小分子干扰RNA抑制黏着斑激酶基因对子宫内膜癌细胞生物学特征的影响

目的 探讨小分子干扰RNA(small interference RNA,siRNA)抑制黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)基因对子宫内膜癌细胞生物学特征的影响。方法 培养人子宫内膜癌HEC-1A细胞,分为siRNA-FAK组、siRNA-阴性对照组和空白对照组,实时荧光定量PCR检测各组细胞中FAK基因表达,细胞增殖能力、迁移和侵袭能力检测分别采用MTT法和Transwell法,蛋白质印迹法(Western blot)检测各组细胞中FAK、磷酸肌醇3激酶(phosphoinositol 3 kinase,PI3K)、磷酸化-Akt(phosphorylate-Akt,p-Akt)、磷酸化-哺乳动物雷帕霉素(phosphorylation-mammalian rapamycin,p-mTOR)蛋白表达。结果 siRNA-FAK组细胞中FAK mRNA和蛋白相对表达量分别为(1.31±0.15)、(0.26±0.08),均低于siRNA-阴性对照组[(2.06±0.18)、(0.62±0.11)]和空白对照组[(2.11±0.20)、(0.64±0.13)],差异有统计学意义(P<0.05);siRNA-FAK组24 h、48 h、72 h、96 h时细胞吸光度A值均低于siRNA-阴性对照组和空白对照组,均差异有统计学意义(P<0.05);与siRNA-阴性对照组和空白对照组比较,siRNA-FAK组迁移细胞数和侵袭细胞数均降低,siRNA-FAK组细胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达相对表达量均降低,而Akt和mTOR蛋白相对表达量均升高,均差异有统计学意义(P<0.05)。结论 沉默FAK基因表达可抑制HEC-1A细胞增殖、迁移及侵袭能力,可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号有关。     

高镁对体外培养原代神经干细胞分化命运的影响及其机制

目的 探索高镁对神经发生过程中神经干细胞分化命运的影响及其潜在机制.方法 从C57/BL6胎鼠大脑中分离神经干细胞,通过添加硫酸镁(MgSO4)调节培养基镁离子浓度并诱导分化,第6天通过免疫细胞化学荧光染色观察成熟神经元标记物β-Ⅲ tubulin(Tuj 1)和胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的阳性细胞比例,Western blot检测ERK1/2表达,qPCR检测Tuj1、GFAP的mRNA水平.结果 高镁组(0.8 mM和1.0 mM)相比于对照组(0.6 mM),Tuj1阳性细胞的比例增加,GFAP阳性细胞比例减少,Tuj1表达上调,GFAP表达下调,pERK/ERK上调,差异具有统计学意义(P＜0.05),高镁组添加ERK抑制剂PD0325901后,以上指标与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 高镁可促进神经干细胞向神经元分化,抑制其向神经胶质细胞分化,其作用可能与ERK1/2的激活有关.     

分子嵌合MHC-Ⅰ基因对小鼠DC反应的研究

目的:构建分子嵌合主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ基因小鼠骨髓造血干细胞,并探讨其诱导脾脏T细胞对异基因小鼠树突状细胞(DC)反应的机制。方法:密度梯度法分离培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞。构建携带C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因慢病毒载体(病毒感染组),携带无意义基因慢病毒载体(阴性对照组)。分别感染BALB/c小鼠骨髓造血干细胞,构建分子嵌合细胞。分别取病毒感染组、阴性对照组及未加入病毒的空白对照组造血干细胞输注BALB/c小鼠后7d,获取脾脏T淋巴细胞,分别与C57BL/6小鼠DC进行混合淋巴细胞培养,测定刺激指数。结果:成功体外分选及培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞。病毒感染组C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ蛋白表达率可达98.17%。单向混合淋巴细胞培养结果显示,C57BL/6小鼠DC对输注病毒感染组细胞后BALB/c小鼠脾脏T细胞刺激指数明显降低(P<0.01)。结论:输注分子嵌合MHC-Ⅰ基因造血干细胞后,小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠DC反应明显减低。     

