人神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的：构建携带人神经生长因子（ｈ Ｎ Ｇ Ｆ） 基因的真核细胞表达载体,为应用 Ｎ Ｇ Ｆ 进行老年性痴呆（ Ａ Ｄ） 等疾病基因治疗打基础。方法：应用基因重组技术将ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,用限制性内切酶酶切分析重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 中ｈ Ｎ Ｇ Ｆ基因的插入方向,用 Ｐ Ｃ Ｒ、斑点杂交和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交对重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 作进一步鉴定。结果：ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ已正确地克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,而构建成重组逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ。结论：真核细胞表达载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 的成功构建,为进一步开展 Ｎ Ｇ Ｆ基因治疗 Ａ Ｄ 等中枢神经系统疾病奠定了基础。     

构建人CD23及其反义RNA的逆转录病毒表达重组体

利用ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因克隆ｐＵＣＤ９７６，分别以限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ酶切该重组质粒ＤＮＡ，回收１．０ｋｂ的ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因、ＨｉｎｄⅢ酶切后回收３’端６０７ｂｐ的结合区段基因以及ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅡ酶切回收５’端４０３ｂｐ的调控区段基因。将各回收片段先以Ｋｌｅｎｏｗ酶补平后，插入已补平的ｐＺＩＰ逆转录病毒载体ＢａｍＨⅠ单切点，利用地高辛素标记的ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因探针，以斑点核酸杂交筛选逆转录病毒重组体，结合用限制性内切酶ＢａｍＨＩ和／或ＢｇｌⅡ酶切鉴定插入方向，最终获得正、反向插入的ＣＤ２３全基因－逆转录病毒重组体各２个，反向插入３’端和５’端部分基因片段的重组体分别为４个和１个。为进行ＣＤ２３反义ＲＮＡ的研究和真核表达ＣＤ２３提供了可靠的物质基础。     

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因应用于基因治疗。构建，包装含ＣＤ基因的假型逆转录病毒。构建含ＣＤ基因的逆转录病毒重组表达载体ＰＬＣＤＳＮ基础上，以重组表达载体ＰＬＣＤＳＮ转染包装细胞ＰＡ３１７，ＰＬＣＤＳＮ整合人ＰＡ３１７染色 。结果：ＣＤ基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒染ＮＩＨ／３Ｔ３细胞，逆转录病毒重组表达载体ＰＬＣＤＳＮ整合入ＮＩＨ／３Ｔ３细胞染色体     

铜锌超氧化物歧化酶基因对HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）对肝癌细胞增殖的抑制作用。方法：利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术，将人铜锌ＳＯＤ基因导入人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２细胞内，获得高表达。检测其对ＨｅｐＧ２细胞生物学特性的影响。结果：与对照相比ＳＯＤ基因转染后的肝癌细胞生长受到抑制，细胞体积变大，分裂象减少，Ｓ期细胞比率减少，软琼脂集落形成率低，裸鼠成瘤瘤体小。结论：铜锌ＳＯＤ基因具有抑制ＨｅｐＧ２肝癌细胞增殖的作用。     

人白介素10逆转录病毒表达载体的构建

目的构建一个人白介素10(hIL-10)逆转录病毒表达载体,为研究hIL-10的生物学活性打下基础.方法用限制性内切酶消化提取质粒pCDHIL-10中hIL-10全长cDNA,采用定向克隆的方法将hIL-10基因插入逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点中,经转化、扩增、限制性内切酶消化,电泳鉴定分析.结果外源性hIL-10基因成功插入到逆转录病毒载体pLXSN的中.结论成功完成了人白介素10(hIL-10)逆转录病毒表达载体的构建,为今后进一步研究hIL-10的生物学活性打下了基础.     

铜锌超氧化物歧化酶基因对HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）对肝细胞癌增殖的抑制作用。方法：利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术，将人铜锌ＳＯＤ基因导入人肝细胞系ＨｅｐＧ２细胞内，获得高表达，检测其对ＨｅｐＧ２细胞生物学特性的影响，结果：与对照组相比，ＳＯＤ基因转染后的肝癌细胞生长受到抑制，细胞体积变大，分裂象减少，Ｓ期细胞比率减少，软琼脂集落形成率低，裸鼠成瘤瘤体小。结论：铜锌ＳＯＤ基因具有抑制ＨｅｐＧ２肝癌细胞增殖的作     

抗人TGFα发夹状核酶基因逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

构建抗和ＴＧＦα核酶基因逆转录病毒表达载体。方法；用二异丙基亚磷酰胺法合成抗人ＴＧＦα核酶基因的两条互补单链，将其退火后克隆ｐＵＣ１８，用ＥｃｏＲＩ及ＢａｍＨＩ切下该基因，定向克隆人逆转录病毒表达载体ｐＤＯＲ。结果；酶切后经琼脂糖凝主聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，所构建重组克隆载体ｐＵＣ１８ＴＲＺ及重组表达载体ｐＤＯＲＴＲＺ正确。     

