基因敲除小鼠在药物依赖性研究中的应用

基因敲除 ( ｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔ)是８０年代初出现的一项新的基因工程技术 ,是制备转基因动物的重要技术之一。利用该技术可以培育先天缺陷某一特定基因的动物 ,以此研究该特定基因的生理功能或在疾病发生发展中的意义。近年来基因敲除小鼠在药物依赖性研究中也得到广泛的应用。在传统的药物依赖性研究中 ,往往选取特异性的受体配体来研究该受体在依赖性中的作用 ,但这种特异性往往是相对的 ,剂量改变就可能影响其它受体的功能 ,所以难以真正确定该受体的作用。而基因敲除技术在这方面具有独特的优点 ,因为利用基因敲除技术可以选择性…     

基因敲除动脉粥样硬化小鼠模型研究进展

基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型是目前较为认可的探讨动脉粥样硬化发病机制及寻找新药物靶点的关键工具,也应用于潜在抗动脉粥样硬化药物的药理和毒理研究。载脂蛋白E(ApoE)、低密度脂蛋白受体(LDLR)和B类Ⅰ型清道夫受体(SR-B1)等基因的表达促进机体脂质、胆固醇和低密度脂蛋白等转运和代谢,维持血管正常功能,敲除这些基因会引起脂质转运及代谢紊乱从而诱发动脉粥样硬化及并发症的发生发展。常见的基因敲除小鼠有ApoE基因敲除、LDLR基因敲除及其改良品系,这些模型小鼠能够客观反映敲除基因对动脉粥样硬化发生的影响,且广泛应用于动脉粥样硬化的非临床研究。本文阐述了当前基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型的机制、应用和优缺点,以期为动脉粥样硬化发病机制研究及抗动脉粥样硬化药物筛选提供参考。     

降钙素基因相关肽与心肌梗死

降钙素基因相关肽(calciton in gene related pedtide，CGRP)是1983年Rosenfeld等应用基因重组技术发现的一种由37个氨基酸组成的生物活性肽。它与降钙素来自同一基因，在不同组织中进行基因组合，在甲状腺主要转录表达成降钙素，在心脏及神经系统主要转录表达成CGRP。人的CGRP有α和β两种形式，两者氨基酸组成和序列基本相同，     

鉴定清道夫受体BI基因敲除突变小鼠的新方法

目的建立一种清道夫受体BI(SR-BI)基因敲除突变小鼠基因型的鉴定方法。方法参照碱基淬灭探针技术原理,设计鉴定野生型和突变型SR-BI基因的引物探针。反应体系经PCR扩增后,利用融解曲线功能判断小鼠基因型。结果新方法可在1h内完成基因型分析。野生型和突变型纯合子小鼠分别在(53.25±0.81)℃及(62.25±0.31)℃处出现单个融解谷;而杂合子小鼠在两处均出现融解谷。结论新方法简单、快速、准确,适用于鉴别SR-BI基因敲除突变小鼠的基因型。     

基于基因过表达及基因沉默解析F5H基因对甘草酸生物合成的调控研究

阿魏酸5-羟化酶(ferulate 5-hydroxylase,F5H)是苯丙烷代谢途径上的关键酶.本课题组前期转录组测序研究显示F5H基因在甘草酸生物合成过程中起负调控作用,因此本文拟克隆该基因,并从基因过表达和沉默两个方面对这一调控作用进行深入研究.本文克隆得到甘草F5H基因(GenBank注册号:MK882511...     

基因打靶技术研究及其应用

基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的新技术,是一种利用DNA同源重组原理和胚胎干细胞(embryonic stemcells,ESCs)技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的实验手段,具有定位性强、打靶后新的基因随染色体DNA稳定遗传的特点[1],其方法包括基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等,相关的基因工程技术包括转基因、基因沉默和基因捕获等.     

TLR9基因敲除小鼠的构建及表型初步鉴定

目的构建TLR9基因敲除小鼠模型,并对其表型进行初步鉴定。方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR9基因敲除小鼠;利用毛细管凝胶电泳技术鉴定敲除小鼠的基因型,并通过PCR产物测序分析对敲除效果进行鉴定;利用qRT-PCR和Western blot及免疫组织化学技术分别检测TLR9基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达情况;观察基因敲除小鼠的遗传性状、体重及血常规变化;并通过苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠组织的病理形态学变化。结果 PCR和测序结果表明TLR9基因敲除成功。敲除小鼠的脾、肝组织中TLR9基因mRNA及蛋白质水平表达显著低于野生型小鼠;TLR9基因敲除小鼠可正常生长繁殖,体重、外周血血常规各项指标均正常。TLR9基因敲除小鼠各组织形态学特征与野生型小鼠相比无明显差异。结论成功建立TLR9基因敲除小鼠模型,为研究TLR9基因的生物学功能和调控机制提供实验动物模型。     