巨细胞病毒IE2的红色靶基因与绿色荧光-慢病毒系统的建立及其对人神经干细胞的感染

目的 RNA干扰技术沉默连接红色荧光蛋白mCherry与靶基因巨细胞病毒IE2的表达,并初步研究慢病毒感染神经干细胞的可能性。方法以人巨细胞病毒IE2 mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒质粒UTG作为载体,构建靶向巨细胞病毒IE2的shRNA表达质粒,构建携带IE2的mCherry红色荧光蛋白的质粒作为验证shRNA有效性的靶点,并转染293FT细胞。通过红色荧光的表达及RT-PCR和Western Blot确定最佳沉默IE2序列后,将有效的UTG-IE2质粒与辅助质粒共转染293FT细胞,获取高滴度慢病毒。应用慢病毒感染人神经干细胞,观察神经干细胞被慢病毒感染的情况并检测神经干细胞的绿色荧光表达情况。结果成功构建IE2-shRNA慢病毒载体UTG-shRNA-IE2,RT-PCR及Western Blot结果显示慢病毒感染的293FT细胞IE2 mRNA及蛋白表达相对于对照组显著降低。构建的慢病毒可以成功感染神经干细胞。结论红色靶基因-绿色慢病毒系统具有简便的筛选性能;UTG慢病毒对神经干细胞具有较高感染效率,可实现慢病毒介导的RNA干扰在神经干细胞内的有效表达,并为相关研究提供技术支持。     

猫爪草总皂苷通过下调信号素4D表达抑制人非小细胞肺癌A549细胞增殖

目的探讨猫爪草总皂苷(TSRT)对人非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响,并初步探讨其作用机制。方法构建信号素4D(Sema4D)过表达慢病毒载体和阴性对照载体,以感染复数(MOI)10感染A549细胞,用嘌呤霉素1.0 mg·L^-1筛选得到稳定转染细胞株。设感染Sema4D过表达慢病毒的A549细胞为过表达(LV-Sema4D)组,感染Sema4D过表达慢病毒的A549细胞加入TSRT 100 mg·L^-1干预为给药(LV-Sema4D+TSRT)组,感染阴性对照病毒的A549细胞为阴性对照组(LV-NC组),未感染慢病毒的A549细胞为细胞对照组。实时细胞分析系统连续记录96 h细胞指数(CI),荧光定量PCR检测48 h后Sema4D、丛状蛋白B1(PlxnB1)和酪氨酸蛋白激酶(c-Met)mRNA表达;Western印迹法检测Sema4D,PlxnB1和c-Met蛋白表达;免疫荧光法检测Sema4D在细胞中的定位及表达水平。结果 LV-NC组CI值与细胞对照组相比无显著差异;与LV-NC组相比,LV-Sema4D组72 h CI值升高...     

The Research on Chimeric MHC-Ⅰ Gene Responsing to Allogeneic Dendritic Cells

目的:构建分子嵌合主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ基因小鼠骨髓造血干细胞,并探讨其诱导脾脏T细胞对异基因小鼠树突状细胞(DC)反应的机制.方法:密度梯度法分离培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞.构建携带C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因慢病毒载体(病毒感染组),携带无意义基因慢病毒载体(阴性对照组).分别感染BALB/c 小鼠骨髓造血干细胞,构建分子嵌合细胞.分别取病毒感染组、阴性对照组及未加入病毒的空白对照组造血干细胞输注BALB/c小鼠后7d,获取脾脏T淋巴细胞,分别与C57BL/6小鼠DC进行混合淋巴细胞培养,测定刺激指数.结果:成功体外分选及培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞.病毒感染组C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ蛋白表达率可达98.17％.单向混合淋巴细胞培养结果显示,C57BL/6小鼠DC对输注病毒感染组细胞后BALB/c小鼠脾脏T细胞刺激指数明显降低(P＜0.01).结论:输注分子嵌合MHC-Ⅰ基因造血干细胞后,小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠DC反应明显减低.     

