周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶基因原核和真核表达质粒的构建

目的构建我国流行的周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶（BmCP）基因原核和真核表达质粒，为进一步研究奠定基础。方法从周期型马来丝虫虫体中提取总RNA，反转录成cDNA，设计合成引物，以eDNA为模板，通过PCR从eDNA中扩增出目的基因，扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pMD18-T载体，进行双酶切及PCR扩增鉴定，获得阳性重组质粒，进行测序分析和同源性比较。阳性克隆的质粒亚克隆至真核表达质粒peDNA3．1（＋），转化感受态大肠埃希菌（E-coli）DH5α，筛选阳性克隆，用PCR和双酶切鉴定阳性重组子。结果RT—PCR扩增出1条约1201bp的特异性条带，重组质粒双酶切和以质粒为模板的PCR结果与预期相符．DNA序列分析与GenBank已知的基因序列同源性为99％。构建了真核重组表达质粒peDNA3．1-BmCP。结论成功构建了周期型BmCP原核和真核重组表达质粒，为进一步研究该基因的功能提供了条件。     

RAPD比较分析我国四省区周期型马来丝虫DNA的多态性

本文采用RAPD技术对我国湖北古城、贵州独山、福建建阳和安徽泾县四个地区的周期型马来丝虫成虫基因组DNA的多态性进行护增分析。结果显示：四个地区马来丝虫基因组DNA扩增产和出现有3条相同条带,多条不同条带,其中湖北古城、福建建阳和安徽泾县三地区马来丝虫株所扩增出的条带极为相似,而贵州独山株马来丝虫扩增出的特异性条带较多。表明这四个地区虫体基因具有明显的同源性,但也存在一定差异。从而进一步证实了我国不同地区周期型马来丝虫出现有种内分化的迹象。     

安徽地区周期型马来丝虫成虫形态扫描电镜观察

本文报道扫描电镜观察的安徽地区马来丝虫的外部形态。雌、雄虫头部乳突内圈6个、外圈4个,头感器位于内圈侧乳突外侧缘。体表环纹带状,小结节分布不均。雄虫尾部卷曲2.5～5圈,多为3～4圈。肛孔前体表有棒状体。长、短交合刺各一根自肛孔伸出,长交合刺末端匙状,匙面光滑。肛孔周围乳突多为13个,其顶部有一小突起,肛孔至尾部之间腹侧有乳突2～4个。雌虫尾端有一凹陷,亚尾端具1乳突。     

周期型马来丝虫副肌球蛋白基因真核表达重组质粒构建

【提要】 提取周期型马来丝虫总RNA。跟据已知的马来丝虫副肌球蛋白（BmPmy）基因序列，设计合成引物，并引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点，应用RT?鄄PCR技术，扩增BmPmy基因片段，克隆至载体pGEM?鄄T中，经PCR和双酶切鉴定后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1（+），成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（+）-BmPmy，并转染COS-7细胞后进行RT-PCR分析。转染的COS-7细胞高水平表达周期型马来丝虫副肌球蛋白mRNA，结果与预期相符。     

我国4个不同地区周期型马来丝虫成虫氨基酸的比较分析

已有文献报道我国不同地区的周期型马来丝虫的生物特性存在一些微小差异［１－３］。为进一步探讨我国不同地区的马来丝虫是否存在种内分化，作者采用反向高效液相色谱对我国同一纬度的４个不同地区周期型马来丝虫成虫（贵州独山株、四川乐山株、淅江安吉株、福建建阳株）...     

细胞毒作用杀伤周期型马来丝虫幼虫的超微结构研究

本文在特异性免疫血清存在下，就嗜中性粒细胞和巨噬细胞对周期型马来丝虫幼虫的细胞毒作用进行了超微结构观察。结果显示，两种效应细胞对虫体都具有强大的杀伤作用。该作用开始于效应细胞伸出伪足包围并粘附于虫体，然后分泌颗粒性物质、释放各种对虫体有毒性作用的酶和其它生物活性成分于虫体表面。由于微丝蚴鞘膜和角皮层的溶解和脱落，导致了虫体内部组织迅速变性坏死。电镜下可见虫体肿胀变形、核溶解和空泡样坏死以及最终崩解剥落成絮状等连续变化。本试验还发现效应细胞伪足插入脱鞘微丝蚴内部的现象，说明微丝蚴脱鞘后更易受到效应细胞的攻击。扫描电镜观察到被效应细胞粘附的感染期幼虫表面出现裂痕。     

