5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:研究体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cells,MSCs) 经5-氮胞苷(5-aza) 诱导定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征?方法:SD大鼠股骨骨髓经密度梯度离心及贴壁分离培养传代MSCs,体外用5-aza定向诱导向心肌样细胞分化?相差显微镜观察心肌样细胞形态学变化?免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达?结果:密度梯度离心及贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖快?5-aza诱导后,部分细胞形态发生变化,有肌管样结构形成?随诱导后培养时间延长MSCs中cTnT?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达逐渐增强?结论:密度梯度离心及贴壁分离培养可获得大量纯度较高的骨髓间充质干细胞?经5-aza诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞?     

体内外诱导人脐血间充质干细胞向心肌细胞的定向分化

目的观察在体外5-氮胞苷诱导和体内心肌缺血微环境诱导下,人脐血间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向心肌细胞的定向分化。方法收集健康产妇脐血细胞,采用密度梯度离心结合差速贴壁的方法分离MSCs,传代培养至第三代,应用流式细胞术分析MSCs表面分子CD34、CD45、CD44和CD90的表达。体外应用5-氮胞苷（5-aza）诱导MSCs四周后,免疫荧光染色和RT-PCR分别检测MSCs心肌标志物cTnT（肌钙蛋白）和Connexin43（缝隙连接蛋白）的表达;体内将GFP标记的MSCs移植入心肌梗死大鼠模型心肌梗死周边区,移植后1周,取大鼠心脏行冰冻切片,免疫荧光染色检测MSCs心肌特异性蛋白cTnT和Connex-in43的表达。结果分离的MSCs表达表面分子CD44和CD90,不表达CD34和CD45;MSCs体外经5-氮胞苷诱导后在mRNA和蛋白水平均表达心肌标志物cTnT和Connexin43;MSCs体内移植后1周,免疫荧光染色检测发现移植的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT和Connexin43。结论人脐血间充质干细胞可在体外诱导和体内心肌缺血微环境下向心肌细胞分化。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨用5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的最佳条件.方法用Percoll密度梯度离心法分离培养、纯化大鼠MSCs,取第3代MSCs随机分为A、B、C 3组,分别加入5、10、20 μmol/L5-aza;每组分别孵育12、24、48 h,继续培养28 d.相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测细胞肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达,并通过Western印迹法对细胞cTnT进行定量分析.结果MSCs经5-aza诱导培养28 d后,电镜下见细胞胞浆有散在肌丝样结构,免疫组化检测α-actin和cTnT表达均呈阳性;5 μmol/L的5-aza孵育48 h、10 μmoL/L孵育24 h培养28 d的细胞cTnT表达量与10 μmol/L的5-aza孵育48 h、20 μmol/L 3种孵育时间各组比较无显著性差异,且细胞生物学特性未受到明显影响.结论MSCs在体外经5-aza诱导后可分化为心肌样细胞;5 μmol/L的5-aza孵育48 h和10 μmol/L的5-aza诱导24 h是MSCs体外诱导分化心肌样细胞的理想条件.     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离纯化和定向成脂诱导。方法采用密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,免疫组织细胞化学法检测BMSCs表面抗原。脂肪诱导剂诱导BMSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色进行检测。结果免疫组织细胞化学检测结果显示,BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD106,不表达CD34、CD45。BMSCs经脂肪诱导剂诱导后,油红O染色阳性。随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加。结论体外培养的BMSCs在一定诱导条件下能够向脂肪细胞分化,并且随着诱导时间的延长,脂肪细胞比例不断增加。     

丹酚酸B对大鼠骨髓间充质干细胞分化过程中Desmin、α-actinmRNA表达的影响

[目的]探讨丹参单体丹酚酸B(SalB)在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的情况及Desmin和α-actin mRNA的表达,确定大鼠MSCs体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。[方法]选用成年近交系Wistar大鼠,利用percoll分离液进行密度梯度离心法和直接贴壁法进行分离、提纯MSCs,并进行培养扩增。免疫组化方法对第9代MSCs表面抗原进行鉴定。分别应用10μmol/L5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)及250μg/LSalB联合5-aza(5-aza+SalB)对第9代的MSCs进行联合诱导24h,于诱导后第4周,用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Desmin、α-actin mRNA的表达。[结果]1)第9代MSCs免疫组化染色CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达。2)诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。5-aza组、5-aza+SalB组均出现明确的心肌早期分化基因与5-aza组相比,5-aza+SalB组的Desmin和α-actin mRNA表达明显增强。[结论]SalB具有促进5-aza诱导的MSCs向心肌样细胞分化的作用。     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化观察

