抗大肠杆菌O157：H7鸡卵黄抗体的制备及其被动保护作用的研究

目的 制备鸡蛋卵黄免疫球蛋白IgG抗体（Yolk Immunoglobulin,IgY)，研究其对肠出血性大肠杆菌（EHEL）O157：H7的被动保护作用。方法 采用EHEC O157：7933菌株制备抗原，免疫SPF莱杭鸡，用脱脂和盐析的方法，从其所产鸡蛋中提取IgY抗体，用所得抗体对乳鼠进行动物毒性试验及动物被动保护实验。结果 用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测提取IgY抗体滴度达到1：200000以上，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)检测所提取抗体纯度及回收率较高。未发现IgY抗体对动物的毒性作用，被动保护实验结果表明，IgY抗体对乳鼠感染模型具有明显的保护作用。结论 （1）通过常规免疫技术，可使SPF鸡产生高效价的IgY抗体。（2）脱脂和盐析是一种简便有效的IgY抗体制备方法。（3）建立了EHEC O157：H7的乳鼠肠道感染模型。（4）IgY抗体是治疗肠道感染的一种有潜力的口服药物。     

抗弓形虫特异性鸡卵黄抗体的制备与鉴定

目的　制备高效价特异性鸡卵黄免疫球蛋白 ( yolkimmunoglobulin ,IgY)抗体 ,为弓形虫病防治的研究探索新的方法和途径 ;方法　用提纯的弓形虫RH株抗原免疫育龄种鸡 ,获取大量含高效价IgY的卵黄 ,经水稀释法初步纯化浓缩后 ,用ELISA检定其免疫学活性 ,应用SDS -PAGE分析、鉴定IgY的分子基础 ;结果　获得ELISA效价为 1× 10 7的抗弓形虫IgY抗体 ,经SDS -PAGE分析 ,出现 1条蛋白带 ,其分子量大小根据电泳迁移率计算 ,初步鉴定为 4 6kDa用弓形虫抗原免疫Lyh ern种鸡制备的IgY抗体效价高、特异性强 ;水稀释法初步提纯获得的IgY抗体分子量为 4 6kDa,为在弓形虫病的特异性免疫学诊断、预防和治疗中的应用奠定基础。     

抗大肠杆菌O157∶H7鸡卵黄抗体的制备及其被动保护作用的研究

目的　制备鸡蛋卵黄免疫球蛋白IgG抗体 (YolkImmunoglobulin ,IgY) ,研究其对肠出血性大肠杆菌 (EHEL)O15 7∶H7的被动保护作用。方法　采用EHECO15 7∶H7933菌株制备抗原 ,免疫SPF莱杭鸡 ,用脱脂和盐析的方法 ,从其所产鸡蛋中提取IgY抗体 ,用所得抗体对乳鼠进行动物毒性试验及动物被动保护实验。结果　用酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测提取IgY抗体滴度达到 1∶2 0 0 0 0 0以上 ,SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)检测所提取抗体纯度及回收率较高。未发现IgY抗体对动物的毒性作用 ,被动保护实验结果表明 ,IgY抗体对乳鼠感染模型具有明显的保护作用。 结论　 (1)通过常规免疫技术 ,可使SPF鸡产生高效价的IgY抗体。 (2 )脱脂和盐析是一种简便有效的IgY抗体制备方法。 (3)建立了EHECO15 7∶H7的乳鼠肠道感染模型。 (4)IgY抗体是治疗肠道感染的一种有潜力的口服药物     

鸡卵黄抗体(IgY)的提纯及其在医学上的应用

鸡卵黄免疫球蛋白Ｇ抗体是一种 7Ｓ免疫球蛋白 ,与哺乳动物ＩｇＧ略有不同。该蛋白质分子量约为 180ｋＤａ ,含两个亚单位 ,即 6 7～ 70ｋＤａ的重链和2 2～ 30ｋＤａ的轻链[1] ,又称ＩｇＹ (ＹｏｌｋＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕ ｌｉｎ) ,存在于免疫后母鸡的卵黄中。实验证明 ,受免疫刺激后 ,母鸡产生免疫反应 ,在输卵管内卵黄成熟期 ,血液中ＩｇＧ可被选择性地转移到卵黄中 ,而且是卵黄中唯一的免疫球蛋白类[2 ] 。早在 6 0年代 ,科学家们就发现鸡卵黄中存在ＩｇＧ抗体[3,4 ] ,其含量与鸡血清相似甚至更高 ,但一直未引起足够的重视。显然是由…     