微小RNA-150 靶向c-Myb 表达对T 淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖的影响

目的探讨微小RNA-150(miR-150)靶向c-Myb表达对人T淋巴细胞白血病(T-LL)Jurkat细胞增殖的影响。方法体外培养人Jurkat细胞,分为空白对照组(不转染)、阴性对照组(转染negative control-miR-150)和miR-150过表达组(转染hsamiR-150 mimic)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测Jurkat细胞中miR-150 及c-Myb 表达;人胆囊收缩素/缩胆囊素八肽(CCK-8)法检测Jurkat细胞增殖;流式细胞仪检测各组Jurkat细胞凋亡情况;双荧光素酶报告基因实验检测miR-150和c-Myb的靶向关系;蛋白质印迹法(Western blotting)检测各组Jurkat细胞中c-Myb、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达情况。结果空白对照组与阴性对照组Jurkat细胞中miR-150表达水平、c-Myb mRNA及蛋白表达水平、OD值、细胞凋亡率、及PCNA、Bax蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05);与空白对照组相比,miR-150过表达组Jurkat细胞中miR-150表达水平［(1.42±0.14)比(1.03±0.09)］、凋亡率［(20.79±1.15)%比(8.76±0.74)%］、Bax蛋白表达水平［(0.65±0.18)比(0.42±0.13)］显著升高(P<0.05),c-Myb mRNA［(0.66±0.14)比(0.98±0.09)］及蛋白表达水平［(0.37±0.06)比(0.64±0.12)］、OD值［(0.25±0.06)比(0.46±0.09)］、PCNA蛋白表达水平［(0.33±0.07)比(0.56±0.11)］显著降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示,c-Myb是miR-150的靶基因。结论miR-150靶向c-Myb表达抑制Jurkat细胞增殖并诱导其凋亡。     

DEAD?box解螺旋酶 46基因沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的分析短发夹 RNA(shRNA)介导 DEAD?box解螺旋酶 46(DDX46)基因沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量逆转录 PCR(RT?qPCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)测定人正常乳腺上皮细胞系和乳腺癌细胞系中 DDX46表达差异。以慢病毒介导的 shRNA敲低乳腺癌 SK?BR?3细胞中 DDX46的表达，实验分为空白对照组、阴性对照组和 sh?DDX46组。 RT?qPCR检测各组细胞 DDX46 mRNA的表达水平，蛋白质印迹法检测 DDX46蛋白和凋亡相关蛋白的表达水平，克隆形成和四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞生长增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 DDX46 mRNA在各乳腺癌细胞系中的表达量均高于正常乳腺上皮细胞(P＜0.05)。 sh?DDX46组细胞 DDX46 mRAN和蛋白表达水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05)。 sh?DDX46组的细胞生长增殖能力明显低于两对照组(P＜0.05)。空白对照组、阴性对照组和 sh?DDX46组 SK?BR?3细胞凋亡率分别为(4.21±1.65)%、(5.36±1.23)%和(10.21±2.39)%，与空白对照组和阴性对照组相比， sh?DDX46组 SK?BR?3细胞凋亡率明显增加(P＝0.007；P＝0.016)。沉默 DDX46后凋亡通路蛋白 B细胞淋巴瘤 /白血病 ?2(Bcl?2)的表达量明显降低(P＜0.05)Bcl?2相关 X蛋白(Bax)和半胱氨酸蛋白酶 ?3剪切体(cleaved Caspase?3)表达明显增高(P＜0.05)。结论 DDX46在乳腺癌中高表达，沉默 DDX46基因能够抑制乳腺癌细胞增殖并促进凋亡，凋亡信号细胞，通路可能是其作用机制之一。     

慢病毒介导的siRNA沉默结肠癌HCT116细胞中Slug基因表达的影响

目的探讨慢病毒载体介导RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体在结肠癌HCT116细胞中的沉默效应。方法构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及Slug siRNA三组,应用qRT-PRC和Western blot方法分别从基因和蛋白水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果。结果转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05)。结论 Slug siRNA能明显沉默靶基因Slug的表达,并且可能成为潜在治疗肿瘤的新靶点。     

