全血DNA提取试剂盒改良法

目的建立简便、快捷、高纯度、高浓度的DNA提取方法。方法对原美国生产的EZNABloodDNAKit试剂盒方法进行改良(简称全血DNA提取试剂盒改良法),并与原试剂盒法、经典酚氯法改良法(微量法)[1]进行比较。取EDTA2Na抗凝血,分别用3种方法提取DNA,用琼脂糖凝胶电泳对其进行定性测定,并用紫外分光光度法定量测定。结果DNA提取的纯度A260/A280试剂盒改良法、原试剂盒法和微量法分别为1.8083±0.1655、2.0877±0.3230、1.7734±0.1152,前两法有显著性差异(P<0.05),试剂盒改良法提取DNA的纯度明显高于原试剂盒法,与微量法无显著性差异(P>0.05);改良法提取DNA的浓度分别为75.2476±18.0259、45.2771±14.973、123.8758±74.7367,与前两法的DNA提取浓度有显著性差异(P<0.05),明显高于原试剂盒法;DNA电泳图显示试剂盒改良盒法与微量法均很清晰,原试剂盒法有明显的拖尾现象。结论试剂盒改良法提高了DNA提取的纯度和浓度,可作为分子生物学研究DNA提取较好的选用方法。     

蛋白酶K对盐析法提取全血DNA的影响

盐析法是目前血液基因组DNA常用的提取方法之一,具有简便、快速、得到DNA的质量高的特点[1]。但有的研究中使用了蛋白酶K[2,3],有的研究中未使用蛋白酶K[1,4],均得到了高质量的DNA。为了了解蛋白酶K在盐析法提取全血DNA中的作用,     

石蜡包埋组织提取DNA不同条件下的PCR扩增

背景:在甲醛固定石蜡包埋组织的制作及保存过程中会对DNA造成损害,提取的DNA在用于PCR扩增时部分结果并不理想。目的:比较分析石蜡包埋组织中提取DNA应用于PCR反应的影响因素。方法:从10.0μm×2、10.0μm×4和10.0μm×5石蜡包埋食管癌组织切片中提取DNA,以0.05,0.1,0.2μg模板DNA量扩增内参基因β-actin,PCR反应循环次数分别为35,40,45次,分析影响PCR反应的因素。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳结果显示以10.0μm×2组织切片量,PCR反应循环次数40次,PCR反应模板DNA量0.05μg扩增取得的目的基因DNA的质量最高。说明减少石蜡包埋组织用量和减少模板DNA量有助于获得高质量的PCR反应条带,且PCR反应循环次数应大于40次,小于45次,再增加循环次数,则意义不大。     

固相载体法提取全血中DNA

目的　寻找简便快速的从全血中分离高质量DNA的方法。方法　分别用异硫氰酸胍 硅胶法和经典的酚 氯仿法从全血中提取DNA并进行比较。结果　异硫氰酸胍 硅胶法提取DNA平均含量 (3.70 μg/ 10 0 μl全血 )高于酚 氯仿法 (2 .99μg/ 10 0 μl全血 ) ,P <0 .0 5 ,纯度无显著差异。 2法抽提的DNA琼脂糖凝胶电泳结果及PCR和限制性酶切反应的效果无差异 ,但异硫氰酸胍 硅胶法更为简便 ,所需时间不到 1h。结论　异硫氰酸胍 硅胶法提取全血中DNA简单、快速且可靠     

不同粪便DNA提取试剂盒及样本储存时间对粪便人基因组DNA提取率的影响

目的比较不同粪便DNA提取试剂盒及粪便样本不同储存时间对粪便人基因组DNA提取效率的影响。方法对18例体检健康者使用QIAamp DNA Stool Mini Kit,MO BIO UltraCleanFecal DNA Isolation Kit,E.Z.N.A.Mag Bind Stool DNA Kit 3种粪便DNA提取试剂盒进行粪便DNA提取,通过紫外分光光度法对总DNA产量和纯度进行分析,通过实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法对提取产物中结肠腺瘤性息肉病基因进行定量,并比较人基因组DNA提取效率的差异及不同样本储存时间对其影响。结果在3种试剂盒中,QIAamp DNA Stool Mini Kit对人基因组DNA的提取产量最高(平均67.81 ng/g),E.Z.N.A.Mag Bind Stool DNA Kit提取产物纯度最高(A260/A280平均2.07),MO BIO UltraCleanFecal DNA Isolation Kit操作耗时最短(约40 min);粪便样本在-70℃条件下储存30 d内,不同储存时间对总DNA提取效率差异有统计学意义(P0.01)。结论 QIAamp DNA Stool Mini Kit对粪便人基因组DNA的提取效率最高,且于-70℃储存粪便样本30 d内对人基因组DNA提取效率无影响。     

