何首乌ISSR—PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化ISSR-PCR反应体系.方法 通过单因素实验研究ISSR反应体系中主要成分(模板、Taq DNA聚合酶、Mg2 、引物、dNTPs)以及退火温度对扩增结果的影响.结果 建立了适合何首乌ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25μl反应体系中,内含1×Taq酶配套缓冲液、100ng模板、1.5 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2 、0.6μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTPs.扩增程序为94℃预变性5 min;然后是94℃变性45s,(据不同引物的退火温度)复性1 min,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸7 min,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行何首乌鉴定及种质资源遗传多样性分析提供了一个标准化程序.     

三角叶黄连ISSR反应体系的建立与优化

目的 针对三角叶黄连ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR-PCR分子标记反应体系,为进一步研究三角叶黄连的种质资源遗传多样性奠定基础.方法 通过筛选引物并设定影响三角叶黄连ISSR-PCR反应诸因子的不同梯度,检测其不同反应体系的扩增效果,分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立三角叶黄连ISSR-PCR稳定可靠的反应体系.结果 建立了可用于三角叶黄连ISSR-PCR分析的最适宜的反应体系:25 μLPCR反应体系中,内含10×PCR Buffer 2.5 μL,1.5 mmol/L Mg~(2+),200 μmol/L dNTP,0.3 μmol/L 引物,40 ng模板,1.0 U Taq DNA聚合酶.扩增程序为94℃预变性5 min,然后进行35个循环:94℃变性30 s,(据不同引物的退火温度)复性60 s,72℃延伸90 s,循环结束后72℃延伸7 min,4℃保存.结论 所建立的三角叶黄连ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点,可以较好地应用于三角叶黄连的种质资源遗传多样性及居群鉴别的研究.     

瓜蒌ISSR-PCR最佳反应体系的研究

为了得到适合研究瓜蒌农家品种的ISSR-PCR反应条件,本研究采用单因素实验和正交实验,对瓜蒌ISSR反应体系进行了优化,确立了适合瓜蒌的ISSR反应体系:20μL反应体系,含0.5μmol/L引物、2×Master Mix(Taq DNA Polymerase)10μL、35 ng模板DNA。通过性状差异较大样品的单因素试验,确定了能够适合尽量多样品的ISSR最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,退火1 min,72℃延伸45 s,35个循环;72℃延伸7min,4℃保存。不同的引物所需要的退火温度不尽一致。     

党参ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的：建立党参的ISSR-PCR反应体系,为今后利用ISSR标记技术进行党参鉴定及种质遗传多样性分析提供一个标准化程序。方法：采用试剂盒法提取党参基因组DNA为模板,通过单因素实验分析了ISSR-PCR反应体系中MgCl2、dNTPs、引物浓度、TaqDNA聚合酶、模板DNA用量及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响。结果：建立了重复性好,分辨率高的ISSR-PCR反应体系,即在25μL反应体系中,含有10×PCR Buffer缓冲液2.5 μL,MgCl2 2.0 mmol·L-1,dNTPs 0.5 mmol·L-1,引物0.4 μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA为30 ng;扩增程序为：94 ℃预变性5 min,然后94 ℃变性30 s,51.7 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,共计35个循环,循环结束后在72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。结论：建立了适用于党参的ISSR-PCR反应体系,为应用ISSR技术鉴定党参种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。     

蒲公英总DNA的提取及其RAPD-PCR反应条件的优化

目的 建立并优化蒲公英样品总DNA提取方法及其RAPD-PCR反应体系.方法 采用改良的CTAB法提取基因组DNA,对蒲公英RAPD-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选.结果 建立了多态性高、重复性好、可用于蒲公英RAPD分析的最佳反应体系.25 μl反应体系中含有:1×Taq Mix buffer,50 ng DNA模板,0.4 μmol/L 引物,1.5 mmol/L Mg2+,0.25 mmol/L dNTPs,1.25U Taq酶.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,38℃复性1 min,72℃延伸2 min,共40个循环;72℃延伸10 min,反应结束后,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用RAPD标记技术进行蒲公英鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础.     