目的：探讨5-氮胞苷（5-aza）对纯化培养的骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的影响.方法：取雄性Wistar大鼠下肢长骨骨髓进行体外培养和连续传代,取第3代MSCs以10 μmol/L 5-aza诱导作用24 h后,用含体积分数为5%胎牛血清的完全培养基继续培养,观察细胞形态学变化,并在4周后行免疫细胞化学染色鉴定α-Actin,Desmin及心肌特异性肌钙蛋白T（cTnT）的表达.结果：5-aza作用MSCs 7d后细胞形态及排列发生变化,14～21 d左右细胞数量较诱导前明显减少,28 d后细胞稀落,周围伸出多个长的突起,细胞体积大小不等.经抗α-Actin抗体、抗Desmin抗体、抗cTnT抗体鉴定部分细胞出现阳性染色,阳性细胞率分别为20%,19%和10%.结论：骨髓间充质干细胞在体外特定的诱导条件下可以向心肌样细胞分化,有望成为缺血性心脏病细胞移植治疗的细胞材料.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。     

两种分离方法培养成体大鼠骨髓间充质干细胞的比较分析

目的比较分析目前较简单易行的贴壁培养法和密度梯度离心法培养大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的效果.方法用贴壁培养法和密度梯度离心法分别培养大鼠MSCs,流式细胞仪检测MSCs的表面标记物.结果贴壁培养法培养的原代细胞较密度梯度离心法培养的原代细胞生长快,但传代细胞这一差异不明显;而密度梯度离心法培养的原代细胞较贴壁培养法培养的原代细胞形态一致,随着传代的增加,贴壁培养法培养的细胞形态逐步趋于一致.流式细胞仪检测示：贴壁培养法培养的细胞：CD29（99.8%）、CD90（99.6%）、CD34（3.01%）;密度梯度离心法培养的细胞：CD29（100%）、CD90（97.1%）、CD34（0.89%）.结论用贴壁培养法和密度梯度离心法都可以得到纯度较高的MSCs,两种培养方法的效果无明显差异.     

人脐血间充质干细胞鉴定及用5-氮胞苷诱导后的生物学特性研究

目的探讨脐血间充质干细胞经体外扩增纯化表面CD标志的鉴定及在体外定向分化成心肌样细胞的诱导剂5一氮胞苷（5-aza）作用后的生物学特性。方珐健康妊娠产妇分娩的胎儿脐带血,分离单个核细胞进行培养、传代,取第3代以后细胞用流式细胞仪直接标记分析CD34、CD44、CD90细胞表面标志。10μmmol／L5-aza诱导4周后,进行透视电镜观察,并检测细胞肌球蛋白重链基因的表达。结果体外纯化扩增后的脐血间充质干细胞含有与骨髓来源的间充质干细胞相同的细胞表面标志,第3代以后细胞纯度较高,经5-aza体外诱导培养可形成心肌样细胞。结论脐血间充质干细胞经体外纯化扩增,第3代以后的细胞纯度较高,在体外经5-aza诱导定向分化为心肌样细胞后,其基本的生物学特性未发生改变。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

[目的] 探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞 ( MSCs )向心肌样细胞分化的潜能.[方法] 取大鼠下肢骨骨髓,分离培养 MSCs,用 5-氮胞苷 ( 5-aza )定向诱导 24 h,相差显微镜下观察其形态变化,免疫组化法检测肌钙蛋白 ( cTnT )和心肌细胞结蛋白 ( desmin )表达,并通过 RT-PCR对肌球蛋白重链 ( MHC )在细胞中的表达进行鉴定.[结果] MSCs经 5-aza诱导后,部分细胞呈梭形,并可见肌管样结构.免疫组化检测示诱导后 MSCs的 cTnT阳性细胞数为 15%, Desmin表达强阳性, RT-PCR示诱导后 MSCs有 MHC表达.[结论] MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞,是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源.     

