逆转录病毒载体介导MDR1基因转染人外周血造血干细胞的研究

目的：多药耐药基因（ＭＤＲ１）的异常扩增和过度表达是肿瘤细胞产生多药抗药性的重要原因之一。本研究试图将ＭＤＲ１导入骨髓或外周血造知干细胞并使入获得耐药表型,以用于减轻大剂量化疗对造血细胞的毒性。方法：应用反转录病毒载体ｐＨａＭＤＲ１／Ａ将ＭＤＲ１阳性。ＰＣＲ法检测转染细胞所 ＣＦＵ－ＧＭ落集中,外源ＭＤＲ１阳性比例为１／４;而未转染细胞所形成的ＣＦＵ－ＧＭ集匀为阴性。集落形成试验证明,转染和非转染     

逆转录病毒载体介导的γ—干扰素基因在人肝癌细胞中的表…

以逆转录病毒载体将人源γ－干扰素基因转导入４种不同的人肝癌细胞株，经Ｇ４１８抗性筛选均获得了阳性克隆。ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＦ结果均表明ＩＦＮ－γ基因已在基因组ＤＮＡ中整合并表达。ＴＦＮ－γ生物活性检测结果表明，在基因修饰的４种不同个体人肝癌细胞株及同－细胞株的５种不同克隆中，分泌的ＴＦＮ－γ活性有较大差别。     

肿瘤坏死因子-α促进乳腺癌细胞ＭＣＦ-７迁徙的机制探讨

目的：探讨肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ-α,ＴＮＦ-α）诱导黏附分子ＣＤ４４表达的机制。方法：以０、２、２０、２００ｎｇ／ｍｌ浓度处理ＭＣＦ-７细胞,了解对ＭＣＦ-７细胞增殖以及迁徙的影响。Ｗｅｓｔｅｒｎ-ｂｌｏｔ方法检测ＭＡＰＫ（ＪＮＫ、Ｐ３８、ＥＲＫ）信号通路中蛋白磷酸化水平的变化;用ＭＡＰＫ抑制剂预处理后,检测ＣＤ４４表达水平。结果：ＴＮＦ-α可以改变ＣＤ４４亚型表达,并促进ＭＣＦ-７细胞的迁徙能力;ＴＮＦ-α可以激活ＪＮＫ信号转导通路,对Ｐ３８和ＥＲＫ信号通路无明显激活效应;用特异性的ＪＮＫ信号通路抑制剂可以阻断ＴＮＦ-α诱导的ＣＤ４４蛋白表达水平。结论：ＴＮＦ-α通过ＪＮＫ信号通路调节ＣＤ４４并促进ＭＣＦ-７细胞的迁徙能力。     

TNF-α基因转染多药耐药性人乳腺癌细胞的基因表达与生物学效应

目的　探索TNF α基因能否成功导入耐药细胞并获得表达 ,发挥生物学效应。方法　以重组逆转录病毒为载体将TNF α基因导入具有多药耐药 (MDR )表型的人乳腺癌细胞系MCF7/ADR ,经G 418抗性筛选获 4株阳性克隆。PCR、Elisa法鉴定并检测TNF α基因的整合和表达。细胞计数法观察细胞生长速度的改变 ,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果　 4株阳性克隆整合了TNF α基因并获得表达 ,分泌TNF α量分别为 341pg/ml(10 6cell/48h)、5 40 pg/ml、1737pg/ml、2 875 pg/ml。与对照细胞相比 ,TNF α分泌量较低的 2株细胞克隆生长速度无明显减慢 ,而 2株高表达TNF α的细胞生长速度明显减慢 ,生长抑制率分别为 32 .4%、5 4.8% ,且细胞周期受阻于S G2 /M期。结论　TNF α基因能成功导入耐药细胞并获得表达。高表达TNF α的细胞克隆生长明显受抑。     