中华按蚊传播亚周期型马来丝虫能力的研究

用中华按蚊人工感染亚周期型马来丝虫,观察其摄入的微丝蚴数、胸肌中的幼虫数和感染期幼虫数。以每蚊体内感染期幼虫数与摄入微丝蚴数之比作为传播能力。结果表明,在温度为28±1C,相对湿度75％的条件下,亚周期型马来丝虫在中华按蚊体内约需10～12d发育成熟,传播能力为10％。     

HSP70-GST融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建小鼠热休克蛋白70(HSP70)重组原核表达质粒,获取小鼠HSP70-GST融合蛋白。方法先用RT-PCR方法从小鼠脑基因组中扩增出HSP70基因cDNA序列,应用T-A克隆技术,克隆到质粒pMD—Tvector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1 中进行表达。结果表达产物经Western Blot分析,在109 KD处有一明显特异带,与预期结果相符。结论构建重组融合表达载体pGEX—HSP70,用基因工程的方法在原核细胞中成功表达出小鼠 HSP70-GST融合蛋白。     

浙江省周期型马来丝虫等位基因酶谱研究

目的:研究浙江省周期型马来丝虫等位基因酶谱。方法:用微量平面淀粉凝胶电泳法,检测浙江省周期型马来丝虫成虫180 条(雌60,雄120),微丝蚴0.4 m l(约32 000 条)及感染期幼虫约1 500条的Acph 等14 种酶的同工酶的等位基因酶谱。结果:浙江省周期型马来丝虫的3 个生活期虫体呈现13 种酶的同工酶的27个等位基因位点,多数位点为纯合子型,仅2 个位点(MPI,MDH-2)为杂合子型(占7.4% )。成虫、微丝蚴及感染期幼虫分别呈现16、16 及9 个等位基因位点。同时用相同的方法对实验室传代的周期型马来丝虫等位基因酶谱进行比较检测。结论:浙江省与实验室传代的周期型马来丝虫的同工酶等位基因酶谱基本相似     

聚合酶链反应检测蚊体内马来丝虫幼虫的实验

目的　建立一种特异、灵敏和简捷的聚合酶链反应 (PCR)检测蚊体内马来丝虫幼虫的方法。方法　在应用一种新的模板纯化处理技术 (Microcon 10 0 )基础上 ,采用适应于检测我国马来丝虫的两套DNA扩增引物(P1、P2与P3、P4) ,对实验感染马来丝虫的中华按蚊进行扩增检测。结果　两套引物均可检出蚊体内不同发育期幼丝虫 (L1、L2 和L3) ,其灵敏度达 1只蚊体内 1/ 6 4条L1和 2 0 0只群体蚊中含有 1只感染蚊 (体内有 1条L3)的水平 ,而对犬恶丝虫及未感染蚊却不能扩增出特异条带。结论　初步建立特异、灵敏和简捷的PCR检测蚊体内马来丝虫幼虫的方法。     

细胞毒作用对周期型马来丝虫微丝蚴化学元素含量的影响

目的　通过观察细胞毒作用对周期型马来丝虫微丝蚴 (mf)化学元素含量的影响 ,进一步探讨宿主体内杀伤虫体的机制。方法　应用原子吸收光谱分析法对细胞毒作用前后的周期型马来丝虫mf7种微量元素和 2种常量元素的含量进行检测分析。结果　所测的周期型马来丝虫mf7种微量元素中铁 (Fe)含量最高 ;镉 (Cd)含量最低。常量元素钙 (Ca)高于镁(Mg)。经细胞毒作用后虫体各微量元素和常量元素含量均有所下降 ,尤其是微量元素中的铁 (Fe)、铜 (Cu)、锰 (Mn)、铬 (Cr)、镉 (Cd)铝 (Al)和常量元素中的镁 (Mg)下降显著 (P <0 0 1 )。结论　经细胞毒作用后虫体内的微量元素和常量元素大量丢失 ,造成其营养代谢和生理功能的障碍 ,可能是宿主体内杀伤丝虫mf,导致虫体死亡的因素之一     

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂和3-磷酸甘油醛脱氢酶复合基因真核表达载体的构建及免疫研究

