达托霉素高产菌株选育及发酵条件优化

目的 通过对达托霉素产生菌进行诱变选育,并对其发酵条件优化,以提高其达托霉素发酵水平,降低生产成本。方法 以玫瑰孢链霉菌(DT-9#F2)为出发菌株,分别采用紫外诱变、微波诱变、LiCl诱变及复合诱变并结合链霉素抗性筛选进行菌株选育,同时,对其发酵培养基中氮源、碳源及生长因子进行优化,以进一步提高其发酵产量。结果 得到一株达托霉素高产突变株DT-37,其摇瓶发酵产量达到12.2mg/L,较出发菌株提高20.79%;优化后的发酵培养基为：酵母粉(YP300)1.65%、FeSO4 0.043%、葡萄糖1.50%、玉米淀粉7.20%、糖蜜0.72%,VB12 1.50μg/mL、硫辛酸5.00μg/mL。其摇瓶发酵产量达到30.56mg/L,较初始培养基提高了297.92%。经100L发酵罐上放大验证,达托霉素的产量达到了2872mg/L,较优化前提高了14.88%。结论     

达托霉素产生菌前体物耐受选育及其流加补料发酵

目的 通过对达托霉素产生菌进行诱变选育,以及前体物补料发酵方式提高达托霉素的产量。方法 采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)技术对玫瑰孢链霉菌进行诱变,以癸酸铵和甘氨酸耐受作为选择压力进行菌株筛选,在摇瓶和100L发酵罐上进行癸酸铵流加补料试验确定最佳的发酵工艺。结果 经诱变选育获得1株突变株FIM-D1568摇瓶效价达到380mg/L,发酵单位较出发菌株提高了35.7%;通过优化100L发酵罐流加补料癸酸铵溶液工艺,使达托霉素发酵效价达到2276mg/L。结论 以ARTP为诱变源,甘氨酸及癸酸铵耐受性为选择性压力,可以快速筛选获得达托霉素高产菌;高产突变菌株在流加补料发酵工艺上优良性状得以发挥,发酵效价大幅提高。     

组合抗性筛选法选育达托霉素高产菌株

目的利用组合抗性筛选法选育达托霉素高产菌株。方法以玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus ATCC 11379)为出发菌株,通过在不同浓度梯度的达托霉素和链霉素复合抗性平板上进行抗性筛选。结果筛选到一株高产达托霉素的突变株D1000-S3-2,经摇瓶发酵验证达托霉素发酵单位可达59mg/L,比出发菌株提高了63.8%。结论实验证明组合抗性筛选是一种简单高效筛选方法。     

埃坡霉素高产菌株的选育及发酵培养基的优化

以埃坡霉素产生菌粘细菌纤维堆囊菌为出发菌株,经亚硝基胍诱变处理后,在含有前体丙酸盐的平板中筛选抗性突变株,得到一株高产突变株N-19,埃坡霉素产量为18.5 mg/L,比出发菌株提高了69.7.通过优化发酵培养基的碳、氮源组成,埃坡霉素产量达36.1 mg/L,此时埃坡霉素B和埃坡霉素A的比值为0.4:在摇瓶发酵过程中补加前体丙酸盐,埃坡霉素B和埃坡霉素A的比值增至2.1.     

达托霉素生产菌(ATCC31568)的紫外诱变和抗生素抗性筛选

目的 建立一种提高达托霉素生产水平的方法.方法 以玫瑰孢链霉菌(ATCC31568)为出发菌株,利用紫外诱变结合抗生素抗性筛选以提升达托霉素生产水平.结果 通过对致死率和正突变率的考察,确定紫外诱变时间为45s,利福平和庆大霉素的合适筛选浓度分别为1.4μg/mL、1.0μg/mL,得到的突变株经摇瓶发酵后,采用高效液相色谱仪(HPLC)对最终发酵液进行检测.筛选到的突变株Ge-27最高产量达到79.44 mg/L,比原始菌株提高了42.2％.结论 采用紫外诱变结合抗生素抗性筛选得到了达托霉素合成水平提高的菌株.     

维吉尼亚链霉菌物理诱变及外源添加氯化镧对VGM产量的影响

目的 利用物理诱变结合链霉素抗性筛选维吉尼亚霉素(VGM)高产菌株维吉尼亚链霉菌,并考察外源添加稀土元素氯化镧对维吉尼亚链霉菌发酵的影响。方法 一方面,以链霉素为筛选剂建立孢子致死突变标志的微波及紫外诱变两种筛选模型,采用管碟法获得抑菌圈直径较大的作为初筛菌株,再通过摇瓶复筛进一步确定高产菌株。另一方面,在发酵培养基中外源添加3~30mg/L的氯化镧,考查其对链霉菌合成VGM的影响。结果 比较两种筛选模型,基于链霉素的微波诱变效果较好,正突变率高达32.83%;并获得一株高产菌株MW 178(146.72±11.80)μg/mL,较出发菌株(21.24±1.34)μg/mL提高了约6倍。在发酵初始时,外源添加10mg/L氯化镧,VGM的产量由146.72μg/mL提高到180.01μg/mL,提高了约22.69%。结论 采用微波诱变结合链霉素抗性筛选的方法可以获得VGM高产突变株;在发酵初始时,外源添加适量氯化镧可以显著提高VGM产量。     

