北京市2008年肠道病毒71型的RT-PCR鉴定及VP1区基因特征分析

目的 研究2008年北京市手足口病（Hand,foot and mouth disease,HFMD）患者中肠道病毒71型（Human enterovirus 71,HEV71）的VP1编码区基因特征.方法 采集北京市朝阳区医院和幼儿园的HFMD患者标本共285份,进行HEV71特异性RT-PCR鉴定和病毒分离,随机选取10株HEV71阳性分离株进行VP1编码区基因扩增和核苷酸序列测定和分析.结果 129份标本RT-PCR鉴定结果 为阳性,阳性率为45.26%.10株HEV71在VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上的差异分别在94.6%～99.6%和95.9%～100%之间.北京朝阳HEV71分离株属于C4基因亚型C4a进化分支.结论 RT-PCR法可以快速、准确地鉴定HEV71.引起本次HFMD流行的HEV71为C4基因亚型C4a进化分支,并且存在多个传播链,提示自1998年起,C4亚型的HEV71在中国大陆有较广泛的传播.加强对HEV71的分子流行病学监测,了解HEV71的基因特征,对预防和控制HEV71在中国的暴发具有重要意义.     

宁夏2009年肠道病毒71型基因特征分析

目的 分析2009年宁夏回族自治区手足口病（Hand-Foot-and-Mouth Disease,HFMD）患者中肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）分离株的基因特征.方法 2009年,从宁夏自治区344例HFMD病例中采集的385份标本,用人横纹肌肉瘤（Human Rhabdomyosarcoma,RD）细胞对标本进行肠道病毒分离培养;采用型特异性RT-PCR对阳性分离物中的EV71病毒进行鉴定;对鉴定的EV71毒株VP1编码区进行核苷酸序列测定分析.结果 共分离到肠道病毒126株,其中58株为EV71（46%）,对其中46株EV71的VP1编码区序列进行测定和分析.宁夏分离株与EV71的A和B基因型代表株核苷酸序列同源性分别为81.7%～82.8%和83.1%～85.2%,氨基酸序列同源性分别为93.9%～95.9%和96.2%～97.9%;与C基因型的C1、C2、C3、C4a、C4b和C5亚型代表株核苷酸序列同源性分别为88.3%～90.6%、88.3%～90.1%、87.8%～89.0%、94.2%～98.9%、91.8%～94.1%和86.7%～89.1%;氨基酸序列同源性分别为97.9%～99.6%、97.9%～99.3%、97.6%～98.9%、97.9%～100%、98.6%～99.6%和97.9%～98.9%.在系统发生树上,这46株毒株与C4基因型代表株聚为一簇,属于C4亚型中的C4a分支.结论 2009年EV71的C4a亚型在宁夏有较广泛的流行,是宁夏流行的绝对优势基因亚型,C4a也是我国2005年以来流行的优势基因亚型.     

西安地区2008年肠道病毒71型基因特征分析

目的 研究西安地区2008年引起手足口病病原构成及EV71的基因特征.方法 采集124例临床诊断手足口病病例标本,RT-PCR检测肠道病毒血清型别;挑选EV71阳性标本进行病毒分离,扩增7株EV71病毒,扩增其VP1区,测序并与EV71各血清型代表株序列比对,进行进化分析.结果 2008年西安地区手足口病（HFMD）的病原中CA16占49.45%,EV71占30.76%,其他肠道病毒占19.78%.7株EV71 VP1区与标准株序列比对,亲缘进化分析显示本地区EV71与中国大陆其他地区毒株相似.结论 2008年西安地区引起手足口病的病原以CA16为主,而EV71属于C4亚型.     

