Fas介导瘢痕疙瘩周围皮肤成纤维细胞凋亡及其基因检测研究

目的　探讨瘢痕疙瘩周围皮肤中是否有生物学活性异常成纤维细胞 ,以期进一步了解瘢痕疙瘩的发展机制。方法　所取新鲜组织标本进行细胞培养 ,通过碘化丙啶 (PI)染色、激光流式细胞仪比较不同浓度Fas单克隆抗体 (FasMcAb ,0～ 10 0 0 μg/L)作用后各组成纤维细胞凋亡率。采用聚合酶链反应 (PCR)技术对Fas基因外显子 8进行DNA扩增并测序。结果　FasMcAb作用2 4h后 ,瘢痕疙瘩成纤维细胞在各浓度段均不能凋亡 ,瘢痕疙瘩周围皮肤成纤维细胞随FasMcAb作用浓度的增加凋亡率虽有所增加 ,但总体比较与瘢痕疙瘩差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,而与正常皮肤差异有显著性 (P <0 .0 1)。瘢痕疙瘩周围皮肤 6例标本中有 4例 (4 /6)Fas基因外显子 8及其下游序列存在点突变及移码突变 ,均与同患者瘢痕疙瘩细胞基因序列分析结果一致 ,而两组正常皮肤成纤维细胞则未发现有任何形式的基因突变。结论　瘢痕疙瘩周围 0 .5cm皮肤内存在生物学活性异常细胞 ,这可能为瘢痕疙瘩浸润性生长的结果及其治疗后易复发的原因之一。     

Bcl—2和Fas基因在瘢痕成纤维细胞中的表达

目的研究凋亡基因Fas/Apo-1和抑凋亡相关基因Bcl-2在瘢痕形成机制中的作用.方法采用免疫组织化学方法对10例正常皮肤、10例增生性瘢痕及10例瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas/Apo-1和Bcl-2蛋白的表达进行检测.Fas蛋白稀释为1∶50;Bcl-2蛋白稀释为1∶40,阴性对照以PBS代替一抗.随机选择五个高倍视野,计算其细胞平均阳性率.结果Bcl-2蛋白在正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中阳性率分别为6.78%、38.6%和83.2%.瘢痕疙瘩、增生性瘢痕的表达阳性率高于正常皮肤,有非常显著性差异(P＜0.01),而瘢痕疙瘩的表达阳性率明显高于增生性瘢痕(P＜0.01).Fas/Apo-1蛋白在正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中阳性率分别为78.4%、80.4%和84.4%,三组间无显著性差异(P＞0.05).结论病理性瘢痕的形成与Bcl-2基因的过度表达有关,而对Fas基因介导的凋亡不敏感或凋亡受阻,亦是导致瘢痕过度增生原因之一.     

瘢痕疙瘩中核心蛋白聚糖和双糖链蛋白多糖mRNA表达及意义

目的 检测瘢痕疙瘩中两种小分子蛋白多糖核心蛋白聚糖(decorin)和双糖链蛋白多糖(biglycan) mRNA表达.方法 以含decorin/biglycan cDNA重组质粒为模板,体外转录合成decorin/biglycan cRNA探针,采用cRNA-mRNA原位杂交技术,检测增生性瘢痕疙瘩、成熟瘢痕和正常皮肤组织中decorin和biglycan mRNA表达.结果 增生性瘢痕疙瘩成纤维细胞中decorin mRNA表达水平较成熟瘢痕和正常皮肤组织减少(P <0.01),成熟瘢痕与正常皮肤组织相比差异无统计学意义(P >0.05).增生性瘢痕疙瘩成纤维细胞中biglycan mRNA水平与成熟瘢痕组织相比显著增高(P <0.01).在正常皮肤组织中,biglycan mRNA仅由表皮中分化的角朊细胞(棘细胞和颗粒细胞)表达;真皮成纤维细胞中未见表达信号.结论 小分子蛋白多糖decorin和biglycan mRNA表达在增生性瘢痕疙瘩中发生改变,提示与瘢痕疙瘩的形成有关.     

