腺病毒介导的LacZ基因在乳腺癌细胞中的表达

目的：观察腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞的转导效率及腺病毒转导对细胞生长的影响。方法：腺病毒介导的基因转导。结果：在病毒的重复感染率（MOI）为500时细胞的转导效率达到100％；不同数量的病毒转导乳腺癌细胞对癌细胞的生长没有明显影响。低温冻存可使病毒的感染性明显下降。结论：腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞中有高的转导效率，而病毒载体本身对细胞的生长没有影响，可用作乳癌特异药物前体酶激活基因治疗的基因转移方法。     

3腺病毒介导的LacZ基因在B16小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　观察腺病毒介导的LacZ基因转移在B1 6细胞的转导效率。方法　腺病毒介导的LacZ基因转导B1 6细胞。结果　当MOI为 50～ 1 0 0 ,即可获得较高的转导效率 ,达 90 %± 1 %。结论　腺病毒介导的基因转移在B1 6细胞能获得较高的转导效率和目的基因的有效表达。提示腺病毒载体作为一种高效的基因转移载体 ,在肿瘤的基因治疗中有着良好的应用前景     

腺病毒介导的p16对胆管癌细胞的生长抑制作用

目的 研究p16基因对胆管癌细胞的作用。方法 将重组体腺病毒p16转移到人胆管癌细胞QBC939,对p16基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果 用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测,发现当MOI为100以上时,重组体朱病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导,用RT-PCR方法检测,在胆管癌QTBC939细胞系中p16呈低表达,重组体腺病毒能介导外源基因p16在胆管癌QBC939细胞系中高效表达,重组体朱病毒介导的p16在QBC939细胞中表达,能抑制QBC939细胞的生长和集落形成。流式细胞计数和细胞DNALadder,证实p16能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 p16基因通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用。     

重组腺病毒载体含人抑瘤素的扩增及纯化

目的：构建含人抑瘤素(HOSM)基因的重组腺病毒载体，观察其对肿瘤细胞生长的影响。方法：用脂质体介导质粒DNA同源重组方法构建HOSM基因的重组缺陷型腺病毒载体，用聚合酶链反应(PCR)法鉴定所构建的ad-HOSM载体，在人胚肾细胞(293细胞)中扩增病毒。CsCl梯度超速离心纯化病毒，噬斑法测定病毒的滴度。结果：获得了高纯度、高滴度的重组腺病毒载体。结论：细胞内质粒DNA同源重组法能有效构建重组腺病毒载体，293细胞能有效扩增病毒。CsCl梯度超速离心法能制备高纯度的病毒，为进一步研究重组腺病毒介导HOSM基因对肿瘤细胞的生物学活性的影响打下基础。     

腺病毒介导的p53和顺铂的联合应用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用

目的：研究ｐ５３基因和顺铂联合应用对胆管癌细胞的作用。方法：将重组体腺病毒ｐ５３和顺铂联合作用于人胆管癌细胞ＱＢＣ９３９，对ｐ５３基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果：用Ａｄ－ＬａｃＺ进行复组腺病毒转导效率的检测，发现当ＭＯＩ为１００以上时，重组腺病毒可使９０％以上的培养的人胆管癌ＱＢＣ９３９细胞被传导，用ＲＴ－ＰＣＲ方法，在胆管癌ＱＢＣ３９细胞系中ｐ５３无表达。重组体腺病毒能介导外源基     

Fas基因转导大肠癌细胞株的表达

目的：建立表达外源性Fas基因的大肠癌细胞株，观察Fas基因在转导前后的表达，方法：采用分子克隆技术将Fas基因插入真核表达载体pBK-CMV的多克隆位点之间，以脂质体介导法将Fas基因导入受体细胞LoVo ,用G418筛选克隆细胞，以dot blotting,Westting blotting检测转导细胞Fas基因的表达，结果：成功建立了Fas基因表达株，转导株在RNA及其蛋白水平表达均明显高于非转导株，转导细胞增殖速度，倍增时间，对数生长期等均比非转导株更为缓慢，但无显著性差异，在Fas抗体作用下，转导株细胞生长明显受到抑制，有非常显著性差异，结论：Fas基因在大肠癌细胞中处于低表达状态，通过真核表达载体介导，Fas基因在RNA及其蛋白水平能有效表达，Fas表达株在Fas抗体作用下可明显抑制体外培养的大肠癌细胞的生长增殖。     