当归ISSR-PCR反应体系的建立优化及引物筛选

目的建立并优化当归的ISSR-PCR反应体系,并进行引物筛选。方法以当归基因组DNA为模板,通过单因素实验研究了ISSR反应体系中主要成分(Taq DNA聚合酶、d NTP、模板、引物)以及热循环参数(退火温度、退火时间、变性时间、延伸时间、循环数)对扩增结果的影响。结果找出了各自的最适条件,建立了适合当归ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在20μl反应体系中,内含10×Taq Buffer(含1.5 mmol·L-1Mg Cl2)、1.25U Taq DNA聚合酶、250μmol·L-1d NTP、40 ng模板、0.25μmol·L-1引物。扩增程序为94℃预变性5 min,然后进行35个循环:94℃变性30 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸150 s,循环结束后72℃延伸7 min,-4℃保存。结论以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出17条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。该研究为当归药材DNA鉴定、种质资源研究以及优良品种选育奠定了基础。     

驴皮药材RAPD分析方法建立及其与伪品马皮的鉴别

目的 建立驴皮药材RAPD分析方法并用于伪品马皮的鉴别.方法 采用化学试剂盒法确定了驴皮药材中DNA提取的最佳条件,采用L16(45)正交设计方法,针对Taq酶、Mg2+、dNTP、模板DNA、引物设计了5因素4水平的正交试验,优化了RAPD-PCR反应条件.结果 驴皮药材RAPD-PCR反应体系的最佳条件为25 μL反应体系中含有Taq酶1.5U、Mg2+0.15 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、模板DNA 1.5 μL、引物0.5 μmol/L;PCR反应条件为95℃预变性5 min,94℃变性30 s,37℃退火30s,72℃延伸1 min,共30个循环,最后72℃延伸7 min.RAPD反应结果中300～400 bp处的条带可作为鉴别驴皮及其伪品的特异性条带.结论 所建立的RAPD分析方法具有简便快捷、稳定性好、重现性高的特点,可用于驴皮药材及其伪品马皮的鉴别.     

辽细辛和北马兜铃ISSR-PCR的引物筛选及反应体系的建立与正交优化

目的探寻适合细辛和马兜铃品种鉴定的ISSR引物。方法利用一个品种对全部100条ISSR引物设置退火温度进行梯度实验,筛选出重复性好、条带清晰的引物5条,从理论上讲,这些筛选的引物可以实现对现有辽细辛和北马兜铃品种的鉴定。马兜铃属ISSR-PCR的引物筛选,利用正交试验设计的方法,从Taq DNA聚合酶浓度、Mg~(2+)浓度、dNTP浓度、引物浓度,这4种因素3个水平,对马兜铃属ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果从样品中筛选出优选引物,细辛UBC815、UBC826、UBC862、UBC868、UBC888;马兜铃UBC825、UBC827、UBC836、UBC846、UBC848。反应体系的稳定性进行检测结果均稳定可靠。结论得到马兜铃的最佳组合,即20μL ISSR-PCR反应体系中含0.25 Lmol/L引物、1.5 mmol/L Mg~(2+)、1×PCR buffer、150 Lmol/L dNTP和0.5 UTaqDNA聚合酶。PCR反应条件为94℃预变性5 min,以30个循环94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,最后以72℃延伸10 min。得到细辛的最佳组合,20μL ISSR-PCR反应体系中含0.50 Lmol/L引物、1.5 mmol/L Mg~(2+)、2×PCR buffer、250 Lmol/L dNTP和2.0 UTaqDNA聚合酶;同时得到最佳模板DNA浓度为10 ng,最佳退火温度为50℃。     

红景天属植物DALP反应体系的建立

目的 利用直接扩增片段长度多态(DALP)这一新分子标记技术建立一套稳定的红景天属植物的DALP反应体系。方法 以红景天基因组DNA为模板,对DALP反应程序的一些重要参数进行摸索和优化试验。结果 建立了一套稳定性强、可靠性高的DALP应用反应体系;经过大量重复性实验,反应体系为20μL,Mg2 浓度为2.5 mmol/L,dNTPs浓度为1.25 mmol/L,模板DNA的量为60 ng,5 pmol/L选择性引物1μL,5 pmol/L反向引物3 μL,引物浓度比为1:3,Taq酶2 U。反应过程为:95℃预变性5 min、94℃变性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸1 min;30个循环,再72℃延伸10 min,完成整个PCR反应。结论 该体系可有效地应用于红景天属药材的分类鉴定和地道性鉴定。     