吉林省2009-2012年肠道病毒71型VP1编码区氨基酸位点的变异分析

目的分析2009--2012年引起吉林省手足口病（handfootandmouthdisease,HFMD）流行的肠道病毒71型（EV—A71）的VP1区氨基酸位点的特征性变异位点。方法对2009--2012年分离于吉林省HFMD病例的70株EV—A71分离株的VPl编码区进行逆转录．聚合酶链反应,然后对扩增产物进行核苷酸序列测定,使用Bioedit软件和MEGA4．0软件分析VPl区氨基酸位点的变异特征以及基因亲缘关系。结果2009--2012年在吉林省分离到的70株EV—A71均属于C4a基因亚型,其中69株与2008年安徽阜阳的分离株亲缘关系最近,并且这69株病毒在VPl编码区第22位氨基酸位点均由谷氨酰胺转变为组氨酸（Q—H）,与2008年安徽阜阳株一致。结论引起2009-2012年吉林省HFMD流行的EV-A71可能：来源于安徽阜阳流行株延续传播。     

肠道病毒71型的分子病毒学研究进展

肠道病毒71(Enterovirus71,EV71)是导致婴幼儿感染的重要病原之一,自1974年首次报道以来,在世界范围内引起多次暴发与流行并且在我国地区的流行也呈上升趋势,该病毒感染具有较广的疾病谱,除引起大规模的手足口病暴发,也可引起严重的中枢神经系统感染,并可导致死亡,近年来受到人们的广泛关注.本文对EV71病毒生物学特征、分子流行病学、致病毒力及预防控制等方面的研究进展作一概述.     

肠道病毒71型手足口病的疫苗筛选和观察

目的 筛选安全有效新型EV71候选疫苗,为将来EV71疫苗开发应用奠定基础.方法 以重组蛋白VP1为疫苗设计靶点,不同候选疫苗包括灭活疫苗、DNA疫苗、VP1蛋白疫苗在0、2周、4周分别按照不同剂量和肌内注射途径免疫BALB/c雌性小鼠,在0、2周、4周、6周、8周、10周、16周分别采集小鼠尾静脉血,16周处死小鼠,收集小鼠脾脏细胞,检测小鼠体液免疫和细胞免疫功能,筛选评价候选疫苗的疗效和安全性.结果 灭活病毒疫苗、VP1 DNA质粒疫苗、VP1蛋白疫苗免疫小鼠2周后IgG抗体滴度即开始升高,4周后明显升高,8周后达高峰,至少维持16周以上;IgG亚类以IgG2a和IgG1为主.三种疫苗能诱导以γ-IFN和IL-4为主的细胞免疫反应.灭活疫苗疗效优于其他候选疫苗,未发现疫苗相关不良反应.结论 灭活病毒疫苗、VP1 DNA质粒疫苗、VP1蛋白疫苗均能诱导持久的特异性细胞免疫和中和抗体反应,以灭活病毒疫苗疗效较好,需要将来攻毒实验可进一步验证其免疫力.     

深圳地区肠道病毒71型VP1基因变异趋势研究

目的 研究深圳地区肠道病毒71型VP1基因变异趋势.方法 用肠道病毒71型特异性引物进行RT-PCR,并对EV71的VP1进行扩增,所得的序列与肠道病毒71型A、B、C基因型代表株的核苷酸序列比较,用DNA Star、BioEdit和Mega 3.1软件进行系统进化分析.结果 35株病毒间VP1核苷酸同源性为92.1%-100%,它们与A、B基因型代表株VP1区核苷酸同源性差异较大,为81.4%-91.1%,与C4基因型代表株接近,其核苷酸同源性在93%-97.4%之间.1998-2004年深圳地区EV71主要流行株为C4b亚型,从2003年开始逐步向C4a亚型过渡,至2006年已全部变迁为C4a亚型,且从2003年至2008年,深圳地区EV71 C4a株与安徽阜阳株FY23的核苷酸的同源性分别为：94.5%-94.7%,95.7%-95.8%,96.2%,95.4%-97.5%,96.3%-99.2%,有逐年增高的趋势.2006年两株EV71和2008年EV71代表株核苷酸序列在VP1区的第66位点,均由A→C,从而导致VP1区氨基酸的第22位点由谷酰胺变为组氨酸（Q→H）.结论 深圳地区EV71流行株逐渐由C4b亚型向C4a亚型演变,2006年部分EV71及2008年EV71 VP1第66核苷酸位点发生有义突变.     

