MyD88缺去突变基因转染降低病原菌感染的人呼吸道上皮细胞IL-8的分泌

白细胞介素-8（1L-8）是呼吸道炎症反应的重要介质。本实验通过构建突变MyD88真核表达质粒（MyD88 DN），转染人呼吸道上皮细胞株A549及SPC-A-1，探讨其对病原菌感染上皮细胞IL-8表达的影响。结果显示：MyD88 DN转染可降低结核杆菌、绿脓杆菌培养上清诱导的IL-8释放；对肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌活菌侵袭细胞所刺激的IL-8分泌也有明显的阻断作用。提示突变MyD88能够阻断细菌感染引起的呼吸道上皮细胞IL-8表达，可能成为呼吸道严重炎症反应基因治疗的新靶基因。     

结核分支杆菌培养上清诱导呼吸道上皮细胞IL-8表达

目的：观察呼吸道上皮细胞对结核杆菌产物产生的炎症反应，探讨炎症反应信号传递的机制。方法：制备结核分枝杆菌强毒力H37RV株培养上清，用培养上清刺激肺上皮细胞株SPC-A-1和A549，酶联免疫吸附实验检测细胞IL-8表达量。用突变MyD88表达重组质粒转染SPC-A-1细胞，观察MyD88与结核杆菌培养上清诱导上皮细胞炎症反应信号传递的关系。结果：结核分枝杆菌强毒力H37RV株培养上清明显增加SPC-A-1和A549细胞IL-8的表达。用突变MyD88表达重组质粒pcDNA3．1-MyD88转染SPC-A-1。结果显著抑制了结核杆菌培养上清对SPC-A-l细胞的炎症刺激作用。结论：结核杆菌培养上清能够诱导呼吸道上皮细胞IL-8表达，，Toll／IL-1受体信号通路及MyD88分子与细胞炎症反应的信号传递相关，提示在肺结核病发病过程中。结核杆菌的代谢产物可能刺激肺上皮细胞产生炎症细胞因子，参与肺结核炎症病变的形成。     

铜绿假单胞菌活菌对呼吸道上皮细胞表达IL-8的影响

目的:探讨铜绿假单胞菌活菌与人呼吸道上皮细胞的相互关系,细菌对呼吸道上皮炎症反应的影响。方法:采用PAO1及ATCC 27853两株铜绿假单胞菌,在体外与培养的呼吸道上皮细胞株A549及无血清培养的人支气管上皮原代细胞相互作用,收集细胞培养上清,ELISA检测上清IL-8浓度。结果:两株绿脓杆菌均能诱导呼吸道上皮细胞IL-8分泌增加,在细菌刺激下,A549细胞IL-8分泌比对照高出5倍(P<0.05),原代上皮细胞IL-8分泌比对照高出8倍(P<0.05)。结论:铜绿假单胞菌呼吸道感染的过程中,细菌与上皮细胞的直接作用可能是呼吸道炎症反应的重要原因。铜绿假单胞菌刺激上皮细胞炎症的分子机制和信号传导值得进一步探讨。     

SIGIRR对H292细胞Toll样受体4、5、9致炎作用的影响及机制研究

目的 观察SIGIRR(sigh Ig IL-IR-related molecule)对人气道上皮细胞株H292中Toll样受体(TLR)4、5、9致炎作用的影响,并初步了解其作用机制.方法 运用脂质体转染的方法,将SIGIRR-EGFP融和蛋白真核表达载体稳定转染H292细胞,通过免疫细胞化学技术观察H292细胞中SIGIRR的过表达情况;经LPS、Flagellin、CpG DNA 2006处理后,ELISA检测重组质粒(SIGIRR-EGFP)、空质粒(pEGFP-N1)转染以及未转染的H292细胞分泌致炎因子TNF-a和IL-6水平;通过免疫共沉淀的方法了解SIGIRR与MyD88之间的关系.结果 激光共聚焦显微镜显示重组融合蛋白SIGIRR-EGFP与H292内源SIGIRR共定位于细胞膜上;经LPS、Flagellin、CpG DNA 2006刺激后,重组质粒转染的H292细胞分泌的IL-6和TNF-a水平显著低于空质粒转染和未转染的H292细胞(P＜0.01);免疫共沉淀提示H292细胞受到刺激后,SIGIRR与MyD88有较强相互作用,可与TLR4、5、9竞争结合MyD88分子.结论 SIGIRR对H292细胞TLR4、5、9致炎通路的负性调节作用,可能是通过减少MyD88分子与TLR4、5、9的结合,从而削弱了炎症信号的细胞内转导.     

呼吸道上皮细胞与致病菌相互作用--上皮细胞内吞细菌实验研究

目的：呼吸道上皮细胞在防御这类机会致病菌感染时发挥了重要的作用。本研究旨在探讨上皮细胞能否清除胞内的绿脓杆菌，胞内模式识别受体Nods蛋白家族是否参与胞内杀菌，防御素是否能通过促经克雷伯杆菌粘附到上皮细胞而被上皮细胞内在化而清除。方法：首先用绿脓杆菌活菌刺激支气管原代上皮细胞及A549细胞，活菌细胞共孵育两小时后庆大霉素杀死未进入胞内的细菌，继续孵育4小时，24小时后，用TritonX-100溶解细胞，采用平板菌落计数法计数胞内活菌数。绿脓杆菌与细胞按不同比例共孵育两小时后庆大霉素杀死未进入胞内的细菌，继续培养24小时后收集细胞培养上清，酶联免疫吸附法（ELISA）检测IL-8的表达量。为进一步研究Nods蛋白是否在胞内杀菌及活菌在胞内引起IL-8分泌中发挥作用，我们用超声处理的绿脓杆菌菌体成分刺激使细胞膜通透性增加的温和去污剂digitonin处理和未使用digitonin处理A549细胞，ELISA检测细胞IL-8表达水平。胞内模式识别受体Nod1，Nod2可以识别菌体成分，用RT-PCR检测肺上皮细胞Nodl，Nod2的表达。其次，     