共刺激信号B7—1表达对小鼠肿瘤细胞生长和转移的影响

为Ｂ７１分子基因在肿瘤免疫基因治疗中的应用提供实验依据。方法通过逆转录病毒介导的基因转移技术，将Ｂ７１ｃＤＮＡ导入具有不同免疫原性的小鼠肿瘤细胞获得表达，并观察转基因细胞在纯系小鼠体内生长和转移的改变。结果由于Ｂ７－１基因的转导表达，使具有免疫原性的ＥＬ４Ｔ淋巴瘤细胞致瘤性丧失；使非免疫原性的Ｂ１６黑色素瘤、Ｐ８１５肥大细胞瘤和ＭＡ８９１乳腺癌细胞的致瘤性减弱；使Ｂ１６细胞的实验性转移和ＭＡ８９１细胞的自发肺转移能力降低。通过转导Ｂ７－１基因的Ｂ１６细胞的免疫接种，可使再次接种的亲本Ｂ１６细胞的致瘤性减弱：但对已生长的亲本Ｂ１６细胞影响不明显。结论Ｂ７１基因导入不同的肿瘤细胞后，可引起机体产生不同程度抗肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞在体内的生长和转移能力丧失或减弱，这种反应的强弱与肿瘤细胞本身的特性有关。     

前列腺癌HRE.CArG.HSV-TK重组腺病毒载体基因放射治疗的体外研究

目的 观察NILE.CArG.HSV-TK重组腺病毒栽体Ad.HRE.CArG.HSV-TK联合放射对体外培养的前列腺癌细胞LNCaP和PC-3生长和凋亡的影响.方法 50 MOI重组腺病毒体外转导细胞,Real-timeRT-PCR检测TK基因mRNA表达水平,MTT法检测腺病毒转导联合放射对常氧(37℃,19%氧气,5%二氧化碳)和乏氧(37℃,0.5%氧气,5%二氧化碳)状态下细胞的生长抑制作用,流式细胞术检测凋亡(Annexin V-FITC染色).结果 50MOI腺病毒体外转导细胞48 h后,TK mRNA表达较对照组明显增加(P＜0.05),乏氧和/或放射处理后TK mKNA表达增加更显著.腺病毒体外转导和/或联合射线照射后,细胞抑制率显著增加并可介导细胞凋亡(P＜0.05).乏氧处理时上述效应更明显.结论 腺病毒栽体联合放射可显著抑制体外人前列腺癌细胞生长并诱导凋亡,为前列腺癌进一步的基因-放射治疗研究奠定了基础.     

腺病毒载体转导GM—CSF基因制备肿瘤疫苗对小鼠肿瘤模型预防及治疗的实验性研究

目的：评价重组腺病毒载体转导粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）、γ－干扰素（IFN－γ）、单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）基因所制备的肿瘤疫苗对同源性小鼠肿瘤模型的预防和治疗功效。方法：巨细胞病毒（CMV）起动子、特定的细胞因子cDNA片段和SV40多聚腺苷信号组成细胞因子基因表达载体，通过基因重组产生重组腺病毒（Adv/GM-CSF、Adv/IFN-γ、Adv/MCP-1）。重组腺病毒直接人肾胚胎细胞系293细胞，选择最佳感染滴度，以不同的效靶比转染不同的肿瘤细胞系CT26、RENCA和BALB／3T3纤维母细胞，经照射灭活后制备不同的肿瘤疫苗，用于各种肿瘤模型。结果：表明经基因转导后的肿瘤细胞以及照射灭活经基因转导后的肿瘤细胞可以分泌转导的细胞因子。接种经照射灭活的转导GM－CSF结肠癌细胞系CT26后，90％的同源性小鼠对原代CT26细胞的攻击起到了保护作用，而接种转导IFN-γ和MCP－1基因制备的肿瘤疫苗对小鼠经原代CT26细胞的攻击未有保护作用。同源性小鼠接种分泌GM－CSF的肿瘤疫苗后，对CT26原代细胞的多次 攻击在整个观察期间未见肿瘤生长。接种分泌GM－CSF的肿瘤疫勒后机体长期、特异性的抗肿瘤免疫的建立需要GM－CSF及肿瘤抗原在接种部位的同时存在，CD8T细胞亚群的缺失，明显阻断了分泌GM－CSF肿瘤疫苗的功效。皮下注射分泌的GM－CSF肿瘤疫苗能够有效地阻止预先植入小鼠体内小负荷肿瘤细胞的生长，同时也可以有效的阻止接种前7天或后3天静脉内注射原代CT26瘤细胞在肺内转移灶的生长。结论：在本研究实验性肿瘤模型中，皮下注射重组病毒载体转导GM－CSF基因制备的肿瘤疫苗不仅能够有效地预防皮下接种原代CT26肿瘤细胞的生长而且也可消除原有的肿瘤病灶及转移瘤灶，使机体建立了长期、特异性的抗肿瘤免疫反应。     