携带LMO3基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的构建单纯LIM蛋白3(LMO3)的逆转录表达载体,并观察其在NIH/3T3细胞中的表达情况。方法重组载体pLXSN-LMO3经酶切及测序鉴定后,脂质体法转染到pA317包装细胞,G418筛选稳定的病毒产生细胞株。重组逆转录病毒体外感染NIH/3T3,并对其进行病毒滴度检测,NIH/3T3细胞分为3组:以pLXSN-LMO3转染为实验组,以pLXSN转染为阴性对照组,正常细胞为空白对照组。采用免疫荧光组化染色和蛋白印迹(Western blot)法鉴定NIH/3T3细胞中LMO3的表达。结果重组逆转录病毒载体pLXSN-LMO3经酶切及测序鉴定构建正确,其病毒滴度平均可达4.04×106cfu/ml,各组NIH/3T3细胞免疫荧光组化染色及Western blot检测均有LMO3蛋白表达,其中实验组高表达LMO3,与阴性对照组、空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了携带LMO3基因逆转录病毒载体,并能在NIH/3T3细胞中高表达LMO3蛋白,为下一步开展基因治疗奠定了基础。     

神经胶质瘤细胞株H MGA1基因沉默对吉西他滨化疗敏感性的影响

目的探讨神经胶质瘤细胞株SHG-44高迁移率族蛋白A1(HMGA1)基因表达下调后对吉西他滨化疗敏感性的影响。方法用HMGA1 siRNA慢病毒载体及阴性siRNA慢病毒载体分别转染SHG-44细胞。稳定转染HMGA1 siRNA的细胞为阳性组、稳定转染不含HMGA1的细胞为阴性组,未转染的细胞为对照组。RT-PCR和Western blot检测HMGA1 mRNA和蛋白的表达,MTT法和克隆集落形成实验检测吉西他滨对细胞生长、增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果阳性组HMGA1 mRNA和蛋白的表达水平明显低于阴性组和对照组(P<0.05)。经吉西他滨处理后,MTT表明阳性组细胞生长抑制率显著高于阴性组,阳性组IC50为(0.279±0.013)μg/ml,明显低于阴性组的(0.746±0.020)μg/ml(P<0.05)。克隆形成实验表明阳性组克隆形成率显著低于阴性组(P<0.05),而细胞凋亡率显著高于阴性组(P<0.05)。结论神经胶质瘤细胞SHG-44中HMGA1基因沉默后,显著增强SHG-44细胞对吉西他滨的化疗敏感性。     

Neuritin基因高表达系统构建及转染大鼠雪旺细胞的鉴定

目的构建neuritin基因的高表达系统,观察其转染雪旺细胞后neuritin的表达。方法根据大鼠neuritin mRNA序列体外合成编码序列(CDS区),构建到pGH载体,与酶切后的GV208-绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体片段进行连接、转化、酶切及测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆,转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞。将雪旺细胞分为三组:空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)、高表达组(C组)。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测细胞neuritin的表达。结果大鼠neuritin正确插入慢病毒载体,C组neuritin mRNA水平显著高于A组、B组(P<0.01)。检测到neuritin蛋白与GFP的融合蛋白。结论成功构建neuritin慢病毒高表达系统;其转染的雪旺细胞neuritin表达升高。     