三种简易提取全血基因组DNA方法的比较

目的比较兰种快速、简便、适用、低成本的从全血中提取基因组DNA的方法。方法选用快速氯仿-异戊醇法、简化盐析法、改良碘化钾法直接从全血中提取基因组DNA。结果改良碘化钾法提取的DNA纯度及含量最高，快速氯仿-异戊醇法次之，简化盐析法则相对较低。结论改良碘化钾法为较好的提取基因组DNA的方法。     

Silica-KI快速提取外周血基因组DNA的实验研究

目的 建立一种快速的外周血基因组DNA提取方法。方法 用硅胶-碘化钾(Silica—KI)吸附法直接从外周血提取基因组DNA。结果 提取的基因组DNA相对分子质量大，纯度较高，A260／280nm为1．75～1．93。每毫升外周血可获得25～35μg DNA，体外扩增和限制性内切酶酶切结果满意。结论 Silica—KI吸附法是一种简单、高效、快速、安全、适用于大量临床标本处理DNA的提取方法。     

自动提取大样本全血基因组DNA方法的建立

目的建立从大样本全血中自动提取基因组DNA的方法,并评价提取DNA的质量和产量。方法基因组DNA使用MiniPrep75-Ⅱ自动工作站提取;DNA样本的纯度和含量用紫外分光光度法测定;DNA的完整性用琼脂糖电泳法测定。结果从100μl全血中平均可提取到(7.33±2.58)μg基因组DNA;DNA样本的纯度平均为1.647±0.135(A260/A280);琼脂糖电泳法测得DNA的分子量约为21kb。结论本方法可以快速从大样本全血中自动提取较高质量的基因组DNA,所得DNA适用于下游的分子生物学实验。     

全血反复冻融对工作站提取基因组DNA的影响

目的 研究全血样本在反复冻融后对DNA工作站抽提基因组DNA含量和纯度的影响.方法 研究随机抽取100份样本,相隔一天连续进行反复冻融四次,将每次融化的样本运用DNA工作站抽提基因组DNA,并用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度及琼脂糖电泳检测DNA完整性.结果 全血样本反复冻融组间比较抽提基因组DNA的含量和纯度,含量(μg)方面,第一次为2.220±1.004,第二次为2.956±0.768,第三次为2.540±0.817,第四次为2.760±0.881;纯度(A260nm/A280nm)方面,第一次为1.748±0.076,第二次为1.780±0.069,第三次为1.855±0.058,第四次为1.750±0.071.检测结果提示差异均无统计学意义(P>0.05),检测DNA长度大于15 kb.结论 反复冻融次数对DNA工作站抽提全血样本基因组DNA的含量和纯度均无影响,具有快速、高通量化的特点和广泛的应用前景.     

不同组织DNA提取的比较

分子生物学技术应用于病理学不仅能辅助诊断,而且在评估预后及指导治疗方面也具有重要作用.DNA提取是分子病理诊断和相关科研中的关键步骤.提取高质量的DNA除了需要操作者的经验、高质量的试剂盒以外,组织的来源也很重要.对于病理科常用的甲醛固定、石蜡包埋(FFPE)组织来讲,往往不同组织来源的DNA质量存在显著差异,是制约后续分子病理检测的重要因素.本文对比检测了不同组织来源DNA的浓度和质量,并加以总结分析.     