Fas介导的病理性瘢痕成纤维细胞的凋亡及部分相关死亡信号递质的传递

目的研究和比较增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞经FasMcab(Fas单抗)诱导产生凋亡的能力,同时探讨Ca2+、H+在其相应死亡信号通道中的作用.方法取手术切除的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织各 6例,通过细胞培养6～8代后,以FasMcab为处理因素作用于增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞24小时,比较两者凋亡率.同时,应用粘附式细胞仪检测FasMcab作用下胞内Ca2+ 、H+的变化.结果①增生性瘢痕成纤维细胞在工作浓度以上的FasMcab作用下,随着单抗浓度的增高,其凋亡率不断增高而瘢痕疙瘩成纤维细胞在各浓度梯度下,均未发现明显的凋亡,且各组间无显著差异;③在FasMcab作用下,增生性瘢痕成纤维细胞内Ca2+显著增高而瘢痕疙瘩成纤维细胞内Ca2+无变化;④在Fa sMcab作用下,增生性瘢痕、瘢痕疙瘩成纤维细胞内H+均下降,两组间无显著的差异.结论①瘢痕疙瘩成纤维细胞有别于增生性瘢痕成纤维细胞,FasMcab 不能诱导其产生正常的凋亡.鉴于Fas介导的凋亡被认为是介导死亡信号传递的最主要通道,Fas介导凋亡的异常可能是瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖-凋亡调控异常的细胞生物学机制之一 ;②Ca2+作为Fas信号通道中一种重要的下游信号通道介质,在Fas介导的病理性瘢痕成纤维细胞凋亡中起着重要作用;③H+参与了成纤维细胞内Fas信号的传递;但H+ 作为重要的信号递质,它的变化并非Fas介导成纤维细胞凋亡所必需的.     

FasMcab对病理性瘢痕成纤维细胞生物学活力的影响

目的探讨FasMcab对病理性瘢痕成纤维细胞生物学活力的影响.方法以体外培养的病理瘢痕成纤维细胞为研究对象,应用MTT法,3H-TDR核苷掺入法,观察了FasMcab对增生性瘢痕成纤维细胞活力的影响;应用流式细胞仪检测FasMcab作用下,增生性瘢痕和瘢痕疙瘩两类成纤维细胞的凋亡率.结果①低浓度FasMcab对增生性瘢痕成纤维细胞的活力具有促进作用;②FasMcab在4μg/ml的浓度下可迅速诱导增生性瘢痕成纤维细胞的凋亡,但在相同条件下对瘢痕疙瘩成纤维细胞不具有诱导凋亡的作用.结论瘢痕疙瘩成纤维细胞对FasMcab诱导的凋亡存在抗性.深入研究抗性产生的原因将有助于揭示病理性瘢痕增生的形成机理.     

内质网分子伴侣GRP94、GRP78和XBP1在病理性瘢痕中的表达初探

目的：检测内质网应激反应的关键分子葡萄糖调节蛋白94（GRP94）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和X-盒结合蛋白1（XBP1）mRNA在病理性瘢痕的表达,探讨其基因表达及内质网应激反应与病理性瘢痕形成及转归的关系。方法：用RT-PCR法检测GRP94、GRP78和XBP1mRNA在：①瘢痕疙瘩（13例）、增生性瘢痕（17例）和正常皮肤（15例）组织以及体外培养的瘢痕疙瘩（5例）、增生性瘢痕（5例）和正常皮肤（6例）成纤维细胞中的表达;②体外培养瘢痕疙瘩和增生性瘢痕成纤维细胞（各5例）中经0.1mg/ml氢化可的松作用前后的表达。结果：①GRP94、GRP78和XBP1mRNA在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和正常皮肤组织及其成纤维细胞中的表达均无显著性差异（P〉0.05）;②0.1mg/ml氢化可的松作用后,GRP94mRNA在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕来源的成纤维细胞中的表达量均显著下降,具有统计学意义（P〈0.01）;而GRP78和XBP1mRNA在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕来源的成纤维细胞中的表达量改变均无显著性差异（P〉0.05）。结论：内质网分子伴侣GRP94、GRP78和XBP1在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织及其成纤维细胞中基因转录与正常皮肤组织及其成纤维细胞中基因转录水平一致;GRP94mRNA的表达量显著下降可能是糖皮质激素治疗病理性瘢痕的机制之一。     

病理性瘢痕中c-fos原癌基因的表达

目的　病理性瘢痕是创伤过度愈合的结果 ,以成纤维细胞的异常增殖、合成及分泌大量胶原和细胞外基质为特征 ,其形成机理仍不清楚。探讨原癌基因c -fos的表达与病理性瘢痕形成的相关性。方法　应用免疫组化SP法 ,检测c -fos蛋白在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩及正常皮肤组织中的表达和分布 ,并用图像定量分析比较其差异。结果　在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的成纤维细胞中c-fos呈强阳性表达 ,两组间无明显差异 ,而与正常皮肤对照组均有显著性差异。结论　增生性瘢痕与瘢痕疙瘩中c -fos蛋白表达升高 ,存在c -fos癌基因的激活 ,可能参与了成纤维细胞的分化增殖、胶原合成与降解以及对细胞因子的调控 ,并导致瘢痕增生     