FHIT基因在肺癌中缺失的研究

目的 探讨肺癌发生的分子生物学机制。方法 采用逆转录-巢式聚合酶链反应(reverse-tape polymerasechain reaction)的方法对42例肺癌及10例正常肺组织中的 FHIT(Fragile histidine triad)基因的缺失情况进行检测。结果66.7％(28/42)肺癌组织中检测到FHIT基因的缺失,而正常组织中未检测到FHIT基因的缺失,二者差别有显著意义(P<0.01)。FHIT基因的缺失与肺癌的不同病理分型、分化程度、临床分期无关。与吸烟有一定的相关性。结论(1)FHIT基因的缺失在肺癌的发生中起一定的作用。(2)可能是肺癌组织中的频发及早期事件。(3)可能是烟草致癌物的靶基因。     

MIBP1基因敲除载体的构建

目的:构建MIBP1基因敲除载体。方法:以小鼠129胚胎干细胞基因组DNA为模板,根据GenBank注册序列,扩增小鼠MBP-2基因启动子区5′端片段(5′arm)和内含子区3′端片段(3′arm),然后分别克隆进敲除载体pKOScramblerNTKV-1906,酶切鉴定后即得到MIBP1基因敲除载体pNTKV-3′,5′arm。用SalⅠ对pNTKV-3′,5′arm线性化,用于胚胎干细胞电转染。结果:成功扩增并克隆到小鼠129胚胎干细胞MBP-2基因的5′arm和3′arm片段,构建了MIBP1基因敲除载体。结论:成功构建了MIBP1基因敲除载体。     

PIM-1基因沉默对前列腺癌细胞生长抑制作用的研究

目的:探讨RNA干扰(RNAi)沉默PIM-1基因表达对前列腺癌细胞体外生长的影响.方法:将RNAi重组质粒(pPIM1-shRNA-3)经脂质体介导转染前列腺癌PC-3细胞,用G418筛选稳定转染、PIM-1基因沉默的PC-3细胞.用空质粒载体(pRNAT-U6.1/Neo)稳定转染的PC-3细胞和正常培养的PC-3细胞作为对照,进行体外研究.利用细胞计数法分别检测3组PC-3细胞的增殖能力.利用流式细胞技术分别检测3组PC-3细胞的细胞周期及凋亡情况.结果:与两对照组PC-3细胞相比,PIM-1基因沉默组的PC-3细胞在培养48、72和96 h的细胞计数显著减少(P＜0.01),细胞周期中G1期细胞的比例显著升高,而S期细胞的比例显著降低(P＜0.01),发生早期凋亡的细胞比例明显升高(P＜0.01).结论:PIM-1基因沉默可以使得PC-3细胞的细胞周期进程受阻,抑制细胞增殖,并诱发细胞凋亡.PIM-1可以作为前列腺癌基因治疗的有效靶点,具有潜在的临床应用价值.     

SALL4基因与生殖细胞肿瘤关系的研究进展

人类婆罗双数样基因-4 (sal-like 4,SALL4)是一种转录因子,在维持胚胎干细胞的自我更新和多向分化潜能方面起必不可少的作用[1-2].同时,SALL4亦是一种新发现的原癌基因,多项过表达或敲除SALL4基因的实验表明其参与细胞增殖、凋亡、侵袭迁移、耐药、肿瘤干细胞的维持.     

房颤的基因定位方法及其进展

该文回顾了心房颤动相关基因克隆的方法,这些方法包括家系调查、图位克隆、定位候选克隆、基因敲除、RT-PCR等,介绍了这些方法的主要特点,在此基础上,认为DNA微阵列杂交等方法可以房颤基因定位方面发挥更大作用,基因敲除技术是下一步房颤基因定位的主要方法。     

哮喘关联基因血清类黏蛋白1样蛋白3的研究进展

哮喘是一种慢性支气管炎性疾病[1-2],其发病受到遗传和环境等多种因素的共同影响,全球约有1.5亿人患病[3-4].目前,这一疾病的发病机制尚不清楚,其中从遗传角度探索哮喘易感基因是近年来的研究热点.伴随着分子生物学技术的不断革新,哮喘易感基因的研究取得了很大进步,特别是人类基因组计划以及国际人类基因组单体型图计划的完成,全基因组关联分析(GWAS)在复杂遗传性疾病的研究中得到广泛应用,这为疾病易感基因的研究提供了更大希望.2007年,Moffatt等[5]通过GWAS发现位于人类染色体17q21上的血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)与儿童哮喘存在较强的关联,且同时发现ORMDL3的多态性位点-SNPrs7216389与儿童哮喘显著关联.这一发现在日本和墨西哥等多个人群的研究中得到验证[6-9],进一步证实了ORMDL3与儿童哮喘的关联性.现将ORMDL3基因与哮喘的相关性研究进展综述如下.     