用均匀设计优化达托霉素发酵培养基

目的:优化达托霉素的发酵培养基,提高达托霉素的发酵单位.方法:通过单因素试验设计考察不同碳源、氮源对达托霉素发酵单位的影响,筛选出适用于达托霉素发酵的碳源和氮源;再采用均匀设计对培养基中碳源、氮源的配比进行优化.结果和结论:在备筛选的碳源中,最适用于达托霉素发酵的是糊精,最佳用量为20g/L;最优的氮源是黄豆粉和蛋白粉合用,用量分别为30 g/L和5 g/L.优化后的发酵培养基可提高达托霉素发酵单位30%以上.     

通过获得链霉素抗性基因(str)突变株筛选梅岭霉素高产菌株

本文通过链霉素对梅岭霉素（meilingmycin）产生菌南昌链霉菌NS－41－80菌株孢子致死浓度的测定，采用诱变剂EMS四种不同诱变剂量对菌株的孢子进行诱变处理，诱变处理的孢子涂布在含链霉素致死浓度的高氏平板上，获得了大量的链霉素抗性基因（str）突变株。然后从链霉素抗性基因突变株进一步筛选到梅岭霉素高产菌株80－5．11－221，在摇瓶条件下，只产梅岭霉素不产南昌霉素，梅岭霉素活性效价达1500μg/ml，比出发菌株NS－41－80的摇瓶发酵效价855μg/ml提高了77．9％，该菌株连续传代六代进行摇瓶发酵，其F2代和F3代梅岭霉素发酵效价稳定，F4代至F6代随着传代数增加，其梅岭霉素发酵效价急速下降。通过EMS诱变剂量分别与抗药性突变率和链霉素抗性基因突变株产梅岭霉素产量的产势统计分析表明，菌株抗药性突变与产抗生素突变密切相关，产抗生素突变的EMS诱变剂量高于链霉素抗性基因突变诱变剂量。在0．03mol/L的EMS剂量作用下，菌株致死率为99．43％，而抗药性突变率为0．0440％，建立了梅岭霉素产生菌链霉素抗性基因突变筛选方法，为南昌链霉菌高产菌种选育研究作了有益的尝试，并有助于其它链霉菌属的抗生素产生菌育种研究。     

多杀菌素产生菌复合诱变选育及发酵培养基优化

目的 利用诱变结合抗性筛选方法选育多杀菌素高产菌株,并通过发酵培养基优化进一步提高多杀菌素产量。方法 分别确定链霉素、安普霉素和鼠李糖3种抗性的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),然后以S.s1-4为出发菌株,通过紫外(UV)结合链霉素、安普霉素、鼠李糖抗性因子诱变选育,在此基础上利用亚硝基胍(NTG)结合上述抗性因子诱变选育,并利用响应面实验设计对发酵培养基中葡萄糖、糊精、棉籽蛋白3种成分进行优化。结果 出发菌株经过紫外照射30s,涂布于抗性平板上,筛选得到S.s2-21,S.s2-21再用NTG处理30min,涂布于抗性平板上,最终获得1株遗传性状稳定的菌株S.s3-37,产量为78.26mg/L,提高了45.71%;发酵培养基优化后,其产量达83.00mg/L。结论 利用紫外和NTG结合抗性复合诱变选育获得多杀菌素高产菌株是有效的,通过发酵培养基优化,其产量较出发菌株提高了54.55%,获得良好的效果。     

A82846B生产菌株选育及发酵培养基的优化

以荒漠拟孢囊菌SIPI-HT47为出发菌株,发酵合成奥利万星中间体A82846B。应用紫外和NTG诱变,结合自身抗性及氯化盐耐受筛选,获得1株高产突变株,命名为FH-32-322,发酵效价较出发菌株提高172.5%。通过PB试验、爬坡试验和响应面试验设计优化发酵培养基组成,确定最佳摇瓶发酵配方。在优化后的发酵培养基上,突变株FH-32-322摇瓶发酵效价达到1 013 mg/L,较原工艺提高85.9%。     

达托霉素发酵培养基的响应面法优化

采用Plackett-Bumaan设计、最陡爬坡试验与响应面设计相结合的方法优化达托霉素发酵培养基组成,利用Design Expert 7.0软件设计试验并分析数据.结果表明,培养基中的糊精、酵母粉、酪蛋白水解物是影响达托霉素产量的主要因素.优化后的培养基组成/g·L~(-1)为:糊精10.6,酵母粉1.6,酪蛋白水解物1.3,硫酸钾8,L-门冬氨酸1.5;pH 6.5.在此条件下,达托霉素产量为37.16 me,/L.进一步优化前体癸酸的添加量,最终达托霉素产量达46.54 mg/L.     