腺病毒介导的eNOS基因转移时血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因转染血管平滑肌细胞（VSMC）的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法：构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC，应用聚合酶（PCR），逆转录PCR（RT－PCR）技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率；应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果：外源性eNOS基因成功导入了VSMC；VSMC中有eNOS基因mRNA的表达；外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后，可显著抑制VSMC的生长，DNA合成减少。结论：腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC，并可有抑制细胞生长。     

腺病毒介导黑色素瘤分化相关基因对乳腺癌细胞生长和凋亡的研究

目的 观察腺病毒介导黑色素瘤分化相关基因(mda-7/IL-24)对乳腺癌细胞生长和凋亡的作用.方法 将腺病毒mda-7/IL-24进行病毒的扩增、纯化和滴度测定.将纯化好的腺病毒mda-7/IL-24感染乳腺癌细胞,用Western印迹方法 检测mda-7/IL-24在乳腺癌细胞中的表达.结晶紫和4甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)观察腺病毒mda-7/IL-24对乳腺癌细胞生长的影响;Hoechst染色和膜联蛋白(Aanexin)V检测腺病毒mda-7/IL-24对乳腺癌细胞凋亡的影响;并在裸鼠上进行了动物实验研究.结果 腺病毒mda-7/IL-24感染的乳腺癌细胞上清液中可以检测到mda-7/IL-24蛋白的表达;腺病毒mda-7/IL-24能明显地抑制乳腺癌细胞的生长,Hochest染色和Annexin V提示腺病毒mda-7/IL-24促进乳腺癌细胞的凋亡.实验进一步证明了腺病毒mda-7/IL-24可以显著抑制裸鼠乳腺癌荷瘤的生长.结论 腺病毒mda-7/IL-24能显著抑制乳腺癌细胞的生长并诱导乳腺癌细胞的凋亡.     

重组RA538、反义c-myc腺病毒对正常细胞作用的研究

了解重组ＲＡ５３８、反义ｃ－ｍｙｃ腺病毒载体对正常细胞的影响。方法：采用形态学观察、ＭＴＴ、ＲＴ－ＰＣＲ等方法,对腺病毒介导ＲＡ５３８及反义ｃ－ｍｙｃ基因对正常人胚肺成纤维细胞的影响进行研究。结果以Ａｄ－ＬａｃＺ进行组腺病毒转导效率检测发现腺病毒２ＢＳ细胞具有很高的转导效率,ＡｄＲＡ５３８、Ａｄ－ＡＳｃ－ｍｙｃ对正常人胚肺２ＢＳ细胞无生长抑制及凋亡诱导作用,同时Ａｄ－ＲＳ５３８对２ＢＳ内源性ｃ－ｍ     