目的 构建周期型马来丝虫(Bm)半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)重组复合基因真核表达质粒,观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应.方法 将重组质粒pGEM-T/BmCPI和pGEM-T/BmG APDH以及真核重组表达载体分别进行双酶切,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH.将纯化的pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH和含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组及空质粒对照组,共免疫3次,每次间隔2周.采用RT-PCR方法检测肌肉组织内的目的基因,采用四甲基偶氮唑盐( MTT)法和ELISA法分别检测免疫小鼠T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中IFN-γ、IL-4水平.统计学分析采用t检验.结果 pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH复合基因真核表达载体免疫小鼠后,从小鼠肌肉组织内扩增出目的基因.免疫6周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组和pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组T淋巴细胞刺激增殖指数分别为1.466±0.635和1.610±0.112,显著高于PBS组的1.004±0.019和pcDNA3.1(+)-CpG组的1.078±0.129(t=64.438、45.318、42.749、34.314,均P＜0.05).免疫4周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组IFN-γ、IL-4水平均高于pcDNA3.1(+)-CpG组(t=288.053、76.453,均P＜0.05),其中IFN-γ水平与pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组相比也有明显提高(t=129.642,P＜0.05).结论 pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH重组复合基因真核表达载体能在小鼠体内表达,并可有效诱导特异性细胞免疫应答.     

马来丝虫幼虫经细胞毒作用后氨基酸的变化

目的观察马来丝虫微丝蚴(mf)经细胞毒作用后氨基酸含量的变化,进一步探讨宿主体内杀虫机制.方法应用高速氨基酸分析仪对细胞毒作用前后的周期型马来丝虫mf进行氨基酸组成及含量的分析比较.结果马来丝虫mf含17种氨基酸,缺少色氨酸.经宿主细胞毒作用后的虫体氨基酸绝对含量明显低于细胞毒作用前(P＜0.05).其中,精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸下降显著(P＜0.01).结论氨基酸含量下降,尤其是碱性氨基酸与酸性氨基酸、芳香族氨基酸之间比率下降可能是宿主体内杀伤丝虫mf的后果之一.     

马来丝虫肌球蛋白部分编码基因Bm-M55的克隆与真核表达

根据马来丝虫肌球蛋白部分编码基因（Bm-M55）序列设计引物,以其微丝蚴总RNA为模板,反转录PCR扩增目的基因。用TA克隆方法将目的基因克隆至载体pGEM?鄄T Easy中,经PCR和双酶切鉴定并测序后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1（+）,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）/Bm-M55,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）对获得重组蛋白Bm?鄄M55进行分析和鉴定。RT-PCR鉴定结果显示, 转染的COS-7细胞表达了Bm-M55基因,根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank（登录号为AAA27858）中的一致,重组蛋白Bm-M55相对分子质量（Mr）约为 55 000。     

Field validation of sensitivity and specificity of rapid test for detection of Brugia malayi infection

We conducted a field study of a rapid test (Brugia Rapid) for detection of Brugia malayi infection to validate its sensitivity and specificity under operational conditions. Seven districts in the state of Sarawak, Malaysia, which are endemic for brugian filariasis, were used to determine the test sensitivity. Determination of specificity was performed in another state in Malaysia (Bachok, Kelantan) which is non-endemic for filariasis but endemic for soil-transmitted helminths. In Sarawak both the rapid test and thick blood smear preparation were performed in the field. The rapid test was interpreted on site, whereas blood smears were taken to the district health centres for staining and microscopic examination. Sensitivity of Brugia Rapid dipstick as compared with microscopy of thick blood smears was 87% (20/23; 95% CI: 66.4-97.2) whereas the specificity was 100% (512/512). The lower sensitivity of the test in the field than in laboratory evaluations (> or =95%), was probably due to the small number of microfilaraemic individuals, in addition to difficulties in performing the test in remote villages by field personnel. The overall prevalence of brugian filariasis as determined by the dipstick is 9.4% (95% CI: 8.2-0.5) while that determined by microscopy is 0.90% (95% CI: 0.5-1.3) thus the dipstick detected about 10 times more cases than microscopy. Equal percentages of adults and children were found to be positive by the dipstick whereas microscopy showed that the number of infected children was seven times less than infected adults. The rapid dipstick test was useful as a diagnostic tool for mapping and certification phases of the lymphatic filariasis elimination programme in B. malayi-endemic areas.