用无血清培养基体外扩增CIK细胞的研究

ＣＩＫ (ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄｋｉｌｌｅｒ)细胞是一类细胞因子诱导的杀伤细胞。ＣＩＫ细胞能大量扩增 ,而且具有比ＬＡＫ细胞更强的肿瘤杀伤活性。为了获得临床应用的ＣＩＫ细胞 ,必须用自身血浆或无血清培养取代传统的牛血清培养方式 ,以减少病人意外感染的机会。本实验对有血清和无血清培养条件下ＣＩＫ细胞的生物活性进行了研究。将人脐血用Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度分离后得单个核细胞 (ＭＮＣ) ,ＭＮＣ分别用含胎牛血清或自身血浆的ＲＰＭＩ 16 40培养基、或ＡＩＭ Ⅴ无血清培养基进行培养。培养ＣＩＫ细胞时 ,先加ＩＦＮ γ …     

体外大量扩增CIK细胞的研究

目的：探讨影响CIK细胞体外增殖的因素（如共刺激、培养时间和血清等），以及其进行无血清培养。方法：用乳酸脱氢酶分析细胞毒活性，用流式细胞术分析细胞表型。结果：培养至第14d，在胎牛血清、自身血浆或无血清3种培养条件下，CIK细胞的纯度分别为：21．68％、28．28％和29．50％；增殖倍数分别为：31．7、33．3和27．1倍。培养21d后，CIK细胞的纯度分别为：36．73％、37．29％和29．7％，增殖倍数分别为：58．2、67．4和52．7倍。3种培养条件来源的CIK细胞，对K562细胞的细胞毒活性分别为：63．4％、72．3％和53．6％；而对Raji细胞的细胞毒活性分别为：47．6％、56．2％和43．4％。效应细胞：靶细胞为10：1时，培养14d和21d的CIK细胞，对K562细胞的细胞毒活性分别为68．13％和56．4％；而对Raji细胞的细胞毒活性分别为49．9％和39．2％。在共刺激或无共刺激信号存在的条件下，效应细胞：靶细胞为10：1时，对K562细胞的细胞毒活性分别为69．7％和41．9％；而对Raji细胞的细胞毒活性分别为42．6％和37．8％。结论：共刺激和培养时间的延长，有利于增强CIK细胞的细胞毒活性。用无血清培养基可促进CIK细胞体外增殖。     

细胞因子诱导杀伤（CIK）细胞的大容量扩增与杀伤活性观察

建立大容量细胞因子诱导杀伤(Cytokine-inducedkiller,CIK)细胞培养方法,观察CIK细胞回输后对患者细胞免疫功能的影响。采用1000ml培养袋大量扩增患者自体CIK细胞,用MTT法检测CIK细胞杀伤活性,比较回输前后患者外周血单个核细胞(PBMNC)对靶细胞的杀伤活性及其毒副作用。结果表明大容量培养法使自体CIK细胞扩增总量达1.6×1010以上,回输CIK细胞使患者PBMNC的杀伤活性明显增加,未出现毒副作用。因此CIK细胞大容量扩增方法在治疗肿瘤微小残留病变上有着良好的临床应用前景。     

CIK细胞的体外培养与细胞毒作用

CIK(cytokine-induced killer)细胞在体外可以快速扩增,具有高效的非MHC限制性杀瘤活性,被认为是抗肿瘤过继细胞免疫治疗的新希望。随着细胞操作及基因修饰技术的日益精进,人们正逐渐改进CIK细胞的体外培养和处理方法,以便进一步提高CIK细胞的增殖率及特异杀伤力,使其更好地应用于临床。     

CIK细胞的体外增殖及杀瘤活性的实验研究

通过第１天在外周血淋巴细胞中加入γ－ＩＦＮ，第２天再加入ＩＬ－２、ＣＤ３单抗和ＩＬ－１，获得了已被定义为多种细胞因子诱导的杀伤细胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ）即ＣＩＫ细胞。通过学种方法，使外周血中微是的ＣＤ３＾＋ＣＤ５６＾＋细胞得到大量扩增。这种ＣＤ３＾＋ＣＤ５６＾＋细胞被证明是Ｔ细胞并具有ＮＫ细胞表面标志ＣＤ５６抗原。ＣＩＫ能溶解多种肿瘤细胞，表面为非ＭＨＣ限制     

