的结合具有可能性。逆转录‐聚合酶链式反应在组织和细胞水平检测LOC100288637表达量。荧光原位杂交观察LOC100288637在细胞中的定位。敲低LOC100288637后CCK‐8检测细胞增殖情况。过表达hsa‐miR‐101‐3p后,检测 LOC100288637的变化。结果 LOC100288637在肝癌组织中的表达量高于癌旁组织（ P＜0．05）;LOC100288637在肝癌细胞系中的表达量高于肝细胞系（P＜0．05）。LOC100288637在 HepG2细胞核质均有表达,以细胞质居多。敲低LOC100288637后 HepG2细胞增殖活性降低（P＜0．01）。过表达hsa‐miR‐101‐3p后,LOC100288637表达量下降（P＜0．05）。结论 LncRNA LOC100288637可能在肝癌发生,发展过程中起重要作用并接受hsa‐miR‐101‐3p靶向调控影响肝癌细胞的增殖。     

干扰LINC00308促进miR-634对前列腺癌细胞增殖与凋亡的影响

【摘要】 目的 研究干扰长链非编码RNA（lncRNA）LINC00308是否通过促进微小RNA（miRNA） 634影响前列腺癌细胞的增殖与凋亡。 方法 实时荧光定量PCR（qRT PCR）检测前列腺癌组织中LINC00308的表达。利用LINC00308小干扰RNA（si LINC00308）转染前列腺癌细胞PC 3M和DU145，构建干扰LINC00308的细胞，采用qRT PCR检测LINC00308和miR 634的表达水平，流式细胞术评估细胞的周期与凋亡，蛋白质印迹法（Western Blot）检测细胞核相关抗原Ki67（Ki67）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）蛋白的表达。starBase在线工具预测结合双荧光素酶报告实验分析LINC00308对miR 634的靶向调控。在PC 3M和DU145细胞中转染miR 634 mimic，利用上述方法检测miR 634在细胞增殖凋亡中的作用。 结果 前列腺癌组织中的LINC00308表达水平明显高于癌旁组织（P＜005）。干扰LINC00308显著提高PC 3M和DU145细胞的miR 634的表达水平、G0 G1期细胞比例、细胞凋亡率和Caspase3蛋白水平，明显降低S期细胞比例、Ki67蛋白水平（P＜005）。LINC00308靶向调控miR 634的表达。转染miR 634 mimic显著增加PC 3M和DU145细胞的G0 G1期细胞比例、凋亡率和Caspase3蛋白水平，明显减少S期细胞比例和Ki67蛋白水平（P＜005）。 结论 干扰LINC00308可以促进miR 634的表达，阻滞前列腺癌细胞周期，并诱导细胞凋亡。     

survivin反义寡核苷酸转染对人乳腺癌细胞系MCF 7生长及对长春瑞滨的增敏作用

目的探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对乳腺癌细胞系MCF 7的诱导凋亡、抑制增殖和对长春瑞滨的增敏作用。方法采用脂质体介导survivin ASODN转染乳腺癌细胞系MCF 7,半定量RT PCR方法检测survivin基因mRNA表达,Western blot方法检测survivin基因蛋白表达,AnnexinⅤ/PI双染法通过流式细胞仪检测细胞凋亡率变化,PI染色通过流式细胞仪检测细胞周期时相变化,MTT比色法检测转染细胞的生长抑制情况及对长春瑞滨的敏感性,电镜观察反义转染对乳腺癌细胞系MCF 7的凋亡诱导作用。结果survivin反义复合物下调MCF 7细胞的survivin mRNA和蛋白表达,并呈剂量依赖性。细胞周期被阻滞于G2/M期,细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）,反义组细胞生长抑制率明显上升（P＜0.05）。透射电镜下转染组细胞呈凋亡晚期变化。600?nmol/L反义转染组长春瑞滨的IC50值为(3.7±0.42)μg/mL,正常组为(7.1±0.68)μg/mL,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论survivin反义寡核酸可有效下调MCF 7的survivin mRNA及蛋白表达水平,抑制增殖,诱导凋亡,并增强其对化疗药物长春瑞滨的敏感性。     

