BPDE诱发16HBE恶性转化过程中eIF3 p36的表达变化

目的探讨二羟环氧苯并芘（BPDE）诱发人支气管上皮细胞（16HBE）恶性转化过程中不同阶段真核生物蛋白翻译启始因子（elF3 p36 mRNA）表达水平的变化，为进一步阐明BPDE的分子致癌机理提供线索。方法应用RT—PCR和FQ—PCR方法，检测并分析BPDE诱发16HBE恶性转化不同阶段的eIF3p36mRNA表达量的变化。结果相对于非转化对照细胞，BPDE诱发恶性转化16HBE不同阶段细胞（转化细胞和成瘤细胞）的eIF3p36mR-NA基因表达水平均显著高于对照组（P〈0．01或P〈0．05），其中BPDE-转化细胞的elF3 p36平均表达量分别是对照细胞的2．3～5．1倍：而BPDE-转化细胞与BPDE-成瘤细胞的elF3 p36平均表达量相比，差别无显著性（P〉0．05），提示elF3 p36的异常表达量与BPDE诱发16HBE细胞恶变程度之间存在一定的正向关系。结论BPDE在诱发16HBE细胞恶变过程中，存在明显的elF3 p36的异常表达现象，其表达水平与细胞的恶变程度密切相关，这可能是BPDE诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机理之一。     

氯化镉诱发16HBE细胞恶性转化不同阶段P16基因甲基化研究

目的对氯化镉（CdCl2）诱发16HBE细胞系恶性转化不同阶段P16基因启动子区甲基化状况进行研究，探讨镉的表遗传致癌机制。方法从各组CdCl2恶性转化不同阶段及接种裸鼠成瘤的16HBE细胞中提取全基因组DNA，采取甲基化特异性PCR法（Methylation—specific PCR，MSP）检测该基因组P16基因启动子区的甲基化状况，与非转化的16HBE对照细胞进行比较，并用去甲基化因子5-Azac（5-Aza-2＇deoxycytidine）处理有异常甲基化的细胞。结果CdCl2恶性转化及接种裸鼠成瘤的16HBE细胞P16抑癌基因启动子区CpG岛存在异常高甲基化现象，且随着细胞恶性程度的增加，甲基化现象有明显升高的趋势，同时发现有异常高甲基化的细胞经去甲基化处理后甲基化现象消失。结论P16基因启动子区的高甲基化导致抑癌基因表达关闭，无法正常发挥细胞增殖周期对细胞分裂和生长的负调控，造成细胞周期失控而导致无限制地细胞增殖，这可能是氯化镉诱导16HBE细胞恶性转化及接种裸鼠成瘤的一种表遗传致癌作用。研究结果可部分解释镉化合物的细胞转化作用及其可能的表遗传致癌机制，以及进一步对甲基化的表型逆转和药物治疗研究提供了重要依据。     

氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中DNA损伤的研究

目的 探讨氯化镉恶性转化人支气管上皮(16HBE)细胞中DNA断裂损伤情况,进一步揭示氯化镉的致癌机制.方法 采用单细胞凝胶电泳试验(彗星试验)检测氯化镉恶性转化人支气管上皮细胞中非转化16HBE细胞、氯化镉恶性转化第15代、第35代细胞及成瘤细胞的DNA链断裂情况.结果 与非转化16HBE对照细胞比较,氯化镉恶性转化16HBE第15代、第35代细胞和氯化镉诱发16HBE恶性转化细胞接种裸鼠成瘤细胞的DNA损伤率分别达22.00%、46.75.00%和49.00%,明显高于非转化16HBE细胞的4.75%损伤率(P＜0.001),三种细胞彗星尾长也显著大于非转化16HBE细胞(P＜0.001).结论 细胞DNA损伤可能是镉化物分子致癌的重要机制.     