肝癌多药耐药细胞株P—gp,MRP,GST—π表达水平的观察

为研究人肝癌多药耐药细胞株的耐药机理，应用ＢＥＬ－７４０２细胞株，通过不断提高培养液中阿霉素（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）的浓度，长期筛选培养，得到肝癌多药耐药株ＢＥＬ－７４０２／Ｄｏｘ。经ＭＴＴ法检测ＢＥＬ－７４０２对长春新碱（ＶＣＲ）等８种抗癌药的抗性提高了２７倍～１１００倍。采用流式细胞技术检测了细胞株表面ＭＤＲ１蛋白Ｐ－ｇｐ、多药耐药相关蛋白ＭＲＰ及谷脱甘肽硫转移酶ＧＳＴ－π的表达；用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测了ＭＤＲ及ＭＲＰ基因表达水平。流式细胞分析发现，９３．５％～９７．４％的ＢＥＬ－７４０２／Ｄｏｘ细胞表面Ｐ－ｇｐ表达阳性；８４．７％～９０．２％的ＢＥＬ－７４０２／Ｄｏｘ细胞表面ＭＲＰ表达阳性；ＢＥＬ－７４０２细胞与ＢＥＬ－７４０２／Ｄｏｘ细胞ＧＳＴ－π的表达无明显变化。ＲＴ－ＰＣＲ证实此细胞株中有ＭＤＲ及ＭＲＰｍＲＮＡ的较高表达。     

肿瘤坏死因子与白细胞介素2协同抑制肺腺癌细胞的研究

目的：检测肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）、白细胞介素２（ＩＬ－２）单用或合用对肺腺癌Ａ５４９细胞系（Ａ５４９）和耐顺铂Ａ５４９细胞系（Ａ５４９／ＤＤＰ）的细胞毒性作用。方法：采用四氮唑蓝快速比色法（ＭＴＴ法）进行体外细胞毒性实验。结果：ＴＮＦα对两株细胞的毒性作用无显著差异;与ＩＬ－２合用后,ＴＮＦα对两株细胞的毒性作用分别较单用时均明显增强（Ｐ〈０．０１）。结论：ＴＮＦα与ＩＬ－２对两株细胞具有协同     

外源MDR-1基因对小鼠肺腺癌细胞耐药性产生的影响及机理研究

目的 了解ＭＤＲ－１基因表达中细胞药性的关系。方法 用ＦＵＧＥＮ＾ＴＭ６转染试剂将ＭＤＲ－１基因导入小鼠Ｌｅｗｉｓ肺腺癌细胞株（３ＬＬ）,建立池耐药细胞株（３ＬＬ－ＭＤＲ－１）．用ＭＴＴ方法测定和划搏定对药的逆转效应,ＭＤＲ－１基因表达产物ｐ－ｇｐ采用免疫组化方法观察,应用流式细胞仪分析其对示踪剂罗丹明１２３的摄取与排泄。结果 建立了一株能稳定表达ｐ－ｇｐ和对长春生物碱类、鬼白纱类具有显著耐药性的     

初治急性白血病多药耐药基因表达水平的定量开究

为了建立一种稳定可靠的多药耐药基因（ＭＤＲ１）ｍＲＮＡ检测方法，探讨ＭＤＲ１基因表达检测的临床价值，我们采用ＲＴ－ＰＣＲ１方法定量检测了Ｋ５６２、Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞株和３０例初治急性白血病ＭＤＲ１的表达水平。结果发现：１）耐药Ｋ５６２／ＡＤＭ１细胞系的ＭＤＲ１表达较高，而Ｋ５６２敏感细胞系无表达。２）初治急性白血病患者ＭＤＲ１阳性表达率４０．０％，表达值为０．２２０８±０．０８９６。３）５例正常人对照均无ＭＤＲ１阳性表达。４）初治急性白血病ＭＤＲ１阳性表达组缓解率为４１．７％，明显低于阴性组８８．９％（Ｐ＜０．０１）。我们认为ＲＴ－ＰＣＲ是一种敏感性高、特异性强、可定量检测ＭＤＲ１表达手段，有临床实用价值；另外，初治急性白血病患者ＭＤＲ１表达检测的结果表明，ＭＤＲ１表达增加是化疗的一个不利因素，且对化疗方案的选择有一定的指导意义。     