Menin 对 MyD88表达调控的初步研究

目的：探讨 menin 蛋白对髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)基因表达的调控作用。方法在 Men1基因敲除的小鼠 mef (Men1-/- mef)细胞中,转染可以过表达 menin 蛋白的 me-nin-PCI-NEO 质粒,运用 Western 印迹技术检测 menin 对 MyD88蛋白表达的影响。构建包含 MyD88启动子的报告基因质粒,在 Men1-/- mef 细胞中,将 MyD88启动子质粒和 menin-PCI-NEO 质粒或其阴性对照 PCI-NEO 共转染,利用荧光报告基因系统分析 menin 对 MyD88基因启动子活性的影响。结果转染 menin-PCI-NEO 质粒后, menin 蛋白表达升高的同时, MyD88蛋白的表达减少。在荧光报告基因系统中,转染 menin-PCI-NEO 质粒后 MyD88基因启动子活性被抑制。结论 menin 蛋白可以下调 MyD88蛋白的表达,这种作用可能通过抑制 MyD88基因的转录而实现。     

SIGIRR过表达抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞NF-κB的活化

目的: 研究单免疫球蛋白白介素1受体相关蛋白(SIGIRR)对脂多糖(LPS)刺激的肺泡上皮细胞核因子-κB信号通路的调节作用。方法: 以LPS刺激人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549。将含有SIGIRR cDNA 全长的真核表达载体瞬时转染A549细胞,使SIGIRR在A549细胞过表达。用双萤光素酶报告系统检测LPS刺激后A549细胞NF-κB的转录活性,用ELISA法检测LPS刺激后细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)的水平,对比转染与否对上述因子在A549细胞中释放水平的影响。结果: 在A549细胞中,过表达SIGIRR可显著抑制NF-κB的转录活性,同时抑制LPS诱导的细胞因子IL-1β、TNF-α以及IL-6的表达。 结论: SIGIRR过表达可以抑制LPS触发的肺泡上皮细胞中TLR4信号的转导,从而发挥减轻炎症反应、保护肺泡上皮细胞的作用。     

香烟提取物和腺病毒E1A基因对肺泡上皮细胞ICAM-1表达的影响

目的:探讨香烟提取物(CSE)致肺泡上皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的作用及腺病毒E1A基因的影响.方法:通过脂质体转染的方法将腺病毒E1A基因转染A549细胞,获取E1A阳性表达A549细胞,不同浓度的CSE活化,测定细胞ICAM-1的表达.结果:CSE显著增加A549细胞ICAM-1表达,且呈浓度依赖性;与未转染和对照质粒转染A549细胞相比较,CSE活化后E1A阳性表达A549细胞ICAM-1表达显著增加.结论:CSE能够诱导肺泡上皮细胞ICAM-1表达,而腺病毒E1A基因显著增加CSE所致的肺泡上皮细胞ICAM-1表达,提示腺病毒潜伏感染放大吸烟所致的气道炎症反应.     

纳米载体组氨酸接枝聚介导的 shRNA 对大鼠肝脏 MyD88基因表达的干扰作用

目的：研究应用纳米载体组氨酸接枝聚（β-氨基酯）（HGPAEs）介导的RNA干扰技术对大鼠肝脏髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）基因表达的抑制作用。方法构建HGPAEs及针对大鼠MyD88基因的shRNA（ small hairpin RNA）质粒,并将二者耦合成pMyD88-HGPAEs载体,分别设置生理盐水组、HGPAEs 组、pHK-HGPAEs 阴性对照组、shRNA 组和pMyD88-HGPAEs干预组,通过门静脉注射方法体内转染大鼠肝脏,分别采用荧光定量PCR技术和蛋白印迹法（ Western blot ）检测转染后的MyD88转录水平及蛋白表达水平。结果成功构建载shRNA质粒的HGPAEs载体,体内转染大鼠肝脏后,shRNA组及pMyD88-HGPAEs干预组MyD88基因表达水平差异具有统计学意义（P＜0．05）。与其他4组相比,pMyD88-HGPAEs干预组MyD88基因的mRNA转录水平及蛋白表达水平显著下降（ P＜0．01）,而生理盐水组、单纯HGPAEs组、pHK-HGPAEs阴性对照组转染后MyD88基因mRNA转录水平及蛋白表达水平差异无统计学意义（ P＞0．05）。结论 HGPAEs是一种较为理想的基因转运载体,应用针对大鼠MyD88基因的载shRNA质粒的HGPAEs载体,经门静脉注射方法转染大鼠肝脏可显著性抑制MyD88基因表达,本实验成果的取得为下一步动物实验提供一定的资料。     

Napsin A基因转染干预A549细胞的上皮-间质转化

目的 探讨Napsin A基因转染至A549细胞对其上皮-间质转化(EMT)的作用和机制.方法 采用慢病毒载体质粒PLJM1构建重组质粒PLJM1-Napsin A,将Napsin A基因转染至A549细胞染色体中并鉴定.用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激A549细胞构建体外EMT模型,倒置显微镜下动态观察细胞形...