HCV定量RT—PCR竞争性参比标准的构建

将克隆的ＨＣＶ５‘ＮＣＲ序列反向插入ｐＳＰ７２的Ｅｃｏ ＲＶ切点，构建一种能转录ＨＣＶ－ＲＮＡ的质粒ｐＳｎｃ－２。以ＲＴ－ＰＣＲ从抗ＨＥＶ ＩｇＭ阳性病人血浆中扩增一段２３８ｂｐ的ＨＣＶ－ｃＤＮＡ反向插入ｐＳｎｃ－２中克隆的５’ＮＣＲ序列的ＮｃｏＩ切点，构建插入突变型ＨＣＶ－ｃＤＮＡ重组体ｐＳｎｃ－ｅ。     

HCV5’－NCR序列克隆和转录重组质粒构建

选取ＩＶ基因型ＨＣＶ及中国和台湾代表株ＨＣＶ的５’ＮＣＲ区保守序列合成引物，以ＲＴ－ＰＣＲ从输血后非甲非乙型肝炎病人血浆中扩增一段３００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段作目的基因，钝端插入ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ切点，构建了ｐＵＨＣＶ－ＮＣ重组质粒。对ｐＵＨＣＶ－ＮＣ分别或混合应用ＨＣＶ序列特异的内外引物和载体序列特异的通用引物进行ＰＣＲ扩增，所用产物分子量均同预期相符；酶切分析查出ＨＣＶ基因所带有和克隆位点融合所产生的两个外源ＮｃｏＩ切点也存在；证实ｐＵＨＣＶ－ＮＣ中克隆基因是ＨＣＶ的５’ＮＣＲ序列且插入方向为反向。应用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双切出克隆ＨＣＶ基因，粘端插入ｐＳＰ７２的多克隆位点，均建了ｐＳＨＣＶ－ＮＣ转录重组体，对之进行了ＰＣＲ和酶切鉴定。     

丙肝病毒非结构蛋白基因3的克隆及其体外诱导表达

目的：研究丙型病毒非结构蛋白基因３（ｎｓ３基因）在体外真核细胞中的诱导表达。方法：以ＰＣＲ方法从含ＨＣＶｎｓ３基因的重组载体ｐＢｎｓ３中扩增出ｎｓ３基因,并将其插入到克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ中,再与表达载体ｐＭＳＧ重组,以利到重组表达载体ｐＭＳＧ－ｎｓ３。然后采用磷酸钙沉淀法将其转染哺乳动物ＣＨＯ细胞,经地塞米松（ＤＭ）诱导,采用ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ技术检测ＮＳ３蛋白的表达水平。结果：     

庚型肝炎病毒NS5非结构蛋白在昆虫细胞中的表达

目的;研制特异的抗ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ抗体诊断试剂。方法：ＰＣＲ扩增ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ ＮＳ５基因片段并定向克隆至转座载体ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａ,转化ＤＨ１０Ｂａｃ感受态细胞,３７℃振荡培养４ｈ使发生转座,于三抗选择平皿筛选重组ｂａｃｍｉｄ。脂质体介导转染ｓｆ９细胞,将转染上清再次感染ｓｆ细胞,以批量表达ＮＳ５重组蛋白。利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法分析,检测重组蛋白。结果：序     

HCV 定量 RT-PCR 竞争性参比标准的构建

将克隆的ＨＣＶ５’ＮＣＲ序列反向插入ｐＳＰ７２的ＥｃｏＲＶ切点，构建一种能转录ＨＣＶ－ＲＮＡ的质粒ｐＳｎｃ－２。以ＲＴ－ＰＣＲ从抗ＨＥＶＩｇＭ阳性病人血浆中扩增一段２３８ｂｐ的ＨＣＶ－ｃＤＮＡ，反向插入ｐＳｎｃ－２中克隆的５’ＮＣＲ序列的ＮｃｏⅠ切点，构建插入突变型ＨＣＶ－ｃＤＮＡ重组体ｐＳｎｃ－ｅ。应用限制性酶切和ＰＣＲ对这两种重组质粒进行了鉴定，为ＨＣＶ－ＲＮＡ的定量ＰＣＲ提供有用的内参照模板。     

疱疹病毒I型中国株胸苷激酶基因治疗脑瘤的临床前研究

目的验证胸苷激酶（ＴＫ）基因介导的羟甲基无环鸟苷（ＧＣＶ）系统对人脑恶性神经胶质瘤基因治疗的有效性及安全性。方法从中国疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ－Ｉ）株（１７）中分离了胸苷激酶（ＴＫｃ）基因，并作了ＤＮＡ序列分析，组建了含ＴＫｃ基因的逆转录病毒重组载体（ｐＬＴＫｃＳＮ）及其含ｐＬＴＫｃＳＮ病毒的病毒生产细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）。体外有效性试验：应用ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ与大鼠脑瘤Ｃ６细胞共培养后用ＧＣＶ处理。体内有效性试验：以ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ原位注入大鼠颅内移植的Ｃ６脑瘤。安全性试验：通过小鼠、大鼠和猴植入ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ并注射ＧＣＶ观察其毒副作用。结果ＨＳＶ－ＩＴＫｃ基因与ｐＯＰＦＨＳＶ－１ＴＫ基因比较有５个核苷酸和２个氨基酸的变异。ｐＬＴＫｃＳＮ及其ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ，在体内外能有效地介导ＧＣＶ对Ｃ６产生细胞毒作用。其病毒滴度为２×１０６ＣＦＵ／ｍｌ。经过４８只小鼠、２４只大鼠和６只猴体内未见严重毒副作用和不可逆的病理改变。结论疮疹病毒胸苷激酶基因治疗脑肿瘤是有效和安全的，通过药审后可用于临床试验。     