美花石斛RAPD-PCR反应体系的建立

目的建立美花石斛基因组DNA的RAPD-PCR最佳反应体系。方法在提取纯化美花石斛基因组DNA的基础上,利用PCR扩增技术和方法,对Mg2 ,dNTP,模板DNA,引物,Taq聚合酶等反应条件进行优化。结果反应体系的最佳条件是总体积为25μl,其中Mg2 浓度1.2 mmol.L-1,Taq聚合酶1.2U,引物浓度0.3 mmol.L-1,模板DNA 46 ng和dNTPs 160 mmol.L-1;PCR扩增程序为94℃预变性3 min,94℃变性50 s,40℃退火1 min,72℃延伸2 min,循环40次,72℃延伸5 min。结论该反应体系具有经济,简便以及扩增条带较清晰而稳定等特点。     

蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序的建立与优化

目的:优化蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序;筛选适合的引物,并确定最佳退火温度.方法:采用CTAB法提取蒲公英叶片的DNA,利用正交试验设计,从Taq酶MIX、模板DNA、引物3种因素2个水平,对蒲公英ISSR-PCR反应体系进行考察;采用单因素实验对其扩增程序进行优化.结果:确立了适合于蒲公英的最佳ISSR-PCR反应方法,即在25 μL反应体系中,内含Taq酶MIX 15 μL(1.25 UTaq DNA聚合酶,1.8 mmol·L-1 Mg2+,dNTPs各0.24 mmol·L-1),0.3 μmol·L-1引物,5 ng模板.在此基础上,从50条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.结论:采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过验证,证明该体系稳定可靠,可用于蒲公英遗传分析.     

远志种质资源遗传多样性随机扩增多态性DNA分析

目的 用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分析远志Polygala tenuifolia Willd.及卵叶远志P.sibirica L.的遗传多样性.方法 反应总体积25 μl,内含10×PCR buffer 2.5 μl,dNTPs 2.0 μl,MgCl2 2.0 μl,引物1.0 μl,模板2 ng,Taq酶0.3 μl.扩增程序为:94℃预变性4 min,然后进行45循环:94℃变性15 s,36℃复性1 min,72℃延伸1.3 min,循环结束后72℃延伸4 min.结果 10个引物共检测到154个位点,平均每个引物扩增9.24条带,其中148条带表现为多态性,占总带数的94.3%;距离系数为24时,11个样品明显聚为远志居群和卵叶远志居群两类.结论 远志与卵叶远志具有丰富的遗传多样性,遗传聚类与其地理分布有一定的相关性.     

夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的 建立并优化夏枯草ISSR-PCR反应体系和扩增程序.为探讨夏枯草种质问遗传多样性奠定基础.方法 采用单因子试验和正交设计方法,研究.Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对PCR扩增的影响.结果 夏枯草ISSR-PCR的最佳反应体系为:在20 μL的反应体系中含模板DNA 30ng,Mg2+ 2.2 mmol/L、dNTP 175 μmol/L、引物0.75μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U.在此基础上,从92条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.并通过梯度PCR试验.确定引物最佳退火温度.结论 采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份夏枯草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于夏枯草遗传分析.     

药用植物胡黄连ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 优选胡黄连稳定的ISSR-RCR反应体系.方法 采用4因素(dNTRs、Mg~(2+)、Taq酶、引物)4水平的正交实验和单因子梯度优化相结合的方法.结果 适于胡黄连的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素最佳浓度分别为10×buffer 2.5 μl,dNTPs 150μmol/L,Mg~(2+)1.5mmol/L,Taq酶1U,引物0.5 μmol/L,DNA 20 ng或10×buffer 2.5 μl,dNTPs 150μmol/L,Mg~(2+)2 mmol/L,Taq酶0.5 U,引物0.4 μmol/L,DNA 20 ng.结论 对于胡黄连ISSR-RCR试验,一次正交实验完全可以建立起满足要求的PCR体系.     