野生型p53基因转移对心肌细胞形态的影响

目的：探讨腺病毒介导的野生型P53基因转移对心肌细胞形态的影响及P53基因用于心肌疾病基因治疗的可能性,方法：将腺病毒介导的野生型P53基因转入体外培养的乳兔心肌细胞,应用生化染色方法,Western blotting技术检测野生型P53型基因的转染效率及其表达效果,采用相差显微镜,透射电镜等实验方法观察心肌细胞的形态学改变。结果：重组腺病毒载体有效地将P53基因转入心肌细胞中并使其得以表达,转入的P53基因可以导致心肌细胞收缩,体积变小,胞浆浓缩,核固缩,染色质边集等改变,结论：野生型P53基因转移可以影响心肌细胞的形态,并能导致细胞凋亡。     

可溶型尿激酶受体基因的表达及其对肿瘤生长的影响

目的建立逆病毒介导的可溶型尿激酶受体基因转移系统,并分析可溶型尿激酶受体(suPAR)基因转移对乳腺癌细胞生长的影响。方法应用PCR技术从人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中克隆suPAR基因,并建立逆病毒介导的suPAR基因转移系统;用获得的病毒感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,PCR检测靶细胞中suPAR基因的整合与表达;在裸鼠体内观察基因表达的乳腺癌细胞的生长情况。结果从内皮细胞中克隆的suPAR基因可编码301个氨基酸,其GenBank注册号为AY029180;通过脂质体转染与交互感染策略获得病毒生产细胞PT67/suPAR,其病毒滴度约为3.5×105CFU/ml;PCR分析显示靶细胞中有suPAR基因的整合和表达;转染该基因的MDA-MB-231在裸鼠体内的生长受到抑制(P<0.05)。结论成功地构建了逆病毒介导的可溶型尿激酶受体基因转移系统;可溶型尿激酶受体基因表达具有抗乳腺癌细胞生长的作用。     

基因治疗基因转移方法

基因转移是指用适当手段将外源基因导入体外或体内受体细胞中的分子生物学技术。常用方法可概括为物理、化学和生物三大类，前两类是非病毒的方法，生物方法主要指病毒介导的基因转移，包括RNA病毒、DNA病毒两类，物理化学法携带的遗传物质在细胞内易受DNA酶降解，而且不容易稳定地存在细胞基因组中，但是这些方法不存在野生型病毒污染．比较安全．病毒方法的特点是基因转移效率较高，但是安全性问题需要重视。理想的基因转移方法应符合以下要求，(1)高效的转移率；(2)外源基因定向导入受体细胞，且能转导非分裂相的细胞；(3)能稳定地、定点整合到宿主染色体上．最好是同源重组；(4)较高的安全性．对人体不构成较严正重的危害；(5)容易操作．易推广应用。     

绿色荧光蛋白基因在白血病细胞K562中的转导效率

目的：探讨慢病毒载体在白血病细胞中的基因转导效率,为白血病基因治疗提供关键依据。方法：应用1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)改造而成的第3代自身失活(SIN）慢病毒载体（lentiviral vector）系统,与鼠白血病病毒（MLV）SIN载体进行比较,通过荧光显微镜观察细胞内标记基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况,应用流式细胞术检测基因导入细胞百分比,评价两种载体系统在人白血病细胞系K562中的基因转导效率。结果：通过荧光显微镜可定性观察GFP在K562细胞中的表达情况,在同样的基因转导条件下,HIV载体转导的白血病细胞中被转导的标记基因GFP的表达强度及GFP阳性细胞数明显高于MLV载体转导的细胞。流式细胞仪定量检测HIV载体的转导效率接近100%,而MLV低于40%,两组间转导效率比较差异有显著性（P＜0.05）。结论：基于慢病毒载体基因转导的高效性,该载体系统可作为白血病细胞基因转导的极好工具。     

腺病毒介导慢病毒载体的细胞转染

目的 尝试利用腺病毒介导慢病毒载体的细胞感染以提高转染效率。方法 以多聚赖氨酸粘合腺病毒和慢病毒载体形成复合体后感染Hela细胞，测定慢病毒载体目的基因表达的变化并用激光共聚焦扫描显微镜观察慢病毒载体的细胞摄人情况，进一步了解抗腺病毒衣壳球部的抗体能否干扰这种变化以证明腺病毒是否参与此介导作用。结果携带大肠埃希菌半乳糖苷酶(pgalactosidase，pgal)基因的慢病毒载体Lenti^-VSVG对Hela细胞的感染率非常低，通过多聚赖氨酸与腺病毒(AdenoPL)形成复合体后感染率显著上升并呈剂量依赖性。激光共聚焦扫描显微镜显示Lenti^-VSVG被细胞摄取的数量在和腺病毒粘合后显著增加。抗腺病毒衣壳球部抗体能抑制直至阻断Lenti^-VSVG／AdenoPI。复合体两者各自携带基因(分别是β-gal和荧光素酶／绿色荧光蛋白融合蛋白)的表达。结论 通过多聚赖氨酸的物理连接，腺病毒能介导慢病毒载体的细胞摄入从而提高转染效率。     