抗旋毛虫鸡卵黄抗体的活性检测

目的制备特异性抗旋毛虫的鸡卵黄免疫球蛋白,研究其免疫应答规律及其稳定性。方法用纯化的旋毛虫幼虫免疫育龄种鸡,经水稀释法初步纯化浓缩后获得卵黄抗体。应用酶联免疫吸附试验检测卵黄抗体的效价及其敏感性和稳定性。结果通过免疫可成功诱导出高效价的抗旋毛虫抗体,效价可达1∶106以上,免疫应答持续时间可达34周以上。免疫后卵黄抗体敏感性和血清抗体敏感性无显著性差异(P>0.05)。稳定性试验表明IgY敏感性高,在pH4～10及温度不超过60℃条件下活性稳定。结论成功制备出高效价的特异性抗旋毛虫卵黄抗体,其敏感性高,有一定的耐热、耐酸碱性,可进一步用于旋毛虫感染的研究。     

抗幽门螺杆菌粘附素HpaA卵黄抗体的制备

目的研制高效价特异性的抗幽门螺杆菌黏附素鸡卵黄抗体免疫球蛋白抗体。方法用纯化重组幽门螺杆菌黏附素(Helicobacter pyloriadhesin A,rHpaA)抗原免疫22周龄罗曼鸡,母鸡免疫应答后,在卵黄中产生抗幽门螺杆菌黏附素抗体;经硫酸铵法初步纯化浓缩后;以间接ELISA鉴定抗体效价及免疫学活性;采用Bradford法测定蛋白含量;并用SDS-PAGE法测定分子量及鉴定抗体纯度。结果母鸡初次免疫第10d即有抗体产生,初次免疫后75d左右抗体效价超过1∶10000;最高可达为1∶12800。卵黄抗体经硫酸铵法纯化后,用SDS-PAGE分析,出现两条蛋白带,纯度达95%以上。其含量为10.56mg/ml蛋黄。结论本研究首次研制并鉴定抗黏附素卵黄抗体,开拓了我国预防幽门螺杆菌感染的新领域,分析了抗体在产蛋期卵黄液中表达的进度,为今后该抗体的持续、高质量诱导奠定基础。有望获得高效价、高产量的抗黏附素的IgY抗体(IgY-HpaA),为制备口服制剂开辟了广阔前景。     

大肠杆菌O157：H7对小鼠感染的实验研究

目的　采用肠出血性大肠杆菌埃希氏菌 (EHEC)国际代表株O15 7∶H7-EDL933株 ,实验感染小鼠 (ICR) ,观察其感染和带菌消长情况。方法　ICR小鼠经口感染 ,剂量为 0 1～ 0 9ml(菌悬液浓度为 7 0× 10 8～ 4 0× 10 9CFU/ml) ,并在SPF动物实验室中饲养。结果　不同实验动物微生物等级的ICR小鼠对EDL933株表现出不同感染类型 ,Ⅰ级小鼠感染未成功 ;Ⅱ级小鼠为一过性排菌 (M =4h) ;Ⅲ级小鼠粪排菌中位数为 2 4h ,是Ⅱ级小鼠的 6倍。Ⅲ级小鼠发现盲肠带菌 ,阳性率为31 5 8% (6 / 19)。结论　研究结果提示 ,鼠可成为EHECO15 7∶H7的贮存宿主 ,可能是潜在的人类感染的传染源。不同实验动物微生物等级的ICR小鼠对EDL933株所表现出的感染类型 ,提示预防O15 7∶H7感染 ,可经口服菌苗来实现的可能性     