急性白血病患者多药耐药基因表达及其临床意义

目的：研究急性白血病（ＡＬ）多药耐药（ＭＤＲ１）基因表达临床耐药的关系。方法：应用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），检测６８例ＡＬ患者骨髓和１０名正常人外周血单个核细胞中ＭＤＲ１基因的表达。结果：复发难治组ＭＤＲ１阳性率最高，与正常对照组、初治组、完全缓解组相比均有显著差异（Ｐ〈０．０５）。初治组ＭＤＲ１阳性病例与ＭＤＲ１阴性病例的首次完全缓解率（分别为４５．４５％和８８．８９％）之间有显著差异。ＭＤＲ１的表达在ＦＡＢ各亚型间略有差异。ＭＤＲ１阳性的复发难治ＡＬ患者，经环孢酶素Ａ（ＣｓＡ）逆转多药耐药后，完全缓解显著增高。结论：ＭＤＲ１基因过度表达可临床耐药，是预后的重要不得因素，是判断疗效及早期复发的一个重要标志。ＣｓＡ有较好的逆转复发难治ＡＬ多药耐药的作用。     

吴茱萸碱逆转人肺癌细胞株Ａ５４９／ＤＤＰ耐药机理的实验研究

目的　观察吴茱萸碱逆转人肺腺癌耐药株Ａ５４９／ＤＤＰ细胞耐药性的效果并探讨其与阻断ＮＦ κＢ信号传导通路的相关性。方法　采用ＭＴＴ法检测单用吴茱萸碱、顺铂（ＤＤＰ）以及两药联用在不同时间对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的增殖影响,计算ＩＣ５０及耐药逆转倍数。流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。ＲＴ ＰＣＲ检测各组ＭＤＲ１、ＮＦ κＢ、Ｂｃｌ-２、ＭＭＰ-２和ＶＥＧＦ的ｍＲＮＡ表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测各组细胞的ｐＩκＢ-α、pＩＫＫα蛋白表达水平。结果　吴茱萸碱０.１２５ｍｇ／Ｌ、０.２５ｍｇ／Ｌ针对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ的耐药逆转倍数分别为３.６６８和１1.４８。ＲＴ ＰＣＲ显示在吴茱萸碱作用下检测基因的ｍＲＮＡ表达随着吴茱萸碱浓度的增加和时间的延长其表达逐渐下降。当吴茱萸碱与ＤＤＰ联用时,可明显提高Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对化疗药的敏感性,凋亡细胞显著增加（Ｐ＜０.０５）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法结果提示Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ｐＩκＢ-α的表达水平随着吴茱萸碱作用时间的延长逐渐下降,ｐＩＫＫα表达则无显著变化。结论　吴茱萸碱可以通过抑制ＩκＢ-α的磷酸化阻断ＮＦ-κＢ信号通路,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,增加耐药细胞对ＤＤＰ的敏感性。     

乳腺癌MCF-7/Adr耐药细胞CD95分子的多态性表达和功能缺陷

目的：观察ＭＣＦ－１／Ａｄｔ耐药细胞ＣＤ９５分子的表达和功能及其与药敏细胞的差异，初步探讨ＣＤ９５缺陷与多药耐药的潜在关系。方法：对乳腺癌ＭＣＦ－７／Ａｄｔ耐药细胞的ＭＣＦ－７药物敏感细胞进行对比研究。流式细胞仪检测ＣＤ９５蛋白水平，ＲＴ－ＰＣＲ分析ＣＤ９５ ｍＲＮＡ转录体的多态性。碘化内啶染色和ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳观测抗ＣＤ９５单克隆抗体对ＭＣＦ－７／Ａｄｔ耐药细胞的诱导凋亡效应。结果：ＭＣＦ－     

非小细胞肺癌多药耐药基因表达及环孢菌素A对其逆转作用

研究非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者多药耐药基因（ＭＤＲ１）表达与化疗疗 间的关系,观察环孢霉素逆转ＭＤＲ１的疗效及毒性。方法利用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测４６例ＮＳＣＬＣ患者肿瘤细胞和外周血淋细胞ＭＤＲ１表达,根据检测结果将患者分成ＭＤＲ１阳性逆转组、ＭＤＲ１阳性对照组和ＭＤＲ１阴性组。所有患者接受至少２个周期的化疗,阳性逆转组患者在化疗同时给予ＣｓＡ,剂量为４ｍｇ／ｋｇ。结果肿瘤细胞同阳性率为６５．２     