hOGG1基因在氯化镉恶性转化16HBE细胞系过程中的表达

目的探讨OGG1基因在氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中mRNA的表达情况。方法用半定量反转录-聚合酶链反应(PT-PCR)技术检测16HBE细胞、氯化镉恶性转化16HBE细胞系不同阶段(第5、15、32代细胞及成瘤细胞)hOGG1基因mRNA的表达情况。结果与16HBE细胞比较,hOGG1基因mRNA在第32代细胞及成瘤细胞的表达明显低下(P<0.01)。结论氯化镉诱发16HBE细胞系恶性转化过程中hOGG1基因表达逐渐下降,hOGG1基因水平的改变可能是氯化镉的致癌机制之一。     

Malignant transformation and abnormal expression of eukaryotic initiation factor in bronchial epithelial cells induced by cadmium chloride

Objective To analyze the relationship between malignant transformation and abnormal expression of eukaryotic initiation factor 3 （eIF3 p36） in human bronchial epithelial （16HBE） cells induced by cadmium chloride （CdCl2）. Methods 16HBE cells were treated several times with different concentrations of CdCl2. Tumorigenic potential of transformed cells was identified by assays for anchorage-independent growth in soft agar and for tumorigenicity in nude mice after the 35th passage. Total RNA was isolated from 16HBE cells induced by CdC12, including non-transformed, Cd-transformed, and Cd-tumorigenic cell lines. Special primers for eIF3 p36 were designed and the expression of eIF3 mRNA in different cell lines was detected with fluorescent quantitative-polymerase chain reaction technique （FQ-PCR）. Results The 35th passage of 16HBE cells transformed by CdCl2 exhibited overlapping growth. Compared with the non-transformed cells, colonies of transformed cell lines in soft agar showed statistically significant increases and dose-dependent effects （P〈0.01）. All Cd-induced transformed cell lines formed rumors in nude mice within 2 weeks of inoculation, but none of the mice injected with non-transformed cells showed tumors even after 3 weeks. All tumors were pathologically identified as poorly differentiated squamous cell carcinoma. The eIF3 p36 genes in different stages of 16HBE cells transformed by CdCl2 were elevated as compared with the non-transformed control （P〈0.01）, and the eIF3 expression increased with the degree of cell malignancy. Conclusion CdCl2 is capable of inducing morphological transformation in 16HBE cells and transformed cells are potentially tumorigenic. Over-expression of eIF3 p36 is positively correlated with malignant transformation of 16HBE cells induced by CdCl2 and may be one of the molecular mechanisms potentially responsible for carcinogenesis due to Cd.     

稳定eIF1过表达的鼻咽癌细胞株的构建及其功能研究

目的 构建稳定真核翻译起始因子1(eIF1)过表达的鼻咽癌细胞株,研究其对鼻咽癌细胞增殖和迁徙活性的影响.方法 采用pEGFP-C1真核表达系统,构建eIF1过表达载体,转染鼻咽癌CNE1细胞,进而获得稳定转染细胞株CNE1-eIF1及其对照细胞,以实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)验证该细胞中eIF1的过表达情况.采用细胞增殖与迁徙实验分别检测CNE1-eIF1细胞增殖和迁徙活性.结果 酶切电泳鉴定及测序检测显示pEGFP-C1-eIF1真核表达载体构建成功.稳定eIF1过表达的鼻咽癌CNE1细胞CNE1-eIF1的eIF1基因和蛋白的表达水平与空载质粒转染相比分别增加2.85倍和2.58倍(P＜0.05),而其增殖和迁徙活性组分别下调55％和36％(P＜0.05).结论 成功构建eIF1过表达鼻咽癌细胞株,eIF1过表达可显著下调鼻咽癌细胞的增殖和迁徙活性,提示其具有潜在的抑癌作用.     