人骨髓间质干细胞体外培养诱导成为心肌样细胞的实验研究

目的 研究人骨髓间质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法 取成人髂骨骨髓，分离出骨髓间质干细胞进行培养、传代。观察在培养液中添加诱导剂5-氮胞苷(5-aza)条件下骨髓间质干细胞的生长和分化。结果 成人骨髓间质干细胞贴壁呈集落生长，有成纤维细胞样外观。5-aza诱导人骨髓间质干细胞转化为心肌样细胞。结论 人骨髓间质干细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞，是心肌组织工程良好的细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。     

大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究

 目的 分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）,并行多向分化潜能的鉴定。方法 经Percoll梯度分离法获得大鼠骨髓单个核细胞。贴壁培养后,通过倒置显微镜进行细胞形态学观察,并采用流式细胞术进行分析。传至第3代后,分别进行成脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞的诱导,并行免疫组织化学鉴定。结果 骨髓间充质干细胞大小较为均匀,基本上呈梭形或星形的上皮样细胞,传代培养后的细胞体积增大,成纤维样细胞逐渐增多。经反复传代纯化的MSCs检测CD71、CD29呈阳性表达并证实骨髓间充质干细胞经诱导后分化为脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞。结论 在体外,大鼠骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

三维微环境手性特征调控间充质干细胞线粒体功能

目的 解析手性微环境介导线粒体功能调控骨髓间充质干细胞成骨分化。方法 体外通过三维手性微环境培养间充质干细胞监测干细胞的线粒体膜电位功能,在体内观察凝胶植入后早期缺损区域关键调控线粒体功能趋化CXCL2因子的表达,体外高通量组学分析相关线粒体与代谢信号通路的差异。结果 免疫荧光染色显示右旋手性基质中线粒体线粒体深红色荧光探针染色比例降低,表明右旋手性基质中的干细胞线粒体膜电位出现损伤。大鼠颅骨缺损模型发现在早期植入三维手性凝胶后左旋组修复区域的CXCL2明显表达上调。京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析发现线粒体相关基因与多个信号通路发生了明显的差异表达。差异基因分析发现右旋组中间充质干细胞出现了线粒体降解相关基因的表达上调。左旋手性基质能上调干细胞线粒体NADH脱氢酶活性,右旋手性基质中间充质干细胞线粒体功能出现明显功能损伤。结论 生物植入材料基质手性具备调控干细胞线粒体功能能力。     

人皮下和髌下脂肪垫干细胞治疗大鼠骨关节炎的疗效比较

 目的 比较人皮下和髌下脂肪垫干细胞体外增殖、成软骨分化潜能以及体内治疗大鼠骨关节炎的疗效差异。方法 获取上海市东方医院未患代谢性相关疾病患者的皮下和髌下脂肪垫组织,从髌下脂肪垫中分离原代脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）,体外诱导成脂、成骨、成软骨方向分化。EdU检测人皮下脂肪干细胞（subcutaneous ASCs,Sc-ASCs）和髌下脂肪垫干细胞（infrapatellar fat pad derived stem cells,IPFP-ASCs）体外增殖能力,流式细胞术检测干细胞表面标记蛋白CD34、血管相关标记蛋白CD31的表达。阿尔新蓝染色及Western blot检测Sc-ASCs和IPFP-ASCs体外成软骨潜能。体内实验采用8周SD大鼠随机分为对照（control,CON）组、内侧半月板不稳术（destabilisation of the medial meniscus,DMM）组和DMM手术后Sc-ASCs治疗组,DMM手术后IPFP-ASCs治疗组,通过大体观察、番红固绿染色及OARSI评分比较体内治疗效果。结果 人髌下脂肪垫组织中分离获得ASCs,形态呈长梭形,在体外具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。Sc-ASCs和IPFP-ASCs表面标记蛋白CD34和血管相关标记蛋白CD31表达无显著性差异,但人IPFP-ASCs体外增殖能力较强。阿尔新蓝染色及Western blot显示IPFP-ASCs体外成软骨能力较强。体内大鼠实验大体形态学观察显示DMM组骨赘增多,软骨表面缺损,Sc-ASCs治疗组骨赘减少,IPFP-ASCs治疗组表面较光滑,无明显骨赘生成;番红固绿染色显示DMM组软骨层出现垂直裂缝且到达钙化软骨,Sc-ASCs治疗组关节面纤维化且软骨浅表层存在垂直裂隙,IPFP-ASCs治疗组软骨层较为连续,仅存在轻微纤维化;OARSI评分显示IPFP-ASCs治疗骨关节炎疗效更好。结论 人IPFP-ASCs体外增殖能力、成软骨分化潜能以及体内治疗大鼠骨关节炎的效果优于Sc-ASCs。     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为心肌样细胞的条件。方法抽取大鼠骨髓,采用贴壁培养法分离MSCs进行培养、传代,在第4代MSCs中添加诱导剂5-氮胞苷(5-aza)对其进行诱导分化,观察细胞形态学的变化,应用荧光免疫组织化学方法进行鉴定。结果大鼠MSCs贴壁呈集落生长,有成纤维细胞样外观。诱导后细胞呈梭形,排列方向渐趋一致,有肌管样结构形成,肌钙蛋白及Connexin43表达强阳性。结论大鼠MSCs体外在5-氮胞苷作用下可定向分化为心肌样细胞。     