培养基优化设计提升多拉菌素生物发酵水平

运用响应面法优化了多拉菌素生产菌的发酵培养基。首先通过单因素实验发现正效应因子;接着采用Plackett-Burman(P-B)设计确定了黄豆饼粉、麦芽糊精和MgSO4是影响多拉菌素产量的显著因素;然后利用最陡爬坡试验分别找到3个因素的合理浓度范围;并进一步利用中心组合设计优化了黄豆饼粉、麦芽糊精和MgSO4的最佳浓度配比。筛选并优化得到了最适的培养基浓度为黄豆饼粉17.30g/L,麦芽糊精77.30g/L,MgSO4 1.50g/L,基于此,效价达到了589.43mg/L,验证实验结果与模型预测基本吻合,优化后的培养基工艺能够提升多拉菌素发酵单位20.37%。5L反应罐上发酵过程生理代谢参数变化表明：优化的培养基能够加促菌体的比生长速率,维持较高的氧消耗速率和产物合成速率,大幅度提升了多拉菌素的发酵生产效率。     

培养基优化设计提升多拉菌素生物发酵水平

运用响应面法优化了多拉菌素生产菌的发酵培养基。首先通过单因素实验发现正效应因子;接着采用Plackett-Burman(P-B)设计确定了黄豆饼粉、麦芽糊精和MgSO4是影响多拉菌素产量的显著因素;然后利用最陡爬坡试验分别找到3个因素的合理浓度范围;并进一步利用中心组合设计优化了黄豆饼粉、麦芽糊精和MgSO4的最佳浓度配比。筛选并优化得到了最适的培养基浓度为黄豆饼粉17.30g/L,麦芽糊精77.30g/L,MgSO4     

紫外分光光度法快速测定庆大霉素 C1a 含量在高通量筛选中的应用

目的 探索庆大霉素 C1a 含量的快速检测方法,实现诱变菌株的高通量筛选。方法 以紫外分光光度法作为检测庆 大霉素 C1a 含量的手段,对庆大霉素 C1a 单组分生产菌株进行 ARTP、LiCl、微波和 ARTP+LiCl 诱变,通过高通量筛选获得高产 菌株,并在 5L 发酵罐中对高产稳定性菌株进行验证。结果 紫外分光光度法和高效液相色谱法对发酵液中庆大霉素 C1a 含量进 行测定,最大相对误差为 3.98%;筛选获得了 10 株高产菌株,其中 AL324 菌株与出发菌株相比,摇瓶效价提高了 52%;通过稳 定性传代实验,获得了 4 株高产稳定性菌株。5L 发酵罐验证实验表明 AL324 与出发菌株相比效价提高了 81.3%。结论 紫外分 光光度法可以快速检测发酵液中庆大霉素 C1a 含量,该方法应用于高通量筛选中,获得了高产菌株,筛选结果表明 ARTP+LiCl 复合诱变方法的正突变率较高,是一种有效的庆大霉素 C1a 高产菌株诱变方式。     

响应面法优化替考拉宁发酵培养基及其扩大培养

目的 通过响应面法,优化替考拉宁发酵培养基,并对发酵工艺参数进行优化,来提高其发酵产量。方法 以游动放线菌TC19-3p-103为试验菌株,采用单因素试验确定发酵培养基考察因素的参考范围;利用最陡爬坡试验确定响应面试验的中心区域;利用Box-Behnken响应面法,确定了发酵培养基中的有机氮源最佳浓度组合;并对起始搅拌转速与通气量这两个发酵工艺参数进行单因素考察;在发酵过程中,采用流加技术控制碳源浓度。结果 经优化的发酵培养基,其摇瓶产量提高了31.6%;50L罐发酵工艺参数优化后,发酵水平达到8558 mg/L。结论 优化后的发酵工艺,显著提高了替考拉宁的产量,为其工业化生产奠定了基础。     

新型常压室温等离子体-紫外复合诱变选育埃莎霉素I高产菌株#br#

目的 通过对埃莎霉素Ⅰ产生菌WSJ-IA进行诱变选育研究,以期获得埃莎霉素Ⅰ高产菌株。方法 使用多功能等离子体诱变系统(multifunctional plasma mutagenesis system, MPMS)对出发菌株的孢子进行等离子体和紫外复合诱变,设定不同的诱变时间处理孢子悬液,通过致死率确定合适的诱变条件,利用突变株摇瓶发酵效价筛选出正突变菌株。结果 在MPMS射频功率为100W,处理距离5mm,气体流量12.5SLM,等离子体-紫外辐射时间为50s时,菌株致死率为96.08%。在此诱变条件下,以突变株的初筛效价为指标的突变率、正突变率分别达到63.96%和22.52%,复筛效价是出发菌株1.5倍以上的有5株,占复筛菌株的9%。最终筛选出一株发酵单位比出发菌株提高221%、埃莎霉素Ⅰ组分含量提高192%的正突变株IA-425。42L自动发酵罐发酵结果表明,该菌株埃莎霉素Ⅰ产量达到(2000±200)μg/mL左右。结论 新型等离子体复合紫外诱变方式,可有效提高菌株的埃莎霉素Ⅰ发酵产量和组分含量。这为埃莎霉素Ⅰ的大规模发酵和临床前研究奠定了良好基础。