固定剂及固定时间对DNA提取质量的影响

目的 探讨10％福尔马林、95％乙醇、中性缓冲福尔马林、4％多聚甲醛-0.1 moL/L磷酸缓冲液4种固定剂对新鲜组织DNA质量及PCR的影响。方法 选取16例单纯性扁桃体炎组织标本的冷冻切片,进行不同时段的固定,比较提取物OD260nm/OD280nm比值、DNA浓度和PCR结果。结果 各组之间同一时间、同一组内不同时间OD260nm/OD280nm比值比较差异不显著(P>0.05);而同一固定时间段,个别组间DNA浓度以及同一组内不同时间DNA浓度差异显著(P<0.05)。固定72h后,各组的PCR阳性率分别为66.7％、100％、93.3％、80％、100％。结论95％乙醇固定效果最佳,其余3组固定剂随固定时间的延长,PCR阳性率逐渐降低。     

沉淀煮沸法不同提取条件对血清HBV-DNA扩增结果的影响

目的 探讨沉淀煮沸法不同提取条件对血清HBV-DNA扩增结果 的影响,筛选出适合临床实验室提取样本DNA的方法.方法 分别比较将沉淀煮沸不同时间、沉淀打散与否以及蒸气浴和沸水浴3种不同操作条件下提取的DNA对荧光扩增结果 的影响.结果 将沉淀分别煮沸5、10、15 min,其所提取的DNA的扩增结果 之间无显著性差异,P>0.05; 将沉淀打散后所提取的DNA,其扩增结果 明显高于沉淀未打散的扩增结果,P<0.01;蒸气浴10 min提取的DNA的扩增结果 明显低于沸水浴10 min提取的DNA,P<0.01.结论 在提取血清HBV-DNA时,在加入提取液2后应将沉淀打散,并且应将Eppendorf管的管底置于沸水中加热,煮沸时间在特殊情况下可以缩短,5 min即可.     

细胞裂解法提取全血基因组DNA及两种抗凝剂对其结果的影响

在以医学检验为目的PCR实验和分子生物学研究中,基因组DNA模板的提取是实验成功的关键因素之一.如果样品已高度降解,即使DNA量很大也不会产生任何信号[1].目前提取全血基因组DNA的方法较多,为研究采用较为经济简便的方法从样本中提取高纯度、高产量的DNA,作者在原有的盐析法[2]基础上建立了细胞裂解法提取抗凝全血DNA,同时与采用EDTA.K2和枸橼酸钠这2种抗凝剂处理的全血提取DNA的纯度、产量进行了比较.     

改良碘化钠法提取人类微量全血基因组DNA的探索

目的通过改良碘化钠(NaI)法,建立一种简单、快速、经济的从人微量全血中提取基因组DNA的方法。方法采用经典NaI法和改良NaI法分别从人微量全血中提取基因组DNA,并进行常规和荧光定量聚合酶链反应(PCR),比较两种方法DNA提取的效果。结果采用改良NaI法从人外周全血中提取的DNA浓度和纯度与经典NaI法相比较,差异无统计学意义(P0.05),并且可以在较短时间内获得满意的常规和荧光定量PCR结果,且耗时较短。结论改良NaI法是一种简便、快速的提取人微量全血基因组DNA的方法,在临床和基础研究中具有较大的应用价值。     

不同核酸提取试剂盒对血浆游离DNA提取效果的比较

目的 比较北京天根生化科技有限公司生产的大体积游离核酸提取试剂盒(磁珠法,货号:DP-710,以下简称天根)与德国Qiagen公司生产的Circulating Nucleic Acid kit(硅胶膜吸附柱法,货号:55114,以下简称Qiagen)对血浆当中游离DNA(cfDNA)的提取效果.方法 收集Qiagen和...     