应用基因芯片技术筛查肺癌变相关基因的研究

目的 使用基因芯片技术研究肺鳞癌及化学致癌物诱导入气管上皮细胞恶性转化的癌变相关基因。方法 应用含4096条人类全长基因的cDNA芯片分别检测6例肺鳞癌和6例正常肺组织的基因表达谱;并用上述芯片研究苯并(a)芘代谢产物BPDE[anti-Benzo(a)pyrene diolepoxide,BPDE]和结晶型硫化镍所诱导的人支气管上皮细胞恶性转化与正常的人支气管上皮细胞系(16HBE)在基因表达谱上的差异;将3类标本共同的差异表达基因确定为肺癌变的相关基因。结果 在肺鳞癌／正常肺组织之间、BPDE诱导的恶性转化细胞／正常16HBE细胞之间及硫化镍诱导的恶性转化细胞/正常16HBE细胞之间发现差异表达基因分别为171条、143条和151条。通过比较,发现89条与肺癌变相关的共同基因,其中表达显著增加的基因39条,它们是：癌基因6条;细胞周期相关基因4条;细胞增殖基因6条;肿瘤转移基因8条;神经内分泌基因3条;耐药基因1条;凋亡抑制基因1条;氧化基因1条;其他基因9条。表达显著下降的基因50条,它们是：抑癌基因7条;DNA修复基因11条;抗氧化基因1条;GST基因家族3条;细胞骨架基因3条;凋亡诱导基因2条;信号传导基因5条;细胞因子及其受体基因5条;细胞代谢基因7条,细胞外基质基因1条;其他基因5条。结论 cDNA基因芯片技术能有效地研究基因的表达谱,筛查出肺癌变相关基因。     

日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的 对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosoma japonicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法 将插入于pTriplEx2质粒上的cDNA进行测序，测序结果经BLAS Tn程序搜索，发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit，elF2α)基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2质粒上的5′端测序引物相匹配的PCR下游引物，从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上，并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索；用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果 发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因，核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87％和79％，编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论 用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因，编码eIF2α亚基，全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

eIF3b在三阴性乳腺癌细胞增殖和侵袭中的作用

目的：探讨真核细胞翻译起始因子3 的亚基b（eIF3b）基因在三阴性乳腺癌（TNBC）增殖和侵 袭中的作用。方法：采用免疫组化法检测50 例TNBC组织中eIF3b蛋白的表达;应用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、细胞计数试剂盒8（CCK-8）、细胞克隆形成、细胞划痕实验、细胞侵袭实验,以及蛋白质印迹（Western blot）法分别检测RNA干扰（RNAi）前后MDA-MB-231细胞株eIF3b mRNA表达、细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭能力的变化,以及β-Catenin、C-myc蛋白的表达。结果：50例TNBC中eIF3b高表达率为74%,显著高于癌旁正常组织（P ＜0.01）,与Ki-67 表达、淋巴结转移有关（P ＜0.05）,而与患者年龄、肿瘤大小、组织学类型无关（P ＞0.05）。RNAi后MDA-MB-231细胞株的eIF3b mRNA水平显著下降（P ＜0.05）,细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著低于对照组（P ＜0.05）,Western blot结果显示β-Catenin蛋白和C-myc蛋白表达水平显著低于对照组（P ＜0.05）。结论：eIF3b在TNBC组织中高表达;eIF3b基因沉默可抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,可能与阻断Wnt/β-Catenin信号通路影响细胞周期有关。     

日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosomajaponicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTn程序搜索,发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit, eIF2α) 基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2 质粒上的5'端测序引物相匹配的PCR下游引物,从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上,并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI 站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索;用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因,核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87%和79%,编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因,编码eIF2α亚基,全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

Alterations of FHIT gene and P16 gene in nickel transformed human bronchial epithelial cells

INTRODUCTION Nickel is a widely distributed occupational and environmental pollutant. Epidemiological studies demonstrated that the incidence of respiratory tract cancer is correlated with worksite exposure to nickel. Nickel is also a potent carcinogen in laboratory animals. The International Agency for Research on Cancer (IARC) has classified nickel compounds as confirmed human carcinogens[1]. However, the mechanism of nickel carcinogenesis remains unknown. Insoluble nickel compounds…     

Alterative Expression and Sequence of Human Elongation Factor-15 during Malignant Transformation of Human Bronchial Epithelial Cells Induced by Cadmium Chloride