HCVE＿2／NS＿1基因的PCR检测克隆与序列分析

本文报道了利用ＰＣＲ技术检测了３４例丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因的ｃＤＮＡ并与５’非编码区基因的ｃＤＮＡ检测技术进行了比较，应用ｐＵＣ１８质粒对此扩增片段进行了克隆与序列分析，结果表明克隆片段ＨＣＶ－Ｓ１为我国主要流行的ＨＣＶ基围亚型－ＩＩ型，其与ＨＣＶ－ＩＩ型的核苷酸与氨基酸的同源性均在９０％以上，序列分析表明该片段富含脯氨酸和胱氨酸，可能具有复杂的空间构型，且与４个糖基化位点一样保持稳定，另外，在ＨＣＶ－Ｓ１片段的３’端有一３６个核苷酸的区域，其变化可能具有型特异性     

H—2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的 克隆Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 ＲＴ－ＰＣＲ法扩增Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ,克隆入双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ,ＰＡ３１７包装出重组病毒后,分别感染ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７及ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因表达,ＦＡＣＳ分析Ｈ－２Ｋ＾ｂ在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ介导,分别建立了Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因转导细胞：ＮＩＨ３Ｔ     

HCV E2／NS1基因的PCR检测克隆与序列分析

本文报道了利用ＰＣＲ技术检测了３４例丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因的ｃＤＮＡ并与５非编码区基因的ｃＤＮＡ检测技术进行了比较，应用ｐＵＣ１８质粒对此扩增片段进行了克隆与序列分析，结果表明克隆片段ＨＣＶ－Ｓ１为我国主要流行的ＨＣＶ基因亚型－ＩＩ型，其与ＨＣＶ－ＩＩ型的核苷酸与氨基酸的同源性均在９０％以上，序列分析表明该片段富含脯氨酸和胱氨酸，可能具有复杂的空间构型，且与４个糖基化位点一样保持稳定，另外，     

携带HSV－tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因（ｐｇｋ）启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ｐＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮｐ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ｐＧＥＭ．７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ｐＭＮｐ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建成人肝癌特异型ｐＭＮＡＰ－ｔｋ逆转录病毒载体。结论：该载体对肝癌特异性前药转换基因治疗有重要意义。     

分泌抗丙型肝炎病毒NS5a蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立及应用

制备抗丙型肝炎（丙肝）病毒（ＨＣＶ）－ＮＳ５ａ重组蛋白的单克隆抗体（单抗），并探讨其在临床诊断中的应用价值。方法通过常规细胞融合技术制备分泌单抗的杂交瘤细胞株，用含该杂交瘤细胞的腹水对石蜡包埋肝组织细胞中的ＨＣＶ－ＮＳ５ａ抗原进行免疫组化测定，同时用抑制法检测６７例丙肝血清中的ＨＣＶＮＳ５ａ和ＮＳ３抗体分布，并与ＮＳ３单抗的结果进行比较。结果融合后的阳性克隆中筛选出４株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株，命名为８Ｂ２，６Ｆ１１，４Ｃ６和７Ｄ９。这４株单抗与ＮＳ５ａ抗原有良好的反应性；与ＨＣＶ核心区多肽，ＮＳ３区表达多肽及乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的表面抗原均无反应。免疫组织化学检测显示，在ＨＣＶ感染肝组织中，ＮＳ５ａ抗原阳性占５４．９％（１７／３１），而ＮＳ３抗原阳性占５１．６％（１６／３１），抗原分布多呈包涵体分布，少数病例为胞浆型，１例ＮＳ５抗原呈核型表达。在６７例抗ＨＣＶ阳性血清中，ＮＳ５抗体阳性４０例，占５９．７％，而ＮＳ３阳性４７例，占７０％。结论此法制备的单抗有强特异性，在开展ＨＣＶ免疫组织化学研究上具有广阔应用前景。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因的扩增、克隆和测序

目的：对单纯疱疹Ⅰ型胸苷激酶基因扩增、克隆和测序．方法：从单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１）１７ｓｙｎ＋株感染的ＢＨＫ２１细胞上清液中提取ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ，以此为模板，用ＰＣＲ方法扩增胸苷激酶（ＴＫ）．将扩增的片段克隆入载体ｐＵＣ１８中，并进行测序．结果：除终止码外，ＨＳＶ－１ＴＫ基因全部编码区为１１２８ｂｐ，编码３７６个氨基酸，其中含１２个蛋氨酸，４个半胱氨酸．ＴＫ的第２４９和２５０位氨基酸残基分别为Ｌｅｕ和Ｇｌｎ，其相应密码子为ＣＴＧ，ＧＡＧ，构成１个ＰｓｔＩ位点，第３１３和３１４氨基酸残基分别为Ａｓｐ和Ｖａｌ，其相应密码子为ＧＡＣ和ＧＴＣ，构成另一个ＰｓｔＩ位点．结论：本研究扩增出了ＨＳＶ－１ＴＫ基因的全部编码区序列     