微小RNA-503在急性脑梗死病人血清中的表达及对胰岛素样生长因子1受体信号通路的调控

目的探究微小 RNA?503(miRNA?503)在脑梗死病人血清中的表达及对胰岛素样生长因子 1受体( IGF?1R)信号通路的调控。方法选择 2017年 9月至 2019年 4月南充市中心医院确诊急性脑梗死病人 92例作为观察组及同期体检健康者 92例作为对照组,采用实时荧光定量聚合酶链式反应( qPCR)方法对比两组病人血清中 miRNA?503的表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两组血清样本中 IGF?1R的表达水平。 qPCR方法检测人脑正常胶质细胞 HEB及胶质瘤细胞 U87中 miRNA?503的表达水平,蛋白质免疫印迹( WB)检测两组细胞中 IGF?1R的表达水平。将 U87细胞分为 3组:不做处理的空白对照组,转染 miRNA?503模拟物的 miRNA?503模拟组及转染阴性对照物的阴性对照组,流式细胞术检测 3组细胞的凋亡情况; qPCR方法检测 3组细胞中 miRNA?503的表达水平; WB检测 3组细胞中 IGF?1R、p?Akt、Bcl?xl、Bax、c?Myc、p?PI3K的蛋白表达水平。结果 miRNA?503在观察组血清及 U87细胞中的表达量( 0.37±0.09)显著低于对照组( 1.24±0.31)和 HEB细胞( 1.58±0.28)(P＜ 0.05); IGF?1R在观察组血清( 3.67±0.41)ng/mL及 U87细胞中的表达量( 0.93±0.11)ng/mL显著高于对照组( 1.98±0.20)ng/mL和 HEB细胞( 0.57±0.06)ng/mL(P＜0.05)。空白对照组细胞、阴性对照组细胞及 miRNA?503模拟组细胞增殖差异有统计学意义( P＜0.05)与空白对照组相比, miRNA?503模拟组细胞增殖率显著降低( P＜0.05)。 miRNA?503、c?Myc、Bax在 miRNA? 503模拟组中达水平显著高于空白对照组( P＜0.05); IGF?1R、p?Akt、Bcl?xl、p?PI3K在 miRNA?503模拟组中的表达水平显著低于空白对照组( P＜0.05)。结论在急性脑梗死病人血清中, miRNA?503呈现高水平表达,而 IGF?1R则呈现低水平表达。 miRNA?503在 U87细胞中的过表达能够抑制细胞增殖,可能是通过抑制 IGF?1R表达,进而调节 PI3K/Akt通路中相关蛋白表达,从而抑制了 U87的增殖。     

DAB2IP过表达对人胃癌细胞SGC7901增殖、迁移及对E-cad-herin、Snail、Twist表达的影响

摘要：目的:研究失活蛋白-2相互作用蛋白基因(DAB2IP)过表达对人胃癌细胞SGC7901增殖、迁移及对上皮间质转化(EMT)相关上皮细胞-钙黏蛋白基因(E-cadherin)、Snail、Twist蛋白表达的影响。方法:采用慢病毒介导DAB2IP过表达转染并筛选稳定人胃癌细胞SGC7901细胞株(过表达组),另设慢病组对照液转染的人胃癌细胞SGC7901作为慢病毒对照组,无转染人胃癌细胞SGC7901为空白对照组,采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测各组人胃癌细胞SGC7901 DAB2IP基因表达水平,采用噻唑蓝法(MTT)及平板克隆形成试验检测过表达DAB2IP对人胃癌细胞SGC7901增殖的影响采用细胞划痕试验检测过表达DAB2IP对人胃癌细胞SGC7901迁移的影响,采用免疫印迹(Western Blot,WB)法检测过表达DAB2IP对人胃癌细胞SGC7901中EMT相关蛋白表达水平。结果:同一时间及不同时间,空白对照组和慢病毒对照组人胃癌细胞SGC7901中DAB2IP mRNA表达水平、细胞增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组和慢病毒对照组比较,24,48,72 h过表达组人胃癌细胞SGC7901中DAB2IP mRNA表达水平、细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.05)。与24 h比较,48和72 h过表达组人胃癌细胞SGC7901中DAB2IP mRNA表达水平、细胞增值抑制率显著升高(P<0.05),与48 h比较,72 h过表达组人胃癌细胞SGC7901中DAB2IP mRNA表达水平、细胞增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。提示48 h过表达效果最佳,可用于下游试验。空白对照组和慢病毒对照组平板克隆形成率、细胞迁移距离、E-cadherin、Snail、Twist蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组和慢病毒对照组比较,过表达组人胃癌细胞SGC7901平板克隆形成率、细胞迁移距离、Snail、Twist蛋白水平显著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白水平显著增加(P<0.05)。结论:DAB2IP过表达可抑制人胃癌细胞SGC7901增殖、迁移,可能与上调E-cadherin蛋白表达,下调Snail、Twist蛋白表达有关。     