干细胞因子逆转录病毒表达载体的构建及体外性质研究

目的 通过逆转录病毒介导两种类型人干细胞因子在NIH3T3细胞中稳定表达,并研究它们对白血病细胞的作用.方法 用DNA重组技术构建并鉴定可溶型及膜结合型干细胞因子的重组逆转录病毒表达载体MSCV-PGK-GFP-sSCF、MSCV-PGK-GFP-mSCF,与空载体对照MSCV-PGK-GFP分别转染Phoenix细胞包装病毒,并感染NIH3T3细胞,流式分选术获得3种阳性细胞,CCK8法分别检测与其共培养的K562细胞的增殖情况.结果 成功构建了sSCF、mSCF逆转录病毒表达载体;经Phoenix包装的重组及对照逆转录病毒成功感染NIH3T3细胞,获得了稳定表达细胞株NIH3T3-S、NIH3T3-M和对照细胞株NIH3T3-V.共培养中NIH3T3-S、NIH3T3-M均可促进K562细胞的增殖,且在低血清条件下,NIH3T3-M的作用高于NIH3T3-S.结论 可溶性及膜结合SCF分别通过旁分泌和并置性作用促进白血病细胞的增殖.     

不同细胞因子诱导脐血来源的CIK、NK细胞对K562细胞杀伤活性的研究

目的：了解不同细胞因子组合扩增的脐血CIK、NK细胞对人K562细胞株的杀伤活性的差异性。方法：通过SCF、FLT3L、IL-2、IL-7及IL-15等细胞因子的不同组合扩增的脐血CIK、NK细胞，分为3组，A组（SCF＋IL-2＋IL-7＋IL-15）、B组（SCF＋FLT3L＋IL-2＋IL-7＋IL-15）和C组（IL-2＋IL-7＋IL-15，对照组）；通过MTT法检测各组CIK、NK细胞在不同效靶比下对K562的杀伤率，计算各组的总杀伤单位。结果：经过21天培养A组体系中CIK＋NK细胞的比例平均超过60％，B组CIK＋NK细胞的比例平均超过70％，而C组约为50％；各组扩增的CB-CIK／NK细胞同组间在效靶比20：1时对K562的杀伤率均显著高于10：1（P〈0．01）。在不同效靶比下A组CIK／NK细胞对K562的杀伤率显著高于B和C组（P〈0．01）；C组CIK／NK细胞对K562的杀伤率稍高于B组，但两组间对K562的杀伤率无显著性差异。A组总杀伤单位显著高于C组，与B组无显著差异。结论：不同细胞因子组合扩增的脐血CIK、NK细胞对人K562细胞株的杀伤活性有差异，考虑到对效应细胞的扩增效果，B组为具有最佳杀伤活性的脐血CIK、NK细胞培养体系，其中的SCF、FLT3L对CIK／NK细胞诱导有协同效果。     

CIK细胞对MGC-803胃癌细胞株抗增殖及诱导凋亡作用的研究

目的 :研究多种细胞因子诱导的杀伤细胞 (Cytokine inducedkillcells ,CIK)对MGC 80 3胃癌细胞株的抗增殖和诱导凋亡作用 ,并探讨其作用机制。方法 :应用MTT法检测CIK细胞对MGC 80 3胃癌细胞株的抗增殖作用的影响及细胞毒活性 ;通过HE染色、扫描电镜和透射电镜观察凋亡细胞的形态学改变 ;通过免疫细胞化学法测定p5 3、p16、C myc的阳性表达率。结果 :MTT比色法表明随着CIK细胞与胃癌细胞效靶比增加及作用时间延长 ,抑制率明显增强 (P <0 0 1)。CIK细胞作用于胃癌细胞 2 4小时后 ,形态学观察胃癌细胞发生凋亡或坏死。CIK实验组p5 3、p16、C myc蛋白随作用时间延长表达均下降 ,与对照组相比均有显著性差异 (P <0 0 1)。结论 :CIK细胞是一种新型高效具有较强杀伤体外胃癌细胞的免疫活性细胞。其杀伤MGC 80 3胃癌细胞的作用机制之一可能是通过下调p5 3、C myc的蛋白表达。     