microRN A-141在结肠癌中的表达分析研究

目的：分析microRNA141（miR‐141）在结肠癌组织中的表达及意义。方法采用荧光定量 PCR（SYBR Green）法检测48例结肠癌组织和对应癌旁正常组织中miR‐141的表达。结果 miR‐141在结肠癌组织中的相对表达量为5．19±0．52,与对应癌旁正常组织1．01±0．13比较差异有统计学意义（P＜0．05）;随着结肠癌分化程度的降低结肠癌组织中miR‐141的表达增高;miR‐141在淋巴结转移组的相对表达量为6．05±0．14,在淋巴结无转移组中为4．30±0．23,差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论 miR‐141高表达可能与结肠癌的分化程度和淋巴结有无转移有关。miR‐141的出现为结肠癌的研究提供了新的切入点。     

人乳腺癌细胞微球体生物学特性研究

目的：研究人乳腺癌细胞微球体（MSs）的生物学特性,建立乳腺癌干细胞实验模型。方法无血清悬浮培养人乳腺癌MCF‐7细胞（MCF‐7组）,并获取MSs（MSs组）。利用细胞划痕实验、transwell实验及动物成瘤实验检测MSs在细胞迁移、侵袭性生长及体外成瘤等方面的生物学特性。结果细胞划痕实验提示：MSs组划痕带可在48 h后愈合,而MCF‐7组划痕带在48 h后未能愈合;transwell实验提示MSs组中可见到（76．24±0．35）个细胞通过生物膜,而MCF‐7细胞组中为（17．38±0．18）个（P＜0．05）;动物成瘤实验提示：MSs在成瘤速度及移植瘤体积方面均强于MCF‐7细胞。结论 MSs具有极强的迁移、侵袭性生长及动物体内成瘤的能力,可作为实验模型应用于乳腺癌干细胞相关研究中。     

shRNA抑制survivin基因表达对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的：研究靶向存活素（survivin）的短发夹 RNA真核表达质粒（shRNA）对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响。方法合成靶向survivin的shRNA真核表达质粒及阴性对照质粒,用脂质体法将质粒转染至经 VEGF（50 ng／mL）处理的HUVEC细胞;转染48 h后,采用实时定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白印迹法检测 HUVEC中survivin的mRNA表达及蛋白水平。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖;TUNEL 法检测细胞凋亡。结果（1）survivin‐shRNA 质粒试验组与阴性对照shRNA质粒组及空白对照组比较,转染48 h后人脐静脉血管内皮细胞survivin的mRNA及蛋白表达水平明显下降（P＜0．05）。（2）与阴性对照shRNA组及空白对照组比较,转染后的人脐静脉血管内皮细胞增殖能力明显下降。转染后24、48、72 h生长抑制率分别为（13．53±3．91）％、（38．97±1．82）％、（65．75±1．83）％,于转染后72 h最为显著。（3）试验组凋亡率为（28．07±1．71）％,较阴性对照组（11．45±1．52）％和空白对照组（10．04±1．46）％显著增高（P＜0．05）。结论靶向survivin的shRNA质粒能通过下调survivin表达,进而抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖并促进其凋亡。     

胃癌组织中NRP-1的表达与临床病理特征及预后的相关性

目的：检测胃癌组织中神经纤毛蛋白‐1（NRP‐1）的表达,分析其与胃癌临床病理特征之间的关系,探讨其对判断胃癌预后的价值。方法回顾性分析168例胃癌患者的临床病理资料及预后情况,采用免疫组化法检测癌组织及相对正常组织NRP‐1的表达,研究 NRP‐1的表达与临床病理及预后之间的关系。结果（1）NRP‐1在胃癌组织中表达高于相对正常组织（66．7％ vs ．8．33％,P＜0．05）。（2）NRP‐1的表达与肿瘤大小、细胞分化程度、浸润深度、淋巴结转移及 TNM 分期有关（P＜0．05）。（3）NRP‐1高表达的患者的生存期短于低表达的患者（中位生存期28个月 vs ．64个月,P＜0．05）。（4）COX比例风险模型进行多因素分析表明,NRP‐1的表达为影响胃癌预后的独立危险因素（P＜0．05）。结论（1）NRP‐1在胃癌的发生、发展中起到重要作用,与胃癌的恶性生物学行为密切相关。（2）NRP‐1高表达提示预后不良。（3）NRP‐1有望作为判断胃癌生物学行为和预后的参考指标。     