病理性瘢痕中c-fos原癌基因的表达

目的　病理性瘢痕是创伤过度愈合的结果,以成纤维细胞的异常增殖、合成及分泌大量胶原和细胞外基质为特征,其形成机理仍不清楚。探讨原癌基因c-fos的表达与病理性瘢痕形成的相关性。方法　应用免疫组化SP法,检测c-fos蛋白在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩及正常皮肤组织中的表达和分布,并用图像定量分析比较其差异。结果　在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的成纤维细胞中c-fos呈强阳性表达,两组间无明显差异,而与正常皮肤对照组均有显著性差异。结论　增生性瘢痕与瘢痕疙瘩中c-fos蛋白表达升高,存在c-fos癌基因的激活,可能参与了成纤维细胞的分化增殖、胶原合成与降解以及对细胞因子的调控,并导致瘢痕增生。     

实时荧光定量聚合酶链式反应检测瘢痕疙瘩中核心蛋白多糖的表达

目的 探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞中核心蛋白多糖的表达、含量,及其在瘢痕疙瘩形成中的作用和机制.方法对瘢痕疙瘩、正常瘢痕以及正常皮肤成纤维细胞进行体外培养,采用光镜、透射电镜观察成纤维细胞形态、活性及凋亡;应用实时荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)对核心蛋白多糖以及β1转化生长因子(TGF-β1)的mRNA表达进行检测、分析.结果 瘢痕疙瘩成纤维细胞形态不规则、排列紊乱,线粒体增多,粗面内质网扩张呈囊,细胞核常染色质丰富,表明其合成蛋白的功能活跃;瘢痕疙瘩成纤维细胞中核心蛋白多糖mRNA含量较正常瘢痕或正常皮肤成纤维细胞降低,而TGF-β1 mRNA表达则较正常皮肤及瘢痕组织成纤维细胞升高.结论 核心蛋白多糖在瘢痕疙瘩成纤维细胞内含量较正常皮肤明显减少,提示其对成纤维细胞增殖、合成的抑制作用随之减弱,同时使TGF-β1表达上调,导致成纤维细胞的大量增生、迁移,合成过量胶原.表明核心蛋白多糖是抑制瘢痕疙瘩形成的重要因子.     

病理性瘢痕中c—fos原癌基因的表达

目的：病理性瘢痕是创伤过度愈合的结果，以成纤维细胞的异常增殖，合成及分泌大量胶原和细胞外基质为特征，其形成机理仍不清楚，探讨原癌基因c-fos的表达与病理性瘢痕形成的相关性，方法：应用免疫组化SP法，检测c-fos蛋白在增生性产痕，产痕疙瘩及正常皮肤组织中的表达和分布，并用图像定量分析比较其差异。结果；在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的成纤维细胞中c-fos呈强阳性表达，两组间无明显差异，而与正常皮肤对照组均有显著性差异。结论：增生性瘢痕与瘢痕疙瘩中c-fos蛋白表达升高，存在c-fos癌基因的激活，可能参与了成纤维细胞的分化增殖，胶原合成与降解以及对细胞因子的调控，并导致瘢痕增生。     

Expression of apoptosis-associated genes by human dermal scar fibroblasts

The purpose of this study was to determine if aberrant apoptosis plays a role in pathologic wound healing as manifested by hypertrophic scarring and keloid formation. Apoptosis has recently been found to participate in the transition between granulation tissue and the development of definitive scar. The question that remains to be answered is what stimuli initiate apoptosis during wound healing. Hitherto, regulatory factors and pathways involved have been largely undefined. We investigated heterogeneity among fibroblasts derived from normal skin and keloid scar, by examining apoptotic profiles and pathways for these cells. Quantitative analysis of apoptotic cells using an Annexin-V-FITC binding assay showed that normal skin fibroblast cultures were found to have a two-fold higher percentage of apoptotic cells than did keloid fibroblast cultures. To study apoptotic pathways and related death-associated genes, a ribonuclease protection assay was performed for fibroblasts exposed to anti-Fas antibody and tumor necrosis factor-alpha to activate the Fas/TNF receptor apoptotic pathway. Compared with normal skin fibroblasts, keloid fibroblasts exhibited decreased expression of apoptosis-associated genes.     