人NT-3重组逆转录病毒载体及稳定包装细胞系的构建及鉴定

构建并鉴定携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系。方法 :用DNA重组技术将人NT - 3定向克隆入逆转录病毒载体 pLXSN ,并用限制性内切酶进行酶切鉴定 ;磷酸钙转染方法将重组的逆转录病毒转染入包装细胞系PA317,G4 18筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果 :构建的重组逆转录病毒载体可以被限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ切开 ,电泳分离显示两条阳性条带 ,分别出现于 0 .8kb和 5 .9kb处 ;重组载体转染包装细胞 ,经G4 18筛选 ,可形成抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 4× 10 5cfu/ml,提示构建携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系成功。结论 :构建携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对神经系统疾病进行基因治疗的方法。     

人midkine基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建人中期因子(MDK)基因重组逆转录病毒载体,转染人胃癌SGC7901细胞株,为探讨MDK的生物学功能奠定基础.方法 扩增人MDK编码序列基因片段,经限制性内切酶酶切后将目的 片段插入pLXSN逆转录病毒载体.经酶切及测序鉴定后与pVSVG共转染GP293包装细胞,收集病毒上清感染人胃癌SGC7901细胞,G418筛选获得阳性细胞株.,结果酶切及DNA测序证实MDK基因重组逆转录病毒载体构建正确.病毒上清感染SGC7901细胞,G418筛选出阳性克隆,经实时定量PCR及Western blot检测发现SGC7901细胞中MDK mRNA及蛋白表达水平明显上调.结论 成功构建了高表达MDK的SGC7901细胞株,为进一步探讨其生物学功能奠定实验基础.     

人表皮生长因子真核表达载体的构建

目的：构建人表皮生长因子的真核表达载体。方法：采用RT-PCR扩增人表皮生长因子(hEGF)cDNA基因序列并克隆入PGEM-T载体,再用限制性内切酶切取目的基因,插入pcDNA3．1真核表达载体。结果：重组体经转化E．coli JM109感受态大肠杆菌后可大量扩增,提取重组体进行限制性酶切及PCR可见目的片段。结论：已成功构建hEGF真核表达载体,为进一步研究hEGF的功能奠定了基础。     

介导人血红素加氧酶-1基因的重组腺相关病毒载体的构建

目的:构建含人血红素加氧酶-1(hHO-1)基因的重组腺相关病毒(AAV)载体并进行鉴定。方法:利用基因重组技术,采用限制性内切酶HindⅢ从质粒XM-6/hHO-1中将目的基因hHO-1基因片段切出,克隆到质粒PAAV-MCS的HindⅢ位点中,构建重组质粒pAAV-hHO-1,采用限制性内切酶酶切,PCR和DNA测序鉴定。结果:PCR扩增出1 317 bp大小的片段,酶切鉴定证实插入位点及方向与预期的完全一致;测序证实hHO-1与Gene Bank提供的原始序列完全一致。结论:成功构建了含hHO-1基因的重组腺相关病毒载体,为缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。     

慢性粒细胞白血病MGMT基因的克隆及逆转录病毒表达载体的构建

目的：从慢性粒细胞白血病病人外周血中克隆人MGMT基因，并进行逆转录病毒表达载体的构建。方法：用RT－PCR方法从慢性粒细胞白血病病人外周血白细胞中克隆得到长为684bp MGMTcDNA。将该片段与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5后得到重组质粒pGEM-T-MGMT，进行限制性内切酶酶切分析、PCR及测序鉴定。再将MGMTcDNA亚克隆到GlNa逆转录病毒载体EcoRI和xhoI位点之间，并进行酶切、PCR鉴定。结果：成功克隆了人MGMT基因，经酶切分析、PCR初步筛选及测序鉴定证实序列正确，并成功构建到逆转录病毒载体上。结论：通过克隆人MGMT基因，并构建逆转录病毒载体GlNa-MGMT，为探讨将耐药基因导入造血干细胞对烷化剂类化疗药物抗性的研究奠定了基础。     

胰腺癌反义K-ras癌基因片段的分离和克隆

目的：分离及克隆胰腺癌基因组中K—ras基因片段，构建重组反义K—ras癌基因逆转录病毒载体，并探讨其意义。方法：设计2对PCR引物，分别在上下游引物中引进BamHI和EoRI位点，以胰腺癌细胞株BxPC-3基因组DNA为模板扩增K—ras基因外显子1及侧翼序列，并采用重组DNA技术将目的基因插入逆转录病毒载体LZRSpBMN—Z中，并经菌液PCR和限制性内切酶酶切鉴定。结果：K—ras基因外显子1及侧翼序列已成功地克隆入LZRSpBMN—Z中。结论：LZRSpBMN—Z是胰腺癌反义基因治疗中新型候选载体之一。应用PCR方法获取反义K—raS目的基因外显子1方便可行，可用于重组反义K—ras癌基因逆转录病毒载体的构建。     