吉林省2009-2010年引起手足口病流行的肠道病毒71型基因特性的研究

目的分析引起吉林省2009--2010年手足口病（hand foot and mouth disease,HFMD）流行的肠道病毒71型的基因进化特征。方法选择31株2009-2010年分离于吉林省8个地市（州）HFMD病例的EV71代表株,对VP1编码区基因进行逆转录．聚合酶链反应扩增、扩增产物的序列测定,使用Bioedit软件和MEGA4．0软件对VP1基因进行同源性、基因亲缘关系分析。结果吉林省2009-2010年的31株EV71分离株均属于C4a基因亚型,3l株EV7t株在VP1区的核苷酸的同源性在94．5％～100％之间,分属于5个分支,其中25株病毒（分离于8个地市）形成一个大的分支,属于绝对优势传播链,其余6株形成4个小分支。结论2009-2010年在吉林省内有多个EV71C4a基因型的传播链同时存在,其中分支1为绝对优势传播链,在8个地市持续传播,引起HFMD的暴发流行。     

携带肠道病毒71型VP1基因的重组减毒沙门菌的构建和鉴定

目的 构建和鉴定能够稳定携带肠道病毒71型(EV71)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌,用于口服EV71 DNA疫苗的研发.方法 利用DNA重组技术,构建表达EV71 VP1蛋白的真核表达质粒VR-EV71 VP1,体外转染Vero细胞后检测目的 蛋白体外表达和抗原性,并将该质粒电转化至减毒伤寒沙门菌SL7027.结果 酶切鉴定证实构建含EV71 VP1基因的重组质粒,体外表达目的 蛋白具有较好的抗原性,并获得稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌.结论 成功构建稳定携带肠道病毒71型VP1基因的减毒伤寒沙门菌,为下一步的疫苗研究打下了基础.     

携带肠道病毒71型VP1基因的重组减毒沙门菌的构建和鉴定

目的 构建和鉴定能够稳定携带肠道病毒71型(EV71)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌,用于口服EV71 DNA疫苗的研发.方法 利用DNA重组技术,构建表达EV71 VP1蛋白的真核表达质粒VR-EV71 VP1,体外转染Vero细胞后检测目的 蛋白体外表达和抗原性,并将该质粒电转化至减毒伤寒沙门菌SL7027.结果 酶切鉴定证实构建含EV71 VP1基因的重组质粒,体外表达目的 蛋白具有较好的抗原性,并获得稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌.结论 成功构建稳定携带肠道病毒71型VP1基因的减毒伤寒沙门菌,为下一步的疫苗研究打下了基础.     

陕西省2010-2012年柯萨奇病毒A组16型VP1基因特征分析

目的 对陕西省2010-2012年来源于手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）病例的科萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CVA16）毒株的VP1基因特征进行分析,以阐明其分子流行病学特征.方法 利用特异性引物对分离鉴定为CVA16的21株病毒进行VP1编码区扩增.对阳性产物进行序列测定,并用MEGA软件进行序列的生物信息学分析.结果 根据亲缘性分析,本研究的CVA16分别属于B1a和B1b基因亚型,其中仅2011年分离自宝鸡市的10株属于B1a基因亚型,分离自其他4个地市的11株则属于B1b基因亚型.B1a和B1b基因亚型内核苷酸序列同源性分别为99.9％ ～100％和92.93％ ～ 100％.不同基因亚型毒株间核苷酸序列差异为8.43％～9.45％.结论 2010-2012年,属于B1a和B1b基因亚型的CVA16在陕西省共同循环,其中B1b基因亚型流行范围较广,可能为陕西省的优势亚型.     