Skp2和p27kip1蛋白在病理性瘢痕组织中的表达和意义

目的研究Skp2（S期激酶相关蛋白2）在病理性瘢痕中的表达情况及其与p27^kip1之间的相互关系，探讨它们在瘢痕形成中的作用及机制。方法应用免疫组化SP法检测正常皮肤、成熟瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中Skp2、p27^kip1蛋白的表达并进行统计学分析。结果病理性瘢痕组织中Skp2蛋白表达增高，与正常皮肤、成熟瘢痕对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）；病理性瘢痕组织中p27^kip1蛋白表达显著低于正常皮肤、成熟瘢痕（P〈0．05）；病理性瘢痕组织中Skp2蛋白和p27^kip1蛋白呈负相关（P〈0．01）。结论Skp2在病理性瘢痕组织中表达增高，可能通过调节p27^kip1等细胞周期调控因子的降解而促进瘢痕组织中细胞的增生，对病理性瘢痕的形成可能起着重要作用。     

凋亡相关基因Bcl-2、Bax在相对静息期增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中的表达及分布

目的　了解相对静息期增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中凋亡特性和凋亡蛋白的表达分布。方法　利用免疫组化的方法 ,检测静息期增生性瘢痕、瘢痕疙瘩凋亡相关蛋白的表达分布和强弱。结果　发现两者的表达均处于瘢痕上皮的基底细胞层、小血管、及皮肤附件周围细胞。增生性瘢痕中 ,Bax在上述区域的表达更强 ,瘢痕疙瘩中Bax表达 ,较Bcl-2弱 ,在瘢痕疙瘩中发现 2例在瘢痕中心区的Bcl- 2弱表达。结论　静息期增生性瘢痕、瘢痕疙瘩 ,有着与增殖期不同的凋亡特性 ,凋亡上皮的基底层细胞、小血管、残存的皮肤附件周围的细胞 ,可能在瘢痕日后的凋亡中发挥重要的作用     

P57kip2和Maspin在病理性瘢痕组织中的表达

目的 研究P57kip2和Maspin在病理性瘢痕组织中的表达情况及相互关系,探讨它们在病理性瘢痕形成中的作用及机制.方法 应用免疫组化SP法结合计算机病理图像分析和逆转录聚合酶链反应( RT-PCR)检测正常皮肤、成熟瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中P57kip2和Maspin的表达并对其表达进行统计学分析.结果 病理性瘢痕组织中P57kip2蛋白的表达定位于成纤维细胞的细胞核内,且P57kip2蛋白及mRNA的表达减少,与正常皮肤、成熟瘢痕对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).病理性瘢痕组织中Maspin蛋白的表达定位于成纤维细胞的细胞质和细胞核内,且Maspin蛋白及mRNA的表达减少,与正常皮肤、成熟瘢痕对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).P57kip2与Maspin蛋白表达存在明显正相关(P＜0.O1).结论P57kip2与Maspin在病理性瘢痕组织中均表达减少,是病理性瘢痕相关基因,两者存在明显正相关,是病理性瘢痕的形成机制之一.P57kip2和Maspin可能通过成纤维细胞在病理性瘢痕的形成过程中发挥着重要作用.     

富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白在病理性瘢痕中的表达及其意义

目的观察富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(Secreted protein,acidic and rich in cysteine,SPARC)在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中的表达规律及其意义。方法瘢痕患者的瘢痕疙瘩和3～12个月增生性瘢痕组织各26例;另取手术剩余的正常成人皮肤组织5例;所有标本用40 g/L甲醛固定,行连续切片,厚4μm,应用链菌素生物素-过氧化物酶标记物免疫组织染色法染色。同时设正常对照(正常皮肤)、阳性对照(胃癌癌变组织)、阴性对照(磷酸盐缓冲液代替一抗)。鼠抗人SPARC单克隆一抗浓度为1:200。结果正常成人皮肤中SPARC表达稀少,局限在真皮-表皮交界的乳头真皮,部分靠近基底膜血管和皮肤附件。SPARC在增生性瘢痕的真皮瘢痕组织、皮肤附件中低表达,且早期增生性瘢痕中表达无明显强于晚期增生性瘢痕(P>0.05)。在真皮中SPARC呈弥散性散在分布(同增生性瘢痕),阳性信号表达较低。增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的SPARC较正常皮肤表达无差异(P>0.05)。结论SPARC在3～12个月增生性瘢痕中呈低表达,在瘢痕疙瘩中低表达。     