切割bcl─2RNA核酶的逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的：构建逆转录病毒载体介导的切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ的核酶（ＲＺ）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的ＲＺ基因，先克隆于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的ＨｉｎｃⅡ位点，命名为３ＺＲＺ（＋）／（－），用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法进行测序，体外转录，进行体外切割反应．ＲＺ基因酶切回收后，定向克隆于逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中．结果：ＲＺ基因序列正确，具有切割活性，经酶切鉴定ＲＺ基因已被克隆于ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ位点，重组逆转录病毒载体命名为ｐＤＲＺ－ＲＺ．结论：体外合成ＲＺ基因后，可定向克隆逆转录病毒载体，为细胞内合成ＲＺ提供了手段     

肝细胞生长因子原核表达载体PUC18-HGF的构建及鉴定

目的　构建人肝细胞生长因子 (hHGF)的原核表达载体。方法　利用基因重组技术 ,将人肝细胞生长因子cDNA全长序列 ,定向克隆于表达型载体PUC18质粒的多克隆位点中 ,限制性内切酶酶切鉴定。结果　重组PUC18-HGF原核表达载体经限制性内切酶电泳分析 ,与理论值相符。结论　本实验成功将人肝细胞生长因子cDNA全长序列插入表达型载体PUC18多克隆位点BamHI和Xbal限制性内切酶位点之间 ,为通过基因工程获得外源性HGF提供实验依据     

3D_5卵巢癌抗独特型单链抗体基因克隆及表达

目的：降低３Ｄ＿５抗独特型抗体鼠源性，促进临床应用。方法：用ＰＣＲ及基因重组技术，扩增并构建单链可变区抗体基因，与表达载体连接后转化大肠杆菌。结果：ＥＬＩＳＡ检测３７个克隆，其中１７个表达产物与相应抗体呈特异免疫反应；重组体限制性内切酶酶切分析及ＰＣＲ扩增均见特异ＤＮＡ条带。结论：克隆表达了３Ｄ＿５抗独特型单链抗体基因，为进一步人源化改造奠定了基础。     

HLA-G5-IgGFc融合蛋白真核表达载体的克隆及鉴定

目的构建人HLA-G5-IgGFc融合蛋白真核表达载体。方法经重组PCR将HLA-G5和IgGFc基因拼接并插入T载体。鉴定后,双酶切得到融合基因并插入真核表达载体pcDNA3.1。结果PCR、限制性内切酶酶切和序列分析表明已构建pcDNA3.1-HLA-G5表达载体。结论成功构建了HLA-G5-IgGFc段融合蛋白真核表达载体。     

含AFP启动子腺病毒载体构建的基础研究

[目的]为提高基因治疗载体的靶向性,在现有的溶瘤性腺病毒基础上,应用细菌内同源重组方法构建含AFP启动子和E1A基因的条件复制性腺病毒载体。[方法]应用限制性内切酶以及体外重组技术获取目的片段AFP—AP—IRES—E1Am并进行重组质粒的筛选;将目的片段插入Pshuttle穿梭质粒中;重组的Pshuttle质粒应用PmeI线性化,与含腺病毒骨架DNA、删除了腺病毒E1、E3区的pAdEasyl质粒在BJ5183大肠杆菌细胞中同源重组形成新重组体;抽提重组体DNA,用PacI酶切后,转染至人胚肾细胞株HEk293细胞中进行复制包装,扩增纯化;进行病毒检测。[结果]经用具有Amp抗性及kan抗性的培养板和多种限制性内切酶酶切筛选,证实应用同源重组方法构建了含AFP启动子和目的基因E1A的腺病毒载体;该重组腺病毒可转染HEk293细胞,并进行有效复制。[结论]成功构建了具有特异靶向性的条件复制腺病毒载体,为进一步研究该腺病毒的功能提供了条件。     

人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2基因克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2 ( hPPARγ2)基因及构建其真核表达重组体,为进一步研究该基因打下基础.方法采用RT-PCR方法从中国人网膜脂肪垫总RNA中扩增出hPPARγ2 cDNA全长基因,将全长hPPARγ2cDRA定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,筛选出阳性克隆.通过限制性内切酶酶切和核苷酸序列测定进行鉴定.结果克隆出全长hPPARγ2cDNA序列与GeneBanK序列相同,真核表达质粒经限制性内切酶酶切后获得的片段大小与理论值一致.结论成功地克隆了hPPARγ2 cDNA,并构建了真核表达重组体.