5-氮胞苷对大鼠脂肪间充质干细胞的诱导分化作用及相关蛋白的表达

目的 探讨5-氮胞苷(5-Aza)对大鼠脂肪间充质干细胞(ADMSCs)的诱导分化作用及相关蛋白的表达。 方法 采取酶消化法和贴壁法分离培养Sprague-Dawley(SD)大鼠腹部皮下脂肪组织，采用抗单核细胞人类白细胞抗原DR(HLA-DR)、兔抗CD13、CD44、CD105、血管性血友病因子(vWF)多克隆抗体对培养细胞进行鉴定，排除造血干细胞及成纤维细胞，取第3代ADMSCs细胞，以每孔1×104个细胞接种于24孔培养板中，并将其随机分为正常组和诱导组，正常组细胞于常规培养基中加入无菌生理盐水培养，诱导组细胞于常规培养基中加入浓度为10 μmol/L的5-Aza进行诱导培养。比较2组细胞的形态结构、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)及缝隙连接蛋白43(Connexin43)基因表达量及cTnT、cTnI、Connexin43蛋白的表达情况。 结果 诱导组ADMSCs细胞增殖缓慢，体积增大并逐渐变为棒状或宽梭形，形态呈心肌细胞特征；RT-qPCR结果显示，诱导组细胞cTnT、cTnI及Connexin43基因表达量增强；免疫组化结果显示，诱导组细胞细胞质明显可见棕黄色或棕褐色颗粒物质，而正常组细胞细胞质中棕黄色或棕褐色颗粒物质较少，且诱导组细胞cTnT、cTnI及Connexin43蛋白阳性表达评分明显高于正常组(P<0.05)。 结论 大鼠脂肪组织中含有多向分化潜能的间充质干细胞(MSCs)，5-Aza可以诱导大鼠ADMSCs向心肌细胞分化，ADMSCs有望成为治疗心肌梗死的种子细胞。      

双阴性选择法纯化培养人骨髓多能成体祖细胞

目的 建立体外分选纯化及培养人骨髓来源多能成体祖细胞(MAPCs)的方法.方法 取健康成人志愿者适量骨髓采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞,贴壁培养后,将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45、血糖蛋白A(GlyA)免疫微磁珠(miniMACS)负分选,流式细胞术鉴定分选后细胞纯度;对传代到不同阶段的细胞进行CD45、GlyA流式细胞分析,初步了解MAPCs在培养、增殖过程中的免疫学稳定性.结果 通过miniMACS分选,平均每1×10⁶/ml骨髓贴壁细胞可分选出约(5～10)×10⁴/ml的MAPCs,分选前后细胞活力分别为(96.7±1.7)%和(96.0±2.4)%,无明显差异;自制的培养基培养分选后的MAPCs生长良好,最长传代到第16代;流式细胞仪分析获取的CD45、G1yA-细胞纯度大于98%;流式细胞仪分析传代第4、8、12代MAPCs,CD45^-、G1yA^-细胞纯度大于98%.结论 CD45、GlyA miniMACS负分选可从骨髓中分离高纯度的MAPCs;MAPCs在本室自制的人MAPCs培养基中体外有较强的增殖能力,且能保持较长时间的稳定状态.     

小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化的形态学观察

目的探讨5-氮胞苷（5-aza）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外诱导作用。方法分离2同龄小鼠胫骨、股骨，冲洗出骨髓，利用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传2代MSCs培养48h后加10μmol／L5-aza进行诱导，3周后刮取贴壁细胞，离心收集，免疫细胞化学检测心肌特异性蛋白α-actin的表达对所诱导细胞进行鉴定，电镜观察细胞超微结构。结果电镜下见胞质内出现大量肌丝，线粒体数量增多，分布在肌丝周围，可见细胞膜电子密度增高的缝隙连接；免疫细胞化学显示α-actin呈强阳性表达。结论MSCs经5-aza体外诱导分化，可获得形态上类似、表达心肌特异性蛋白的心肌样细胞。