肠道病毒71型山东临沂分离株全基因组序列分析

目的 自1例死亡患儿的标本中分离EV71,并分析其全基因组序列特点,研究其基因序列的改变是否与其神经毒力有关.方法 咽拭子标本采自山东临沂市人民医院1例死亡患儿,在人横纹肌瘤细胞(RD)上分离EV71,分段扩增获得EV71的全序列,用BLAST、Bioedit和MEGA 4进行序列分析.结果 获得1株EV71分离株SDLY107,基因组全长7405 bp,全基因组核苷酸序列与2008年的阜阳株Fuyang.Anhui.P.R.C/17.08/2同源性最高,为98.6%,与原型株BrCr/70的同源性为80.0%,与神经毒型株MS/87的同源性为86.5%.系统进化分析表明,SDLY107与中国大陆的北京株、河南株、广西株、深圳株、兰州株、阜阳株、重庆株、浙江株的亲缘关系较近,按照传统的VP1基因分型方法,可归为C4亚型,是近年来我国大陆流行的主要基因亚型.氨基酸序列分析发现,SDLY107与其他毒株相比,有2个特有的突变(E947D,K1873R).结论 SDLY107分离株属于C4亚型,氨基酸突变E947D和K1873R可能与EV71的致病性有关.

Abstract：

Objective To isolate enterovirus 71 from a death children,and analyze whether the neurovirulence was related to the variation of nucleotide and amino acid. Methods Enterovirus 71 was isolated from throat swabs which were colleted from Shandong Linyi People's Hospital. The full length genome was sequenced by amplification with RT-PCR and sequencing of 9 overlapped gene fragments covering full length of the genomes. The nucleotide and amino acid sequenced was aligned by BLAST, Bioedit and MEGA 4. Results A strain of enterovirus 71 was isolated and named as SDLY107. The full length was 7405 bp. The results of homology analysis of overall nucleotide sequence showed that strain Fuyang. Anhui. P. R. C/17.08/2 had highest homology (98.6%)with strain SDLY107, and the homology was 80.0% between strain SDLY107 with prototype strain BrCr/70,and 86. 5% between strain SDLY107 with nerve strain MS/87. Phylogenetic analysis showed that the phylogeny was close between SDLY107 with some isolated strains from Chinese Mainland, such as Beijing, Henan, Guangxi, Sbenzhen, Lanzhou, Fuyang, Chongqing and Zhejiang strains, which was clustered for C4 subtype. The results of amino acid sequence analysis showed that there were 2 mutations, E947D and K1873R, for strain SDLY107. Conclusion SDLY107 belonged to C4 subtype, amino acid mutations E947D and K1873R of which may be relevant to the pathogenicity of EV71.     

2008-2009年广东手足口病非CA16非EV71肠道病毒株的鉴定及其VP1基因分型研究

目的 探讨2008-2009年广东省手足口病非CAI6非EV71肠道病毒株的流行情况以及毒株型别.方法 从2008-2009年广东省手足口病粪便样本中采用RD细胞和HEp-2细胞分离病毒毒株,待出现细胞病变后收集上清采用RT-PCR进行鉴定.非CA16非EV71毒株再进行VP1测序分析,序列通过BLAST程序鉴定型别,用MEGA4.0软件进行基因进化分析.结果 共分离到22株非CA16非EV71毒株,通过BLAST程序鉴定犁别.2008年9株非CA16、非EV71的毒株有CA2型、CA4、CB3型;2009年13株有EV80、E13、E30、CB5、E24、PV1、CA10、CA6和CA2.各毒株间同源性低,各毒株分别归属CoxA、CoxB、埃可肠道病毒、新型肠道病毒和脊灰病毒组.结论 广东省2008-2009年两年来,手足口病除了CA16和EV71占主导地位外,并不存在其他的优势株,其他型肠道病毒分布比较广,既有CoxA组病毒、CoxB组,也有E13、E24、E30、新型病毒EV80和脊髓灰质炎病毒PV1,儿组病毒伴随流行.