细胞因子上调大肠癌细胞Fas配体表达

目的：研究白介素１８（ＩＬ－１８）等内源性细胞因子对大肠癌细胞ＦａｓＬ表达水平的调控作用。方法：采用Ｗｅｓｔｅｒｎ蛋白印迹法测定细胞因子处理后大肠癌细胞的ＦａｓＬ表达水平。结果：在检测的６株大肠癌细胞中,全部表达ＦａｓＬ蛋白;ＴＮＦ－α和ＩＦＮ－γ显著上调ＤＬＤ－１ ＦａｓＬ蛋白的表达水平;ＴＮＦ－α和ＩＦＮ－γ以及乙酸肉豆佛波醇（ｐｈｏｔｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ,ＰＭ     

急性非淋巴细胞白血病多药耐药基因与其免疫表型的关系

目的：探讨急性非淋巴细胞白血病（ＡＮＬＬ）多药耐药基因（ＭＤＲ１）与免疫表型表达的关系及意义。方法：应用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和间接免疫荧光法对５２例初治ＡＮＬＬ患者进行了ＭＤＲ，基因及免疫表型的检测。结果：ＡＮＬＬ患者ＭＤＲ１阳性表达率为３０．７％，其中Ｍ３明显低于其他亚型。ＭＤＲ１阳性ＡＮＬＬ患者ＣＤ３４表达率显著高于ＭＤＲ１阴性者；而其安全缓解率（３７．５％）则低于后者（８８．８     

白血病患者外周血IL－2、mIL－2R和TNF－α的检测及意义

４５例白血病患者，采用固相放射免疫分析法（ＲＩＡ）测定其血清白细胞介素２（ＩＬ－２）的水平，以流式细胞仪（ＦＣＭ）检测其外周血单个核细胞（ＰＭＮＣ）上膜白细胞介素２受体（ｍＩＬ－２Ｒ）的表达，用双抗体夹心ＣＥＬＩＳＡ法测定其血清肿瘤坏死固子α（ＴＮＦ－α）的含量。发现急性白血病（ＡＬ）及慢性位细胞白血病原始细胞危象（ＣＭＬ－ＢＣ）患者血清ＩＬ－２和ＴＮＦ－α的水平明显高于正常，ＣＭＬ－ＢＣ尤其急淋变者的ＰＭＮＣ上ｍＩＬ－２Ｒ阳性率较高，并与血清ＴＮＦ－α有关，而与血清ＩＬ－２无关，ｍＩＬ－２Ｒ阳性常提示白血病患者疗效差，预后不良。     

Fas／FasL系统在肿瘤细胞耐药中的作用

目的：探讨凋亡基因Ｆａｓ／ＦａｓＬ对肿瘤细胞耐药性的影响。方法：多发性骨髓瘤敏感株ＲＰＭＩ８２２６和耐药株和ＲＰＭＩ８２２６／Ｄｏｘ４０分别和Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、ＣＨ－１１作用，在不同时间和浓度下观察二株细胞的Ｆａｓ／ＦａｓＬ的表达和死亡情况。结果：Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ能上调Ｆａｓ／ＦａｓＬ在敏感株肿瘤细胞表面的表达，从而激发ＰＣＤ，而耐药株则无此作用，结论：耐药细胞通过改变其Ｆａｓ／Ｆａｓ     

人突变DHFR基因高效逆转录病毒载体及其在小鼠造血细胞…

本文用转染了人突变ＤＨＦＲ基因逆转录病毒载体的新一代产病毒细胞ＡＭ１２－Ｓ３１，研究了其耐药特性，产生的病毒滴度及ＤＨＦＲ基因在小鼠造血细胞的表达。ＭＴＴ法显示ＡＭ１２－Ｓ３１细胞对Ｇ４１８和氨甲喋呤耐受，对照细胞ＡＭ１２对Ｇ４１８和ＭＴＸ敏感。     