ZHX3 基因沉默对BMSCs 中成骨相关因子表达的影响

目的探讨锌指蛋白和同源框3（ZHX3）基因沉默对骨髓间充质干细胞（BMSCs）中smad3、smad4、RUNX2 表达的影响。方法构建ZHX3 低表达慢病毒载体并转染大鼠BMSCs（ZHX3 沉默组）,同时设空载病毒转染BMSCs （载体对照组）及不做任何处理的BMSCs（空白对照组）。荧光显微镜下测定细胞转染率并采用免疫印迹技术鉴定转染是否成功;采用免疫荧光化学和免疫印迹技术定性定量检测ZHX3 沉默时smad3、smad4、RUNX2 表达情况。结果（1）复苏培养的细胞具有BMSCs 表型。（2）转染后,ZHX3 沉默组和载体对照组均表达绿色荧光,空白对照组不表达荧光,且沉默组ZHX3 基因表达显著低于载体对照组。（3）免疫荧光结果显示,smad3、smad4 的阳性表达位于细胞核和细胞质,RUNX2 的阳性表达主要定位于细胞核。3 组细胞均可见阳性表达细胞,且空白对照组与载体对照组之间荧光强度未见显著差异,但ZHX3 基因沉默组的荧光强度显著低于2 个对照组。（4）免疫印迹检测smad3、 smad4、RUNX2 的条带于空白对照组和载体对照组中无显著差异,但均显著高于ZHX3 沉默组（P＜0.05）。结论 ZHX3 基因沉默后BMSCs 体外成骨能力延迟,可能通过下调smad3、smad4、RUNX2 来发挥作用。     

TMPRSS4基因沉默对甲状腺滤泡状癌细胞侵袭能力的影响

目的 观察TMPRSS4基因沉默在甲状腺癌WRO细胞体外侵袭能力的影响.方法 构建慢病毒载体转染甲状腺癌WRO细胞,分为三组:空白对照组(正常WRO细胞),NC-ShRNA阴性对照组,TMPRSS4-ShRNA组.使用Western Blot方法检测转染后细胞的TMPRSS4表达,确定转染效果.采用Transwell法观察细胞体外侵袭力的改变.结果 Western Blot结果显示转染组TMPRSS4蛋白表达显著低于阴性转染组及空白对照组.侵袭实验结果提示TMPRSS4基因沉默组相比于空白对照组和阴性对照组侵袭穿膜细胞数显著减少(P＜ 0.05).结论 下调TMPRSS4表达可有效减少甲状腺癌WRO细胞的侵袭能力.     

大鼠雪旺细胞Neuritin基因shRNA表达载体构建及其体外抑制效应

目的构建针对大鼠neuritin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并研究该载体对neuritin基因表达的沉默效应及雪旺细胞生存的影响。方法设计并合成neuritin靶向siRNA序列,连接pGCSIL-GFP慢病毒表达载体后,将neuritin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞,分为空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)和干扰组(C组)。RT-qPCR、Western blot及Annexin V/PI方法分别检测细胞neuritinmRNA、蛋白表达及细胞凋亡情况。结果与A、B组相比,C组雪旺细胞neuritin mRNA和蛋白表达水平降低,而细胞凋亡明显增加(P<0.01或P<0.05)。结论成功构建neuritin基因shRNA慢病毒表达载体。其转染的雪旺细胞neuritin基因表达受抑制,并导致细胞凋亡增加。     