不同保存时间对人乳头瘤病毒DNA检测结果的影响

目的研究不同保存时间对人乳头瘤病毒(HPV)DNA检测结果的影响。方法收集HPV高危型标本,按病毒水平分为高水平组、中水平组和低水平组,每组各5例,每例分装成3份,其中1份立即提取DNA并进行检测(原始水平),检测后将其置于4℃冰箱保存(已提取DNA标本),其余2份标本直接置于4℃冰箱保存(未处理标本)。分别于第2、4周对已提取DNA标本和未处理标本进行HPV DNA检测分析。结果未处理标本和已提取DNA标本的3个水平组HPV DNA检测结果一致。高、中、低水平组第2周HPV DNA水平与对应的原始水平比较,差异无统计学意义(P0.05)。高、中水平组第4周HPV DNA水平与对应的原始水平比较,差异无统计学意义(P0.05);而低浓度组第4周HPV DNA水平降低甚至消失,无法进行检测。结论适宜的保存温度和保存时间可保证HPV DNA水平的稳定,有利于指导标本的保存和复查工作。     

4℃条件下血细胞细胞核DNA稳定性的探讨

目的探讨全血在4℃保存,细胞核DNA的稳定性。方法通过人类白细胞抗原A、B、DR位点(HLA-A、B、DR)基因分型结果来判断细胞核DNA的完整性。结果24份全血4℃保存20d内,其提取的DNA电泳条带清晰完整,而25d后,则有2份已无法提取出细胞核DNA,有2份细胞核DNA电泳条带出现拖尾现象,提示该DNA样本出现降解,以此DNA进行HLA-A、B、DR位点分型,电泳图谱出现部份特异性和内对照条带缺失,无法进行正确分型。结论全血4℃下保存20d,其细胞核DNA可保持稳定。     

56℃热放散不同时间下对红细胞A、B及RhD抗原反应性的影响

目的 了解红细胞A、B及RhD抗原反应性在56 ℃水浴中随时间增加而发生的变化,观察为提高放散效果是否可适当延长孵育时间.方法 选取红细胞A、B、RhD抗原阳性的标本各3份,利用溶血试验、凝集强度试验、抗体效价试验观察56 ℃热放散时在不同时间下红细胞A、B、RhD抗原反应性减弱的程度.结果 A、B、RhD抗原阳性的红细胞随孵育时间的延长溶血逐渐加重,20 min时约有50%溶血,至40 min已近100%溶血;A、B抗原随时间的增加,前15 min抗原反应性减弱不明显,而RhD抗原随时间的延长,抗原反应性明显减弱.结论 ABO血型系统可适当延长热放散时间,以10～15 min为宜,而热放散不适于RhD血型.     

不同放置条件下放置时间对临床尿液样本检测结果的影响

目的:探讨临床尿液样本不同放置条件下的放置时间对检测结果的影响,以提高对尿液标本分析前的质量控制。方法:随机选取 33 名该院门诊就医病人,收集其随机尿液样本,分别检测尿生化、尿常规、尿流式相关检测指标。采用配对 t 检验和配对秩和检验进行统计分析。结果:在室温放置条件下,尿钠(Na)在 4h 显著升高(P <0.05);尿肌酐(CREA)、尿酸(UA)、白细胞平均前项散射光强度(WBC-MFsc)在 6h 出现明显变化(P <0.05),其中 CREA、UA显著升高,WBC-MFsc 显著下降;尿总蛋白(TP)在8h 显著升高(P <0.05),其余各检测指标在室温放置 8h 无显著性变化(P >0.05)。在 4℃冰箱保存条件下,尿钾(K)在 6h显著降低(P <0.05),尿 UA 在 8h显著降低(P <0.05);其余各检测指标在 8h 无显著性变化(P >0.05)。结论:不同放置条件下的放置时间对某些尿液检测结果可产生影响,在实际工作中应规范尿液标本检测流程。     

加提取液后不同振荡混匀时间对HBV DNA检测结果的影响

目的 探讨在PCR定量检测HBV DNA过程中,加入提取液后的振荡混匀时间对检测结果 的影响,以选择适当的混匀时间.方法 选择10份HBV DNA阳性标本,分为4组,在加入提取液后,每组标本分别混匀0 s(不混匀)及10、60、180 s,其他步骤完全按说明书操作,对不同混匀时间组HBV DNA定量结果 进行统计分析.结果 在加入提取液后,分别混匀10、60、180 s,其HBV DNA检测结果 差异无统计学意义(P>0.05);加提取液后不混匀组检测结果 最低,与其他各组检测结果 差异有统计学意义(P<0.01).结论 HBV DNA定量检测中,加入提取液后必须振荡混匀,混匀时间在10 s左右即可,不必将沉淀完全混匀.