大肠杆菌O157∶H7 CVa9株O抗原变异的研究

目的　研究本实验室保藏的大肠杆菌O15 7:H7(E coliO15 7:H7)日本分离株CVa9O抗原的变异。方法　血清凝集试验检测CVa9菌株O和H抗原 ,区分O抗原变异株与非变异株。聚合酶链反应 (PCR)法分别检测O15 7和H7特异性基因。生化试验检测生化特性。观察菌株在麦康凯、山梨醇麦康凯、棉子糖麦康凯及ChromagarO15 7显色培养基上菌落形态 ,菌落计数法计算变异率。结果　抗 -O15 7抗血清与CVa9菌株进行玻片凝集试验出现强凝集 (CVa9- 8)和不凝集 (CVa9- 1、CVa9- 15 )两种菌落 ,试管凝集试验结果相同 ,证实不凝集菌落O抗原发生变异。抗 -HT 抗血清分别与变异株和非变异株H抗原进行试管凝集试验 ,均为强凝集。两种菌株O15 7和H7特异性基因均为阳性。变异株与非变异株生化特性基本相同 ,但变异株不发酵棉子糖。两种菌株在麦康凯及山梨醇麦康凯培养基上菌落形态特征没有区别。在ChromagarO15 7显色培养基上培养 4 8h ,变异株为浅紫红色 ,菌落周边呈毛边状 ,非变异株为紫红色 ,菌落边缘整齐。变异株在用棉子糖代替乳糖制备的棉子糖麦康凯培养基上菌落呈粉红色 ,非变异株呈红色。菌落计数显示变异率为 99 80 %。结论　CVa9菌株在保存过程中O抗原发生变异 ,菌落形态及部分生化特征亦有所改变。变异株和非变异株均携带O15     

出血性大肠杆菌O157菌壳的制备研究

目的利用温度控制噬菌体PhiX174裂解基因E的表达,制备出血性大肠杆菌O157∶H7菌壳,鉴定其裂解效率并观察其形态。方法利用PCR技术扩增得到噬菌体PhiX174裂解基因E并克隆到质粒pBV220中,将重组质粒导入出血性大肠杆菌O157∶H7。重组菌株O157∶H7(pBV220::E)培养温度从28℃突升至42℃,每20min检测菌液OD600值,绘制重组菌株生长曲线。体外菌落计数计算裂解效率,并通过电镜观察菌壳结构。结果获得了PhiX174裂解基因E全长基因及重组质粒,构建了大肠杆菌的重组菌株。重组菌菌液OD600值在温度突升至42℃后40min后开始显著下降,80min后OD600值趋于平稳。细菌的裂解效率为98.4%。电子显微镜观察显示,经诱导后,O157∶H7细菌内容物可以通过细菌表面的孔道流出,从而形成菌壳。结论本研究成功制备了大肠杆菌O157∶H7菌壳,为将来进一步研究O157菌壳的特性奠定了基础。     

江苏省肠出血性大肠埃希菌O157的基因PCR-RFLP分型研究

目的对历年从江苏省不同地区分离的肠出血性大肠埃希菌O157（以下简称：O157）进行分型分析。方法采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）方法对108株O157分子分型,比较不同地区、不同年份菌型差异。结果根据EcoRV限制性酶切图谱可将菌株分成JS01-JS10十个不同的型别。主要菌型JS01占64.9%,JS02型与JS01型菌株酶切图谱相似度很高,JS03和JS04型菌株数目较少（12株）,但近一半属于人源菌株。从时间方面看,1999年分离的菌型最多;从地区方面看,铜山县分离到的菌株型别最为多样化。结论不同菌型之间的致病性存在差异,菌株与地理来源的关系密切。PCR-RFLP方法操作简便、重复性好,为O157的流行病学研究提供了一条全新途径。     

非O157产志贺毒素大肠埃希菌研究进展

产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)是一类能产生一种或一种以上志贺毒素的大肠埃希菌的总称,包括400余种血清型,其中以O157∶H7血清型为主。近年来,非O157STEC在世界范围内引起散发感染和暴发的报道明显增加,但由于非O157STEC血清型多样,菌株间表型差异较大,目前尚无一种有效的能用于所有非O157STEC菌株分离的方法,因此非O157STEC的流行情况可能被低估。本文就非O157STEC的病原学、致病机制、流行病学特征、实验室诊断、治疗和预防等方面的研究进展做一简要综述。     