重型再障细胞因子差异表达的研究

目的：探讨外周血细胞浆中的细胞因子在重型再障患者中的差异表达。方法：应用流式细胞仪检测正常人和重型再障患者外周血细胞浆中的细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α的表达情况。结果：重型再障患者IL-2、IL．12、IFN-γTNF-α表达显著增高，IL4、IL-10表达无显著性变化。经判别分析显示，与再障发病关系密切的因子依次为TNF-α、IL-12、IL-2，并建立判别函数式。结论：IL-2、IL-12、IFN-γNF-α为造血负调控因子，参与了再障的发病机制。IL-4、IL-10与再障的发生关系不密切。TNF-α表达增强与再障的发病最为密切，其次为IL-12，再次为IL-2。     

水飞蓟宾增强人CIK细胞杀伤胃癌细胞株BCG-823的体外研究

为探讨水飞蓟宾对人CIK细胞杀伤胃癌细胞株BCG-823的影响及作用机制,分离健康志愿者外周血单个核细胞,体外诱导培养成人CIK细胞;收集培养扩增7d的CIK细胞,将其用不同浓度的水飞蓟宾诱导24h、48h、72h,CCK-8法检测其增殖情况;流式细胞术检测CIK细胞穿孔素、颗粒酶B、CD107a和IFN-γ的表达变化及水飞蓟宾对其凋亡的影响;LDH法检测CIK细胞对胃癌细胞株BCG-823的杀伤活性。结果显示,与对照组相比,浓度为(1.6~50)μg/mL的水飞蓟宾作用CIK细胞72h后,增殖率较对照组显著增加(P<0.05);穿孔素、颗粒酶B、CD107a和IFN-γ的表达以及活细胞率均不同程度增加(P<0.05);且对胃癌细胞BGC-823的杀伤活性显著增强(P<0.05)。以上实验结果提示一定浓度的水飞蓟宾对CIK细胞有促增殖作用,且能增强其对胃癌细胞株BCG-823的杀伤活性。     

不同输注途径对CIK细胞治疗后的体内分布的影响

目的：探讨经不同途径输注后CIK细胞的体内分布和代谢情况.方法：分别以同位素^32P-α dATP和荧光染料CM-DiI标记CIK细胞,而后经尾静脉途径和腹腔途径注射入裸鼠体内,用放射性定量检测方法和荧光显微镜检测方法分析CIK细胞在各器官的动态分布.结果：CIK细胞输入裸鼠体内后,迅速分布至肝、脾、肾、肺、胃、肠等器官,其中肝、脾、肾的分布浓度最高;CIK细胞输入体内的早期,尾静脉注射途径中肺最先达到分布高峰,而腹腔注射途径中腹腔内器官率先达到分布高峰;CIK细胞在肝、脾的存活可达2周以上.结论：CIK细胞体内分布的广泛性表明它可以用于身体各部位恶性肿瘤的治疗;血管输入途径可能更适于血供丰富器官肿瘤的治疗,而体腔输入途径也许更适合于体腔内恶性渗液或局限病灶的治疗.     

IL-12对CIK细胞体外增殖及细胞毒活性影响的研究

目的观察IL-12对细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）体外扩增和细胞毒活性的影响。方法采用3种不同的细胞因子组合扩增CIK细胞,即IL-2组：IFN-1、CD3单抗、IL-1和IL-2;IL-2加IL-12组：IFN-γ、CD3单抗、IL-1、IL-2和IL-12;IL：12组：IFN-γ、CD3单抗、IL-1和IL-12。细胞计数法测定细胞的增殖、流式细胞术分析细胞表型,MTT法测定细胞毒作用。结果3种方法均可使细胞增殖能力显著增加,对CD3^＋CD56^＋细胞的诱导作用也无明显差异,IL-12与IL-2联合作用组促增殖能力和细胞毒性作用明显强于其他两组,P〈0．05,差异有统计学意义。结论IL-12同样可以用于CIK细胞的诱导,而联合IL-12与IL-2可以显著增强CIK细胞的增殖能力和细胞毒性。     