尿酸酶缺失Kunming-DY大鼠的研制

目的敲除SD大鼠尿酸酶基因,获得尿酸酶(Uox)缺失的Kunming-DY大鼠,为痛风和高尿酸血症的研究提供模型动物。方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除SD大鼠尿酸酶基因,先获得杂合子(Uox~(+/-))动物,然后通过反复交配筛选,获得尿酸酶敲除的纯合子(Uox~(-/-))动物,最后用分子生物学技术和生化技术进行鉴定。结果大鼠的尿酸酶基因Exon2,Exon3和Exon4 3个外显子成功敲除,纯合子动物的血清和肝匀浆无尿酸酶活性。在正常饮食条件下,雄性纯合子动物血清尿酸水平在40μg·L~(-1)以上,雌性动物的血清尿酸水平在30μg·L~(-1)以上,部分大鼠的血尿酸水平超过70μg·L~(-1),与人类的血尿酸水平接近。纯合子大鼠的1年存活期近100%,未见明显的肾损伤,能实现稳定繁殖。结论尿酸酶缺失的Kunming-DY大鼠模型研制成功,可以用于痛风和高尿酸血症的科学研究。     

HMGN5基因敲除对人膀胱上皮癌细胞顺铂化疗敏感性的影响

目的探讨HMGN5基因敲除对人膀胱上皮癌细胞顺铂化疗敏感性的影响。方法采用不同浓度CDDP(0、1、2、4,8、16μg/ml)处理人UBC细胞系,采用Western blot、菌落形成、细胞侵袭、细胞凋亡及Hoechst 33342染色法评价HMGN55蛋白敲除对UBC细胞CDDP敏感性的影响,同时分析HMGN5基因参与到UBC细胞CDDP治疗环节可能分子机制。结果 UBC细胞株5637、t24及UM-UC-3中HMGN5蛋白表达,其中5637细胞系HMGN5蛋白水平最高,而UM-UC-3细胞中最低(P<0.05);5637细胞系对CDDP敏感性显著低于其他两种(P<0.05),且UM-UC-3细胞系敏感性最高;UBC细胞系HMGN5敲除后P-Akt表达显著下降(P<0.05);CDDP处理后P-Akt活性亦随之降低(P<0.05);CDDP处理还可下调VEGF-C和SLUG表达,上调E-Cad表达(P<0.05);5637细胞HMGN5基因敲除后早期凋亡率显著提高,而加入IGF-1可逆转这一过程(P<0.05);与阴性对照组和IGF-1治疗组相比,HMGN5敲除组凋亡核百分比显著升高(P<0.05);与对照组相比,HMGN5基因敲除显著下调P-AKT和VEGF-C表达,上调E-Cad、细胞色素C、裂解半胱天冬酶-3、裂解PARP表达(P<0.05);而添加IGF-1可逆转以上蛋白质表达变化(P<0.05)。结论 HMGN5可能是顺铂治疗潜在靶点,抑制HMGN5基因有助于增加UBC细胞化疗敏感性,这一作用主要通过干扰PI3K/Akt信号通路实现。     

DIAPH3,一个新的肝细胞癌相关基因的筛选及功能研究

目的 研究功能未知基因DIAPH3在肝细胞癌(肝癌)组织中的表达及其与肝癌细胞生长的关系.方法 利用肝癌基因表达谱数据研究发现DIAPH3基因在肝癌组织中高表达.采用RT-PCR及实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)检测DIAPH3在人类正常组织以及肝癌组织和癌旁组织中的表达.RNA干扰技术沉默肝癌细胞株(7701和7402)内DIAPH3基因的表达,细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验定量分析内源性DIAPH3基因被沉默前后的细胞生长曲线的变化.结果 DIAPH3基因在75％(18/24)的肝癌组织中有明显的上调.沉默肝癌细胞株7701和7402中内源性DIAPH3基因表达后,两种肝癌细胞的生长均受到明显的抑制(P＜0.01).结论 DIAPH3可能是一个新的肿瘤相关癌基因,在维持肝癌细胞恶性表型过程中可能起到重要的作用.     

乙型肝炎治疗的希望-RNA干扰技术

我们看到了希望:基因时代对于基因功能的研究极其重要,RNA干扰技术的出现为研究提供了有力的手段。其特异、高效、持久等特征在分析基因功能、抗肿瘤、抗病毒、抗遗传病等方面均取得突破进展。1发现与机制1.1发现:RNA干扰(RNA in terference)是一种由双链RNA诱发的基因沉默(gene s ilenc ing),是指当细胞中导入与内源mRNA编码同源的双链RNA(doub le stranded RNA,dsRNA)后,该mRNA发生降解而致基因表达沉默的现象。1995年康乃尔大学Su G uo博士〔1〕在研究蠕虫(caenorhab-d irise legans,秀丽新小干线虫)par-1基因时,在给线虫注…     

治疗偏头痛的降钙素基因相关肽受体拮抗剂rimegepant

Rimegepant是百时美施贵宝公司开发的口服小分子降钙素基因相关肽(Calcitonin gene receptor peptide,CGRP)受体拮抗剂.该药已于2020年3月被美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市,被推荐用于治疗有或无先兆的偏头痛急性发作.与曲坦类药物不同,rimegepant没有血管收缩特...     

基因生物学功能分析与应用研究进展

随着分子生物学的飞速发展,人们对基因有了更加深刻的认识.在大量测序工作完成后,如何研究这些基因的生物学功能成为一个重要问题.现今的研究方法包括生物信息学分析及基因转导、反义技术、基因组编辑等实验方法,这些研究在疾病预防和治疗中发挥重要作用.