含MDR基因的人乳腺癌MCF 7/pZMDR多药耐药细胞株的构建

目的：肿瘤细胞的多药抗药性（ＭＤＲ）是化疗失败的主要原因之一，Ｐ－糖蛋白高表达是ＭＤＲ的主要机制，逆转ＭＤＲ成为肿瘤治疗亟待解决的问题。目前用于研究抗药性和筛选逆转抗药性药物的模型较少，本实验拟构建多药抗药性细胞株。方法：采用基因工程技术，重组ＭＤＲ１基因ｃＤＮＡ于逆转录病毒载体ｐＺＩＲ－ＮｅｏＳＶ（Ｘ）的克隆位点，并用脂染胺（ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）介导的ＤＮＡ转移技术，将其转入包装细胞ＰＡ３１７中，收集含病毒子的培养上清液感染对药物敏感的人乳癌细胞株ＭＣＦ－７，经筛选培养基筛选，ＰＣＲ、免疫组化及阿霉素在细胞内的分布等实验。结果：含ＭＤＲ基因的逆转录病毒载体ｐＺＭＤＲ的构建方法证明是正确的，ＭＤＲ１ｃＤＮＡ已整合在染色体基因组中并表达Ｐ－糖蛋白。结论：建立的ＭＣＦ－７／ｐＺＭＤＲ细胞为一特异表达Ｐ－糖蛋白的多药抗药性转基因细胞株     

ＨＭＧＢ１表达载体转染结肠癌细胞对ＶＥＧＦ-Ｄ表达的影响

目的：构建ＨＭＧＢ１表达载体,转染结肠癌细胞,研究其对结肠癌细胞中血管内皮生长因子Ｄ（ＶＥＧＦ-Ｄ）表达的影响。方法：将分离得到的淋巴细胞总ＲＮＡ反转录合成ｃＤＮＡ,以此为模板进行ＰＣＲ扩增得到ＨＭＧＢ１基因;随后酶切转入载体ｐＭＤ１８Ｔ,通过亚克隆转入载体ｐＬｘｓｎ,得到重组质粒。重组体质粒经酶切鉴定后,并对插入的ＨＭＧＢ１基因片段进行测序,将已鉴定的阳性重组质粒用脂质体介导转染ＨＣＴ１１６细胞。通过ＲＴ-ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＨＭＧＢ１和ＶＥＧＦ-Ｄ的表达情况。结果：成功构建含ＨＭＧＢ１的表达载体。ＲＴ-ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测发现转染表达ＨＭＧＢ１载体的ＨＣＴ１１６细胞中ＨＭＧＢ１和ＶＥＧＦ-Ｄ的表达均增高。结论：ＨＭＧＢ１可以通过促进结肠癌细胞中ＶＥＧＦ-Ｄ的表达,诱导淋巴管生成,从而促进其淋巴结转移。     

逆转录病毒载体介导的核酶基因转移有效恢复肿瘤细胞的？…

目的：为了研究抗ＭＤＲＩ核酶逆转肿瘤细胞中Ｐ－ｇｐ介导的多重耐药性（ＭＤＲ）的作用。方法：首先,我们建立了单纯由Ｐ－ｇｐ介导的、２０倍耐药的人Ｄａｕｄｉ淋巴瘤细胞的模型－Ｄａｕｄｉ／ＭＤＲ２０。同时我们将表达不同抗ＭＤＲ１核酶的逆转录病毒载体（Ｎ２Ａ＋ｔＲＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－Ｒｚ,Ｎ２Ａ＋ｔＢＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－ｓＲｚ和 Ｎ２Ａ＋ｔＲＮＡｉｍｅｔ－ｉＭＤＲＩ－ｓＲｚ）转染到ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２细胞中进行包装,获得了高滴度的病毒［（１,１～２．５）×１０ｃｆｕ／ｍｌ］。后者用于感染Ｄａｕｄｉ／ＭＤＲ２０。结果：通过一系列分子生物学检测证实,携带３种核酶的逆转录病毒不但整合到ＤＮＡ中,而且也高水平表达相应的核酶ｔＲＮＡｉｍｅｔ－ｉＭＤＲ１－ｓＲｚ,ｔＲＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－ｓＲｚ和ｔＲＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－Ｒｚ。结果表明,ｔＲＮＡｉｍｅｔ－ｉＭＤＲ１－ｓＲｚ和ｔＲＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－ｓＲｚ转导的Ｄａｕｄｉ／ＭＤＲ２０细胞完全逆转了对长春新碱的敏感性,并伴随着ＭＤＲ１　ｍＲＮＡ和Ｐ－ｇｐ表达的阻断。结论：逆转录病毒载体高效介导的抗ＭＤＲ１核酶的基因转移能够完全逆转肿瘤细