免疫人群乙肝抗体阳性率调查及乙肝核心抗体检测方法探讨

目的 调查我院检测人群乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)及乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)阳性率,并探讨检测方法选择及检测操作模式对免疫人群乙肝核心抗体结果的影响。方法 统计2012—2013年用化学发光微粒子免疫检测法(CMIA)和酶联免疫竞争抑制一步法(ELISA)检测乙肝人群的HBsAb及HBcAb阳性率,并按≤2岁、2~20岁、>20岁3个年龄分段比较;收集92例免疫人群样本用CMIA和3种ELISA法检测HBcAb;用同种ELISA法试剂,改变操作模式进行HBcAb检测。结果 3组年龄段检测人群HBsAb两种检测方法统计的阳性率无统计学差异,≤2岁组阳性率最高;HBcAb用CMIA法统计的阳性率在≤2岁组和2~20岁组的免疫人群组低于ELISA法。 92例样本用CMIA法检测HBcAb阳性率为2.2%;用3种ELISA法试剂检测阳性率分别为79.3%、82.6%及94.6%;3种ELISA法试剂检测阳性率无统计学差异。92例样本改变操作模式,用同种ELISA法检测试剂检测结果有19例为阴性,差异有统计学意义。结论 检测人群HBsAb检出率在2岁及以下人群最高,随年龄增长抗体下降。 HBcAb用CMIA法检测在免疫人群中检出阳性率明显低于EIISA法。ELISA竞争抑制一步法检测HBcAb易造成假阳性,如改用HBcAb单项加样操作或选用化学发光微粒子免疫检测法(CMIA)检测,可明显减少假阳性。     

浙江省O157大肠杆菌监测及其分子生物学特性

目的了解肠出血性大肠杆菌O157∶H7和其他O157大肠杆菌在浙江省动物、人群中的分布、流行以及PFGE分型、毒力基因携带状况。方法按全国O157∶H7监测方案在5-10月份肠道传染病高发季节,采集全省各地(市)肠道门诊腹泻病人粪便,进行O157大肠杆菌分离培养,并用免疫磁珠分离法对浙江省5个监测点的宿主动物进行O157∶H7分离培养、鉴定,可疑菌株以PCR法检测O157∶H7抗原、志贺样毒素(stx1和stx2)、粘附抹平因子(eaeA)及溶血素(hly)4种毒力基因。用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)方法进行同源性分析,同时选择14种抗生素进行药敏试验,并将分析结果与本省首株患者粪便中分离的产志贺样毒素的O157∶H7菌株进行比较。结果全省5个监测点2006年共监测动物粪便标本2377份,分离到4株O157∶H7菌株,阳性率为0.17%;同时在绍兴、舟山肠道门诊腹泻病人粪便中分离到2株O157:H?菌株。4株O157∶H7菌株,stx2、Hly、eaeA均阳性,stx1均阴性;2株O157∶H?菌株仅1株携带eaeA毒力基因。脉冲场凝胶电泳分型显示,4株O157∶H7菌株分3个型,除金华地区2006年分离所得2株完全相似外,其它相同地区不同年代分离的O157∶H7菌株及相同年代不同地区分离的O157∶H7菌株则完全不相似。2株O157∶H?菌株1株PF-GE电泳条带降解,另1株与其它O157∶H7菌株电泳条带差异明显。结论浙江省大肠杆菌0157菌株在动物中以携带stx2毒力基因的O157∶H7菌株为主,但在腹泻患者中则以不带志贺样毒素的O157∶H?菌株为主。不同地区分离的O157∶H7菌株PFGE分型差异明显。羊、奶牛是携带stx2毒力基因的O157∶H7大肠杆菌的主要宿主。各级疾控应加强对宿主动物和腹泻病人大肠杆菌O157的分离监测和流行病学调查。     