铁皮石斛居群差异的研究ⅡISSR指纹标记方法的建立与优化

目的:针对铁皮石斛ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR分子指纹标记反应体系,为进一步研究铁皮石斛的居群差异奠定基础。方法:通过筛选引物并设定影响铁皮石斛ISSR反应的诸因子的不同浓度,检测IS-SR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立铁皮石斛ISSR稳定可靠的反应体系。结果与结论:首次建立了可用于铁皮石斛ISSR-PCR分析的最适宜的反应体系:25μL PCR反应体系中,10×Taq酶配套缓冲液,1.5 U Taq DNA聚合酶,1.2～1.8 mmol.L^-1MgCl₂,80μmol.L^-1dNTP,0.2μmol.L^-1引物,DNA模板约20 ng,退火温度52～60℃;实验表明:Taq酶质量、DNA模板品质、退火温度等对ISSR反应结果具有较大影响。所建立的铁皮石斛ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可以较好地应用于铁皮石斛的居群鉴别及居群分子生态的研究。     

基于方差分析优化菊花ISSR-PCR反应体系

目的 对影响药用菊花ISSR-PCR扩增效果的一些因素进行优化,为进一步研究其遗传多样性奠定基础.方法 基于方差分析方法,利用正交试验从Taq酶、Mg~(2+)、dNTP和引物等4因素3水平对药用菊花反应体系进行优化.结果 药用菊花ISSR-PCR的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Taq酶1.00 U,Mg~(2+)2.00 mmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,引物0.50μmol/L.结论 Taq酶、Mg~(2+)、dNTP等对ISSR反应结果有极显著影响.所建立的药用菊花ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于药用菊花的遗传多样性研究.     

正交设计优化翼梗五味子ISSR-PCR反应体系

目的对影响翼梗五味子ISSR-PCR扩增反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法基于正交极差分析方法,以Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物5因素4水平的正交试验对翼梗五味子ISSR-PCR反应体系进行优化。结果翼梗五味子ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:Taq酶1.00 U、Mg2+1.50 mmol/L、模板DNA 40.00 ng、dNTP 0.25mmol/L、引物0.50μmol/L。筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并确定了每个引物的最佳退火温度。结论所建立的翼梗五味子ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、重复性好等优点,为翼梗五味子的分子水平研究提供实验依据。     

三叶木通MSAP反应体系的优化及引物筛选

目的研究三叶木通表观遗传多样性,建立并优化三叶木通甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplifiedpolymorphism,MSAP)反应体系。方法以三叶木通叶片为材料,利用正交试验建立三叶木通MSAP的预扩增和选择性扩增的最佳反应体系。结果建立的MSAP最佳反应体系为酶切反应:HpaII/MspI 10 U,EcoR I 10 U;预扩增反应:总体积20μL,连接产物2μL,E00、HM00各125 ng,dNTPs 0.312 5 mmol/L,Mg2+1.875 mmol/L,Taq DNA聚合酶2 U;选择性扩增反应:总体积20μL,稀释200倍的预扩增产物5μL,引物E-ACT、HM-CAT各50 ng,dNTPs 0.250 mmol/L,Mg2+1.250mmol/L,Taq DNA酶1 U。利用优化的体系,最终从MSAP的80对引物中筛选出有效引物6对。结论建立的MSAP反应体系可用于后续三叶木通DNA甲基化的相关研究。     

利用多重等位基因特异PCR鉴别人参、西洋参

目的：查找并发现参类药材的SNP位点,利用多重等位基因特异PCR同时鉴别人参、西洋参。方法：查找GenBank上已收载的参类药材序列,进行比对分析,根据人参、西洋参的SNP位点设计引物,对PCR反应体系进行优选。在此基础上,对20个不同来源的人参、西洋参样品进行PCR扩增,根据各自的特异条带进行鉴别。结果：当退火温度为66 ℃时,出现249 bp条带的为人参,1 049 bp条带的为西洋参。该鉴别反应特异性高、重复性好,能在同一反应中准确鉴别人参、西洋参。结论：多重等位基因特异PCR能成功地对人参、西洋参进行鉴别,在中药材分子鉴定中具有推广应用价值。