Ad-IL-24抑制乳腺癌生长的体外实验研究

目的 研究腺病毒介导的IL-24基因(Ad-IL-24)表达对乳腺癌的生长抑制作用.方法 将扩增的Ad-IL-24腺病毒感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,用RT-PCR法、Westernblot法检测IL-24基因在肿瘤细胞中的转录和表达;MTT法和FCM检测IL-24基因的表达对乳腺癌细胞的生长抑制和凋亡率;半定量RT-PCR检测IL-24基因的表达对乳腺癌细胞的凋亡相关基因Bax、Bcl-2及Survivin转录的影响;ELISA法检测VEGF、Ang-1的分泌水平.结果 IL-24基因可在MDA-MB-231细胞中成功转录及表达,并对乳腺癌细胞增殖有明显抑制作用,并能引起细胞凋亡,其凋亡机制可能与Bax/Bcl-2比值升高、Survivin降低有关;VEGF、Ang-1表达下降.结论 腺病毒介导的IL-24基因在体外可明显抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长,诱导其凋亡,其机制可能与下调Survivin、VEGF、Ang-1,上调Bax的基因表达水平有关,该研究可为乳腺癌的基因治疗提供一定实验依据.     

p16基因抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的体外和体内实验研究

目的 :探讨p16基因对乳腺癌的治疗作用 ,为乳腺癌 p16的基因治疗提供实验依据。 方法 :构建p16的逆转录病毒载体 pLMSN ,包装成病毒后 ,体外转导p16基因纯合性缺失的乳腺癌细胞株MCF 7,Westernblot证明该基因在转导后的MCF 7细胞中有表达 ,用活细胞计数、流式细胞仪、形态观察等方法来检测 p16表达在体外对MCF 7细胞生物学行为的影响。进行SCID鼠体内成瘤实验和逆转录病毒直接注射SCID鼠乳腺癌模型的治疗性实验来观察 p16对乳腺癌细胞的体内抑制作用。 结果 :外源性 p16在MCF 7细胞中表达后 ,体外细胞发生形态改变 ,生长明显慢于对照细胞 ,流式细胞计数显示G1期细胞增多 ,细胞在SCID鼠体内成瘤性下降 ,p16逆转录病毒直接注射有使SCID鼠乳腺肿瘤缩小的趋势。结论 :p16逆转录病毒对p16基因纯合性缺失的乳腺癌有一定治疗意义     

重组AAV1-Luc病毒制备及体外转导培养细胞的特性

目的制备携带萤火虫荧光素酶基因的重组AAV1病毒（rAAV1-Luc）,研究该病毒体外转导培养细胞的特性。方法通过“1株载体细胞/1株辅助病毒”的双因素包装策略制备出rAAV1-Luc,研究该重组病毒体外转导哺乳动物细胞的量效关系,肝素对转导的拮抗作用、rAAV1的竞争抑制作用及丁酸钠对表达水平的增强作用。结果在一定范围内,随着rAAV1-Luc感染细胞的感染复数（MOI,即每个细胞感染的病毒基因组数）值增高,荧光素酶的表达水平也增高;但更高的MOI（〉10^7）反而使荧光素酶的表达水平下降。肝素不能特异性阻断rAAV1介导的荧光素酶表达。携带不同基因的2种rAAV1病毒相互具有明显的竞争抑制作用。丁酸钠可显著增强rAAV1介导的荧光素酶表达水平。结论该研究揭示了rAAV1载体一定的细胞转导特性,对应用rAAV1载体介导基因转移研究具有指导意义。