大肠埃希菌O157:H7脂肪酸组分及DNA特征研究

目的探讨大肠埃希菌O157：H7脂肪酸组分及DNA指纹图谱特征。方法用气相色谱（Gaschromatography，GC）及随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphyi cDNA，RAPD）对2株大肠埃希菌O157：H7和其他6株大肠埃希菌全细胞脂肪酸组分及DNA指纹图谱特征进行分析。结果大肠埃希菌O157：H7不仅含有15：0和17：0脂肪酸组分，不含或仅含微量14：02OH和19：0w8c脂肪酸，而且sum4和sum7脂肪酸峰值也明显高于其他菌株，DNA指纹谱也显示了其独有特征。结论大肠埃希菌O157：H7脂肪酸组分及相对含量和DNA指纹图谱特征与O26：H11及其他大肠埃希菌显著不同，与大肠埃希菌O26：H11等在遗传进化关系上存在一定距离。     

衢州市带毒力因子肠出血性大肠埃希菌O157：H7的检测

目的了解衢州市家禽、家畜肠出血性大肠埃希菌O157:H7带菌情况和菌型分布特征,以制定相应的防治对策。方法6月份肠道传染病高发季节,采集动物粪便标本,对O157:H7菌株进行分离培养,并用PCR方法检测其毒力基因。结果共采集动物粪便标本300份,检出O157:H7菌16株,总带菌率为5.33%,其中牛、羊、猪带菌率较高,分别为20.83%、12.70%和3.61%。经PCR检测,检出的所有菌株均携带SLT2毒力因子,而SLT1与hly阴性。结论衢州市分离到带有毒力基因的肠出血性大肠埃希菌O157:H7,对人群健康构成了威胁,应加强O157:H7的综合监测。     

上海地区2006-2009年分离的大肠埃希菌O157特征分析研究

目的分析2006年至2009年在上海地区各监测点从病人、动物粪便及食品中分离的13株大肠埃希菌O157（E.coliO157）携带毒力基因的情况,分子分型特征及各菌株之间的相关性。方法利用聚合酶链反应（PCR）和脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术,结合生化鉴定、血清学分型的表型分析方法及Vero细胞毒性试验对上海地区分离的13株E.coliO157进行研究。结果 PCR结果显示有9株菌株的菌体抗原基因O157,鞭毛抗原基因H7及毒力基因stx2,hly,eaeA检测结果均为阳性,其中1株食品分离株的stx1基因检测结果也为阳性;9株菌均对Vero细胞有毒性作用。其余4株牛粪分离株,除O157基因检测结果为阳性外,其他检测结果均为阴性。13株上海分离株可分成6个PFGE型别。其中1株食品分离株与同样带有stx1基因的德国分离株的图谱最为接近;2株腹泻病人分离株属于同一PFGE型别;6株牛粪分离株的PFGE型别相同或高度相似。其余4株不携带毒力基因的牛粪分离株为不相关菌株。结论上海地区从病人、动物粪便和食品中都分离获得了能产生stx毒素的E.coliO157,提示需加强对该菌的监测。     

Preparation of immunomagnetic iron-dextran nanopartides and application in rapid isolation of E.coli O157:H7 from foods

AIM: To prepare a kind of magnetic iron-dextran nanopartides that was coated with anti-E.coli O157:H7 IgG, analyze its application conditions, and try to use it to isolate E.coli O157:H7 from foods. METHODS: Magnetic iron-dextran nanopartides were prepared by the reaction of a mixture of ferric and ferrous ions with dextran polymers under alkaline conditions. The particles were coated with antiserum against E.coli O157: H7 by the periodate oxidation-borohydride reduction procedure. The oxidation time, amount of antibody coating the particles, amount of nanoparticles, incubation time and isolation time were varied to determine their effects on recovery of the organisms. Finally, the optimum conditions for isolating E.coli O157:H7 from food samples were established. RESULTS: E.coli O157:H7 can be isolated from samples within 15 min with the sensitivity of 101 CFU/mL or even less. In the presence of 108 CFU/mL of other organisms, the sensitivity is 101-102 CFU/mL. Nonspecific binding of other bacteria to the particles was not observed. Two and a half hours of enrichment is enough for the particles to detect the target from the food samples inoculated with 1 CFU/g. CONCLUSION: Isolation of target bacteria by immuno magnetic nanoparticles is an efficient method with high sensitivity and specificity. The technique is so simple that it can be operated in lab and field even by untrained personnel.