TNFR1及Bcl-2在病理性瘢痕组织细胞凋亡中的表达及意义

目的　研究TNFR1和Bcl- 2在病理性瘢痕组织细胞中的表达及其对成纤维细胞凋亡与增殖的影响。方法　取手术切除的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩患者各 15例标本 ,正常皮肤 12例标本 ,应用免疫组织化学方法进行检测 ,分析TNFR1和Bcl- 2的表达及分布规律。结果　TNFR1在正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中成纤维细胞的表达阳性率分别为 10 .70 %、3.2 3%和 7.72 % ,TNFR1在正常皮肤组中的阳性表达率明显高于增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组 ,而瘢痕疙瘩组阳性表达率却又明显高于增生性瘢痕组 ,三组间阳性表达率相互比较差异均有显著意义 (P <0 .0 1) ;Bcl- 2在增生性瘢痕组 (19.35 % )和瘢痕疙瘩组 (48.33% )的阳性表达率明显高于正常皮肤组 (4.0 7% ) ,三组间阳性表达率相互比较差异亦均有显著意义 (P <0 .0 1)。结论　Bcl- 2的持续过表达可能是瘢痕疙瘩呈瘤样增生的原因之一。介导的死亡受体凋亡通路受阻及TNFR1介导核转录因子NF -kB的激活 ,表明TNFR1对成纤维细胞的增殖与凋亡具有双重的调节作用。     

FasmRNA在增生性瘢痕中的表达

目的：探讨FasmRNA在增生性瘢痕中的表达情况,方法：原位杂交法检测42例增生性瘢痕和42例正常皮肤组织中FasmRNA的表达,采用逆转录PCR检测42例增生性瘢痕中FasmRNA的表达。结果：原位杂交法检出42例增生性瘢痕和42例正常皮肤组织中FasmRNA表达率分别为23％和64％,差异有显著性（P＜0．01）;RT－PCR法检出42例增生性瘢痕中FasmRNA阳性表达25例,阳性率为59．5％,阳性表达组中无缺失突变,结论：FasmRNA在增生性瘢痕中表达明显减少,可能是瘢痕形成的重要原因之一。     

肥大细胞类胰蛋白酶在病理性瘢痕中的表达研究

目的 研究肥大细胞类胰蛋白酶(mast cell tryptase,MCT)在病理性瘢痕中的表达及分布情况,探讨MCT基因在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及正常皮肤中是否存在差别.方法 采集未经治疗的瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及正常皮肤各20例,应用免疫荧光组化对MCT的表达进行定位,应用实时荧光相对定量PCR进行mRNA基因水平的相对定量分析.结果 MCT主要集中在瘢痕组织的胶原纤维柬之间,以瘢痕组织浅层分布较多;实时荧光PCR相对定量结果显示MCT基因在瘢痕疙瘩中表达高于增生性瘢痕和皮肤(P<0.01),瘢痕疙瘩中MCT基因表达量约为增生性瘢痕的2.5倍,皮肤的5.4倍.结论 MCT在瘢痕的形成中可能起一定的作用.     

微纤维蛋白1在病理性瘢痕中的表达及意义

目的 检测微纤维蛋白1(FBN1)在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的表达情况,研究其与TGF-β1的相关性,探讨病理性瘢痕发生的分子机理.方法 用RT-PCR法检测瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和正常皮肤三种组织中FBNI和TGF-β1mRNA的表达量并进行相关性分析;用免疫组化的方法对FBN1蛋白在人类皮肤组织的表达进行定位及半定量研究.结果 FBN1 mRNA在瘢痕疙瘩(0.802±0.116)高于正常皮肤(0.252±0.067)218.25%(P<0.01),增生性瘢痕(0.628±0.144)较正常皮肤增高149.21%(P>0.05).TGF-β1在瘢痕疙瘩较正常皮肤和增生性瘢痕分别增高200.27%和92.81%(均为P<0.01);FBNI和TGF-β1 mRNA在上述标本中的表达量呈正性相关(r=0.820,P<0.01).FBN1蛋白主要在人类皮肤组织的表皮、毛囊和汗腺的基底膜以及真皮层的血管内皮细胞、部分成纤维细胞和细胞外基质中表达阳性.在真皮层,FBN1蛋白在瘢痕疙瘩(0.117±0.042)表达量较正常皮肤(0.185±0.043)和增生性瘢痕(0.181±0.048)分别减少36.76%和35.36%(均为P<0.01).结论 FBN1在瘢痕疙瘩表达异常,它是瘢痕疙瘩相关基因(瘢痕相关基因),可能通过参与TGF-β1信号通路的调节影响病理性瘢痕的发生.