不同激活方式影响细胞因子诱导杀伤细胞的扩增与活性

目的：研究不同激活方式对CIK细胞(Cytoline-induced killer cells，CIK)体外扩增的影响。方法：使用植物血球凝集素(pHYTOHEMAGGLUTININ，PHA)或抗CD3单抗刺激细胞增殖，从脐血单个核细胞定向诱导CIK细胞，用乳酸脱氢酶(LDH)分析法分析细胞毒活性，用流式细胞分析法对不同培养条件下CIK细胞的纯度进行分析。结果:使用抗CD3 mAb刺激生成的CIK细胞在扩增能力、纯度和细胞毒性方面都优于使用PHA刺激生成的CIK细胞。在细胞因子和有丝分裂原加入3d后，将其洗脱，但仍加入IL-2，有利于提高细胞的扩增能力。另外，使用包被的方法将抗CD3 mAb固定在孔板上比悬浮加入效果好。结论：这一结果对于CIK细胞的大量扩增和临床应用具有指导意义。     

肿瘤细胞来源的胞外体对CIK细胞活性的影响

目的 探讨恶性肿瘤对于细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer，CIK）细胞的增殖抑制以及诱导凋亡等方面的作用，并探讨肿瘤细胞影响CIK的作用机制。方法 在CIK细胞培养体系中分别加入胃癌细胞系BGC-823、结肠癌细胞系HCT-8细胞的培养上清，观察对于CIK细胞的增殖倍数、主要效应细胞（CD3^＋CD56^＋细胞）的含量以及杀伤活性的影响。为探讨肿瘤细胞来源的胞外体在影响CIK细胞活性中的作用，采用超速离心技术分离肿瘤细胞培养上清中的胞外体结构，观察其对于CIK细胞的抑制作用。结果 培养体系中肿瘤培养上清的加入降低了CIK细胞的增殖倍数和CD3^＋CD56^＋细胞的比例，并且肿瘤培养上清的加入抑制了CIK细胞对于同类肿瘤细胞的细胞毒活性。肿瘤细胞和CIK细胞的共同培养增加了CIK细胞中凋亡细胞的比例，同时降低了增殖细胞比例。通过超速离心方法从BGC-823胃癌细胞培养上清液中分离出胞外体结构，电镜显示为直径介于40～100ml之间的膜性微小囊泡，并且BGC-823细胞培养上清中胞外体结构的去除可以减轻其对于CIK细胞的增殖抑制。结论 肿瘤细胞对于CIK细胞的增殖和生物学活性具有抑制作用，免疫抑制性细胞因子和胞外体都是可能的作用机制。     

Cytokine-induced killer (CIK) cells bound with anti-CD3/anti-CD133 bispecific antibodies target CD133 cancer stem cells in vitro and in vivo

CD133 is a common marker of cancer stem cells (CSCs). We generated an anti-CD3/anti-CD133 bispecific antibody (BsAb) and bound it to the cytokine-induced killer (CIK) cells as effector cells (BsAb–CIK) to target CD133^high CSCs. The killing of CD133^high pancreatic (SW1990) and hepatic (Hep3B) cancer cells by the BsAb–CIK cells was significantly (p < 0.05) higher than the killing by the parental CIK or by CIK cells bound with anti-CD3 (CD3–CIK) without CD133 targeting. In nude mice, the BsAb–CIK cells inhibited CD133^high tumor growth significantly (p < 0.05) more than that by CIK or CD3–CIK cells, or by the BsAb alone. BsAb–CIK cells co-cultured with CD133^high cells produced significantly (p < 0.05) higher amount of IFN-γ. Treatment with the BsAb–CIK cells significantly downregulated the expression of S100P and IL-18 bp, but upregulated STAT1. The findings may help with the development of novel immunotherapies for patients with cancer containing CD133^high CSCs by selectively targeting this cell population.     