糖尿病肾病患者血清miRNA377的表达及其对SM AD信号通路调控作用

目的：探索糖尿病肾病（DN）患者血清miRNA377（miR377）的表达特点及其可能的下游调控通道。方法用实时荧光定量PCR方法检测经肾活检确诊的DN组、糖尿病无肾病损害（DM ）组和健康人群（对照组）血清中miR377的相对表达量,用TargetScan等生物信息学的方法预测miR377调节的靶基因,并在体外细胞模型中上调miR377的表达,检测下游机制蛋白。结果 DN组（1．32±0．13）和DM 组（0．92±0．11）患者血清中miR‐377均高于对照组（0．33±0．06）,差异有统计学意义（P＜0．01）;生物信息学分析显示为糖尿病肾病中miR377的靶基因为SMAD ;Western blot结果显示,转染miR377 mimics组HMC细胞中SMAD2和SMAD3蛋白的表达量均高于miR377 NC组和对照组（P＜0．05）,而SMAD7在各组中表达量无明显差异（P＞0．05）。结论糖尿病肾病患者血清的miR377存在异常高表达,可能预示肾脏病变的程度。     

宫颈癌全外显组测定及易感基因研究

目的：临床研究微小RNA‐96（MiR‐96）、缺氧诱导因子‐1α（HIF‐1α）、Twist与Slug等易感基因在宫颈癌中的表达水平。方法选择2010年3月至2014年5月在该院就诊的宫颈癌患者128例为观察组,同时选择健康者100例作为对照组。测定MiR‐96、HIF‐1α、Twist与Slug等在宫颈癌组织中的表达水平。（1）HIF‐1α：采用HIF‐1α试剂盒对单克隆抗体HIF‐1α进行检测,按照试剂盒的要求进行染色及制备组织标本,显微镜下观察阳性细胞率大于10％者为阳性;（2）MiR‐96、Twist与Slug：用Trizol试剂按照试剂盒的说明提取总RNA,将RNA进行反转录,通过PCR定量检测MiR‐96、Twist与Slug的相对表达值。结果（1）HIF‐1α在正常组织中无阳性表达,而在肿瘤组织中阳性表达率远高于正常组织,两组比较差异有统计学意义（P＜0．05）;（2）MiR‐96在肿瘤组织中的相对表达值远高于正常组织,两组比较差异有统计学意义（P＜0．05）;（3）Twist与Slug基因在肿瘤组织中的相对表达量远高于正常组织,两组比较差异有统计学意义（P＜0．05）。结论与正常组织相比,MiR‐96、HIF‐1α、Twist与Slug基因在肿瘤组织中有显著的高表达。     

乳腺癌细胞中miR-1246、ZO-1、vimentin的表达及相关性研究

目的 检测miR-1246、ZO-1、vimentin在乳腺正常上皮细胞MCF10A和乳腺癌癌细胞MCF7、MDA-MB-231中的表达,并探讨miR-1246在促进乳腺癌上皮-间质化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用。 方法 用荧光定量PCR法检测乳腺正常上皮细胞MCF10A、乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231中miR-1246的相对表达量,用免疫印迹法检测乳腺正常上皮细胞MCF10A、乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231中紧密连接蛋白ZO-1、波形蛋白vimentin的表达情况。采用SPSS 16.0统计软件分析,用U检验、t检验和Spearman相关分析分析数据。 结果 miR-1246和ZO-1在恶性乳腺癌细胞中的表达明显降低(P＜0.05),vimentin在恶性乳腺癌细胞中的表达明显增加(P＜0.05),miR-1246与ZO-1表达呈正相关(r=0.940,P＜0.05),miR-1246与vimentin表达呈负相关(r=-0.714,P＜0.05)。 结论 miR-1246表达水平与EMT标志物ZO-1、vimentin的表达水平存在一定的相关性,提示miR-1246在促进乳腺癌EMT过程中扮演重要角色。