一株庚型肝炎病毒NS3区和NS5区部分基因序列的分析

用ＲＴ－ＰＣＲ的方法从非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病人血清中检测到一株庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）。其中扩增ＮＳ３区基因采用５６例循环周期减温ＰＣＲ方法；扩增ＮＳ５区基因采用３５个循环周期的正常ＰＣＲ方法。并对其ＰＣＲ产物进行了克隆测序。在ＮＳ３区，样品与ＧＢＶ－Ｃ和ＨＧＶ的核苷酸序列同源性分别为８４．２％和８９．９％；而在ＮＳ５区样品与ＨＢＶ－Ｖ和ＨＧＶ的核苷酸同源性分别为９４．９％和９８．     

单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因Stocker株的分子克隆及序？…

根据已发表的单纯疱疹病毒Ｉ型ＣＬ１０１株胸苷激酶基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以ＨＳＶ－Ｉ Ｓｔｏｃｋｅｒ株核酸为模板,应用ＰＣＲ技术扩增出１．４２７Ｋｂ大小的片段,并将此片段克隆载体ｐＵＣ１１９中,通过酶切和序列分析证明含完整的ＴＫ基因序列,此序列与ＣＬ１０１株ＴＫ基因的核苷酸序列一致性为９９．０％,氨基酸的一致性为９７．６％,此基因的成功克隆为进一步研究了ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ系统在肿     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

HCV 5‘—NCR序列克隆和转录重组质粒构建

选取ＩＶ基因型ＨＣＶ及中国和台湾代表株ＨＣＶ的５’ＮＣＲ区保守序列合成引物，以ＲＴ－ＰＣＲ从输血后非甲非乙型肝炎病人血浆中扩增一段３００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段作目的基因，钝端插入ｐＵＣ１９的Ｓｍａ１切点，构建了ｐＵＨＣＶ－ＮＣ重组质粒。对ｐＵＨＣＶ－ＮＣ分别或混合应用ＨＣＶ序列特异的内外引物和载体序列特异的通用引物进行ＰＣＲ扩增，所得产物分子阳均同预期相符；酶切分析查出ＨＣＶ基因所带和克隆位点融合所产     

Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2／N21基因的克隆与序列分析

目的 构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的真核表达载体,分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法 利用逆转 录套式ＰＣＲ扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２／ＮＳ１基因片段,通过定向克隆将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果 构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的克隆,该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｊ６     

丙型肝炎病毒NS_5区基因片段的克隆与表达

应用ＲＴ一ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区ＨＣＶ感染者血清中获得ＨＣＶＮＳ＿５区的基因克隆。经核苷酸序列的比较分析，此克隆片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。应用ＰＭＡＬ－ＣＲＩ质粒在大肠杆菌中高效表达了此基因片段，并获融合蛋白ＭＢＰ－ＨＣＶ·ＮＳ＿５，经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析证实该融合蛋白有较特异的ＨＣＶ抗原性，可用于ＨＣＶ感染的临床诊断和发病机制的研究。     

酶联免疫吸附试验检测HCV NS3-4A蛋白酶活性

目的 建立一种检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ３－４Ａ丝氨酸蛋白酶的酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）方法,用于筛选ＨＣＶ蛋白酶抑制剂。方法 将闰ｐＭＡＬ－ｃ２／ＮＳ３－４Ａ转化到大肠杆菌Ｋ１２ＴＢ１中,经ＩＰＴＧ诱导表达,亲和层析柱纯化后得到麦芽糖结合的ＮＳ３／ＮＳ３－４Ａ融合蛋白,用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析其免疫学活性,并以酶联免疫吸附试验检测其生物学活性。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析并用考马     

丙型肝炎患者肝组织中病毒抗原检测

目的研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）抗原在患者肝组织中的分布状况及其相互关系。方法采取免疫组织化学方法，用多克隆抗－ＨＣＶ和单克隆抗－ＨＣＶ－ＮＳ３、抗－ＨＣＶ－ＮＳ５，对１０７例ＨＣＶ感染患者肝组织中ＨＣＶ抗原进行检测。结果应用三种抗体均从ＨＣＶ患者肝组织中检出相应抗原，检出率分别为３８．３％，２８．０％和５２．３％；阳性颗粒定位于肝细胞浆；阳性细胞分布呈散在、弥漫状和簇状；ＨＣＶ－ＮＳ３的表达与炎症反应无明显解剖学关系，ＨＣＶ－ＮＳ５阳性细胞较常见位于炎症灶旁或灶中。结论ＨＣＶ各成分在肝组织中的表达水平存在差别；ＨＣＶ－ＮＳ５的表达可能与ＨＣＶ的致病机制有关。