Immunological changes and cytokine gene expression during primary infection with human T-cell leukaemia virus type 1 in squirrel monkeys (Saimiri sciureus)

We have developed an animal model of experimental HTLV-1 infection in Saimiri sciureus monkeys in order to study both the immunological and the virological aspects of the infection. As cytokines expressed by immune cells play an essential role during viral infection, we have studied the correlation between the expression of some Th1/Th2 cytokines, including IL-2, IL-5, IL-6, IL-10, and IFN-gamma, and immunological dynamics during primary and chronic HTLV-1 infection in this model. We first demonstrated that, during primary infection, IFN-gamma, IL-2 and IL-10 are expressed at different times and levels. The expression of these cytokines is concomitant with the increase in the numbers of CD4(+), CD8(+) and CD16(+) cells and with the presence of tax/rex viral mRNA. These data indicate the involvement of various cell types in the antiviral immune response. Subsequently, we showed that peripheral blood mononuclear cells freshly isolated from chronically infected monkeys express IFN-gamma and IL-6 at higher levels than those from uninfected animals. IFN-gamma expression is quantitatively correlated to the proviral load and to the presence of circulating effector T-cells against Tax peptide, as detected by Elispot. Further studies will be needed to determine the effective role of these cytokines and other immune system modulators in the control of viral replication during primary HTLV-1 infection or latency.     

不同输注途径对CIK细胞体内分布和抑瘤作用的影响

目的 研究不同输注途径(皮下、腹腔、瘤周注射)对CIK细胞在活体内的分布规律和抑瘤活性的影响.方法 以同位素32P-adATP标记CIK细胞,而后经尾静脉途径和腹腔途径注射入裸鼠体内,用放射性定量检测方法分析CIK细胞在各器官的动态分布.裸鼠皮下注射结肠癌细胞建立肿瘤活体模型,分别按瘤周、腹腔和尾静脉注射途径接受CIK细胞治疗,观察肿瘤的体积和重量变化.结果 CIK细胞输入裸鼠体内后,迅速分布至肝、脾、肾、肺、胃、肠等器官,其中肝、脾、肾的分布浓度最高,CIK细胞在各脏器的分布规律与不同的输注途径存在一定的联系.裸鼠皮下接种结肠癌细胞系HCT-8后,瘤周和尾静脉注射CIK细胞可以明显抑制皮下移植肿瘤的生长,而腹腔注射CIK细胞对于皮下肿瘤的抑制没有统计学意义.结论 CIK细胞体内分布的广泛性表明它可以用于身体各部位恶性肿瘤的治疗;针对不同解剖部位的肿瘤可以选择不同的CIK细胞输注途径以最大限度地提高疗效.     

通心络对同型半胱氨酸损伤的内皮细胞的基因表达谱的影响

目的: 探讨通心络对同型半胱氨酸(Hcy)损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的基因表达谱的影响。方法: 原代培养的HUVECs,随机分为对照组、Hcy组和通心络组,提取总RNA并纯化,反转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针,采用高通量Affymetric人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片(含47 000个基因或基因片段)杂交,杂交信号经扫描和数字化处理,通过生物信息学数据分析推测通心络对同型半胱氨酸损伤的HUVECs细胞功能的影响以及可能的信号通路。结果: 与对照组相比,Hcy组有4 343个基因表达上调,316个基因表达下调;与Hcy组相比,通心络组有3 409个基因表达上调,121个基因表达下调。这些共同的差异基因生物功能涉及转录因子调控、激酶、细胞骨架与蛋白合成、转运功能、细胞因子、细胞-细胞受体相互作用和细胞黏附因子等。参与的信号通路主要是与血管新生、凋亡、氧化应激、凝血纤溶和炎症等相关的信号通路,如mTOR信号通路、MAPK信号通路和Toll样受体信号通路。结论: 通心络能导致同型半胱氨酸损伤内皮细胞基因表达谱的改变,这些基因改变可能参与了细胞凋亡、氧化应激和凝血纤溶等过程。