Objective To study the alternative expression and sequence of human elongation factor-1δ(human EF-1δ p31) during malignant transformation of human bronchial epithelial cells induced by cadmium chloride (CdCI2) and its possible mechanism. Methods Total RNA was isolated at different stages of transformed human bronchial epithelial cells (16HBE) induced by CdCI<.2> at a concentration of 5.0 μM. Special primers and probe for human EF-1δ p31 were designed and expression of human EF-1δ mRNA from different cell lines was detected with fluorescent quantitative PCR technique. EF-1δ cDNA from different cell lines was purified and cloned into pMD 18-T vector followed by confirming and sequencing analysis. Results The expressions of human EF-1δ p31 at different stages of 16HBE cells transformed by CdCl<.2> was elevated (P<0.01 or P<0.05). Compared with their corresponding non-transformed cells, the overexpression level of EF-18 p31 was averagely increased 2.9 folds in Cd-pretransformed cells, 4.3 folds in Cd-transformed cells and 7.2 folds in Cd-tumorigenic cells. No change was found in the sequence of overexpressed EF-1δ p31 at different stages of 16HBE cells transformed by CdCl<.2>. Conclusion Overexpression of human EF-1δ p31 is positively correlated with malignant transformation of 16HBE cells induced by CdCl<.2>, but is not correlated with DNA mutations.     

Cloning and identification of a novel variant of human vascular endothelial growth factor

Vascular endothelialgrowth factor ( VEGF) is amultifunctional cytokine thatexerts in vivo a key rolein physiologicalneoangiogenesisduring embryonicde-velopmentor the female cycle and pathologicalneoan-giogenesis of many diseases including hypervascular-ized tumors,rheumatoid arthritis,and retinopathiesdiseases[1— 3] by stimulating endothelial cell prolifera-tion and vessel hyperpermeability.VEGF exists asone of five different isoforms,VEGF1 2 1 ,VEGF1 65 ,VEGF1 83,VEGF1 89and VEGF2 …     

人eIF4A3真核表达载体构建及稳定表达细胞株筛选

目的 构建人eIF4A3重组质粒载体,筛选高表达人eIF4A3的稳定细胞株。方法RT-PCR克隆eIF4A3基因,将获得的基因片段分别连接到含有HA和c-myc标签的质粒载体上,转染HeLa细胞,经G418筛选获稳定表达细胞株,在体外翻译体系中进行体外翻译,通过免疫印迹鉴定eIF4A3的表达。结果成功构建人eIF4A3...     

人白细胞介素-10 cDNA的克隆

目的：克隆人白细胞介素10(hIL-10)cDNA的全长序列，为其分子生物学利用奠定基础。方法：无菌条件抽取正常成人外周血15ml，分离单核细胞，用刀豆素A(ConA)刺激培养24h；离心得到一定量细胞，加入变性液，一步法提取细胞总RNA；反转录合成IL-10的第1条链，用自己设计的特异性上下游引物进行PCR扩增，得到期望分子量的PCR产物；酶切后插入PcDNA3载体，转染感受态细胞进行筛选制备，并行酶切鉴定和测序。结果：外周血单核细胞经ConA刺激后IL-10转录水平增加，从提取的RNA反转录产物中容易扩增出期望分子量的PCR产物，酶切鉴定证明得到的IL-10cDNA分子量与基因库报告的相近，测序结果表明得到的IL-10cDNA序列与基因库报告的序列完全一致。结论：人的IL-10cDNA全长序列被成功克隆。     

pEgr-sHemopexin重组质粒的构建及体外辐射诱导表达

目的：克隆小鼠分泌型Hemopexin (sPEX) 编码区的cDNA序列,构建含Egr-1启动子的pEgr-sPEX真核表达载体,检测辐射诱导重组质粒在B16F10细胞中的表达。 方法：用RT-PCR从NIH3T3细胞中扩增出sPEX,经测序证实后,构建pEgr-sPEX重组质粒,以脂质体转染B16F10细胞,用Western blotting方法检测B16F10细胞上清中辐射诱导PEX的表达。 结果：测序表明扩增的sPEX cDNA序列与GenBank中登录的序列完全一致,sPEX cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1-Egr-1,转染入B16F10细胞内PEX基因在体外辐射诱导下成功获得表达。结论：成功地克隆了小鼠sPEX基因,并在体外证实了pEgr-sPEX具有辐射诱导表达特性。