微 RNA?346对食管癌细胞生物学行为影响的分子机制研究

目的观察微 RNA?346(miR?346)对食管癌细胞生物学行为的影响,并探讨其分子机制。方法通过实时荧光定量 PCR(qPCR)检测食管癌组织和细胞株 miR?346的表达量。以表达量最低的细胞为感染对象,分别感染 miR?346慢病毒(实验组)和空载慢病毒(对照组)。 MTT法和集落形成实验分别检测细胞活力和增殖能力,流式细胞术检测凋亡率。 qPCR和蛋白质印迹法检测细胞中 Yes相关蛋白 1(YAP1)及细胞周期蛋白 E(Cyclin E)、细胞凋亡抑制蛋白 1(cIAPl)表达水平。结果食管癌组织和细胞株中 miR?346表达量均明显下降( P＜0.01)TE?1细胞下降最明显。实验组感染 miR?346的细胞活力(实验组 0.93±0.06,对照组1.37±0.06)和增殖能力(对照组 232.3±3740,实验组 82.55±9.66)降低( P＜0.01),细胞凋亡率升高(实验组 8.26%±0.80%,对照组 0.94%±0.28,P＜0.01)YAP1、Cyclin E和 cIAPl蛋白表达显著下调。结论 miR?346在食管癌组织和细胞中低表达,可明显抑制 TE?1细胞的增殖和诱,导凋亡,其作用机制可能是靶向干扰 YAP1基因的表达。     

新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因的慢病毒载体的构建与表达

目的采用改良的Tet-On四环素可调控系统,构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因的慢病毒载体,观察四环素类抗生素对GDNF、TH基因的表达调控。方法 PCR方法获得大鼠GD-NF、TH基因,将其克隆至改良的Tet-On四环素调控慢病毒载体。通过瞬间转染法包装出病毒上清,用实时荧光定量PCR鉴定滴度。将包装的慢病毒-TH-GDNF与rtTA2S-M2以相同感染复数(MOI)感染293T细胞,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测强力霉素对GDNF、TH基因mRNA和蛋白的表达调控。结果实验成功构建重组慢病毒载体质粒;生产的病毒浓缩后滴度为2.1×1011TU·L-1;感染293T细胞实时荧光定量PCR和免疫印迹显示强力霉素阳性组可见GDNF、TH基因mRNA表达明显升高(P<0.01)和蛋白条带,阴性组未见。结论在改良的Tet-On调控系统的慢病毒载体上成功克隆大鼠GDNF、TH双基因,其表达受四环素类抗生素调控并未见背景效应。     

靶向survivin基因的小干扰RNA对食管癌细胞Eca-109 化疗敏感性的影响

目的 利用RNAi (RNA interference, RNAi) 技术抑制食管癌Eca-109细胞survivin基因表达,观察survivin基因沉默后对Eca-109细胞化疗敏感性的影响。方法 构建靶向survivin基因特定序列的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)真核表达载体并转染Eca-109细胞,筛选得到稳定转染的survivin干扰组细胞Eca-109 /si-survivin,同时设转染无关干扰质粒的Eca-109细胞为阴性对照组,未转染的Eca-109细胞为空白对照组;通过Western Blot法检测干扰前后survivin基因沉默抑制效果;随后将各组细胞与不同浓度的氟尿嘧啶(5-Fu)作用,MTT法检测各组细胞对5-Fu的半数抑制浓度(IC₅₀),流式细胞仪分析各组细胞的凋亡率。结果 干扰组Eca-109 /si-survivin细胞survivin蛋白表达水平(18.75±3.12)较阴性对照组Eca-109 /si-control(44.17±3.15)及空白对照组Eca-109 (46.20±2.62)明显下调(P<0.05);联合应用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干扰组细胞IC₅₀为(18.75±1.53)mg·L-1,显著低于空白对照组(39.65±1.75)mg·L-1和阴性对照组(38.95±1.34)mg·L-1,差异具有统计学意义(P<0.05);联合应用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干扰组细胞凋亡率为(37.35±1.52)%,明显高于空白对照组(11.26±1.21)%和阴性对照组(12.34±1.32)%,差异具有显著性(P<0. 05)。 结论 靶向survivin的siRNA能特异性沉默survivin基因表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,并增强人食管癌Eca-109细胞对5-Fu的化疗敏感性。