远隔缺血预适应对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血半暗带区PERK/p-eIF2α通路及自噬的影响

目的 研究远隔缺血预适应(remote ischemic preconditioning, RIPC)对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带区自噬相关蛋白Beclin1、LC3B以及内质网分子伴侣GRP78、内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)相关通路PERK/p-eIF2α的影响,探讨RIPC保护脑缺血损伤作用的相关机制。方法 将24只健康雄性Sprague-Dawley大鼠采用抽签法随机分为3组:假手术(Sham)组、大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)组和RIPC+MCAO组。每组8只大鼠。采用改良线栓法制备大鼠MCAO再灌注模型,于缺血90 min后拔出线栓再灌注24 h。其中RIPC+MCAO组在MCAO之前,给予大鼠连续3 d的RIPC(采用夹闭双侧股动脉10 min开放10 min,每天3个循环的方法)。免疫荧光双标染色法检测再灌注大鼠缺血半暗带区自噬相关蛋白Beclin1、LC3B以及GRP78、p-eIF2α的表达。结果 1)Sham组大鼠脑内偶见Beclin1阳性细胞。MCAO组大鼠再灌注24 h缺血半暗带区Beclin1表达水平比Sham组显著升高(P<0.05)。给予RIPC的脑缺血再灌注大鼠半暗带区Beclin1的表达水平比MCAO组显著减少(P<0.05)。Beclin1与神经元标志物NeuN共定位。2)MCAO组大鼠再灌注24 h,脑缺血半暗带区GRP78分别与Beclin1和LC3B免疫荧光染色共定位。3)MCAO组大鼠再灌注24 h,脑缺血半暗带区Beclin1与p-eIF2α免疫荧光染色共定位。Sham组大鼠未见Beclin1和p-eIF2α双标阳性细胞,MCAO组大鼠再灌注24 h半暗带区可见大量Beclin1和p-eIF2α双标阳性细胞。给予RIPC后,缺血大鼠半暗带区Beclin1和p-eIF2α双标阳性细胞数目比MCAO组明显减少(P<0.05)。结论 RIPC可能通过抑制ERS相关通路PERK/p-eIF2α,减少神经元中自噬相关蛋白产生,避免神经元过度激活自噬,发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。     

大鼠脑缺血再灌注后线粒体损伤及p-STAT3表达

目的:研究大鼠脑缺血再灌注后脑组织线粒体中信号转导与激活子3（STAT3）的表达情况,探讨线粒体中磷酸化STAT3（p-STAT3）与脑缺血后线粒体损伤的关系。方法:线栓法制作大鼠脑局部缺血再灌注模型,大鼠随机分为假手术（SHAM）组和大脑中动脉栓塞再灌注（I/R）组。透射电镜观察皮质区神经元内的线粒体损伤情况。Western blotting及免疫荧光双标法检测线粒体中STAT3及p-STAT3表达。结果:与SHAM组比较,大鼠脑缺血再灌注后,皮质区神经元内的线粒体损伤严重;线粒体中存在STAT3表达,且在脑缺血再灌注后表达量无变化,差异没有统计学意义（P>0.05）,而p-STAT3表达显著增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:STAT3在大鼠脑组织线粒体中表达,脑缺血再灌注后被显著激活,推测脑缺血再灌损伤后,线粒体中STAT3的激活可能参与了脑缺血再灌注病理生理过程中线粒体的损伤和修复。     

大黄酚对局灶性脑缺血再灌注小鼠Beclin1及Bax的作用

目的 研究大黄酚（chrysophanol,CHR）对短暂性局灶性脑缺血再灌注小鼠缺血半暗带区自噬蛋白Beclin1及缺血侧大脑半球促凋亡蛋白Bax水平的影响,探究CHR对脑缺血再灌注损伤的保护机制。方法 将18只健康C57BL/B6雄性小鼠按数字表法随机分为3组：假手术（Sham）组、大脑中动脉梗死（middle cerebral artery occlusion,MCAO）组、CHR组（自造模当天至再灌注后14 d每天按0.1 mg/kg腹腔注射CHR）,每组6只。按照线栓法制作小鼠右侧大脑中动脉缺血45 min再灌注模型。再灌注14 d时将小鼠处死后,迅速断头、取脑,应用免疫荧光染色法检测脑组织冰冻切片缺血半暗带区自噬Beclin1水平,Western blotting法检测缺血侧脑组织Bax蛋白水平。结果 1） Sham组小鼠脑内偶见Beclin1阳性细胞。MCAO组小鼠脑缺血半暗带区Beclin1表达水平比Sham组显著升高（P<0.05）。给予CHR治疗的脑缺血再灌注小鼠半暗带区Beclin1的表达水平比MCAO组显著减少（P<0.05）。2）在脑缺血半暗带区,Beclin1与神经元标志物NeuN共定位。3） MCAO组小鼠缺血侧脑组织Bax蛋白水平比Sham组明显升高（P<0.05）。CHR组小鼠缺血侧脑组织Bax蛋白水平比MCAO组显著减少（P<0.05）。结论 CHR可能通过抑制Bax蛋白表达水平,减少Beclin1蛋白产生,减轻神经元凋亡,避免自噬过度激活,从而对脑缺血再灌注损伤发挥长期神经保护作用。     

一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带区细胞自噬的影响

目的 探究一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（Nω-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME）对大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型大鼠再灌注后24 h脑内一氧化氮（nitric oxide,NO）和自噬相关蛋白Beclin1、LC3B表达的影响,探讨L-NAME保护脑缺血再灌注损伤的机制。方法 18只健康雄性SD大鼠采用随机数字表法分为假手术（Sham）组、MCAO组,和MCAO+L-NAME组,每组6只。使用改良线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉缺血90 min再灌注模型。术中监测大鼠肛温,使其维持在正常范围。于再灌注后24 h处死大鼠,迅速取脑,用免疫荧光染色检测小鼠脑组织冰冻切片缺血半暗带区Beclin1和LC3B的表达水平,用免疫荧光双标分别将Beclin1和LC3B与NO介导的蛋白质损伤标志物3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine,3-NT）进行共定位。结果 Sham组大鼠没有3-NT染色阳性细胞,偶见Beclin1和LC3B染色阳性细胞,MCAO组小鼠脑组织缺血半暗带区3-NT、Beclin1、LC3B均大量表达（P<0.05）。与MCAO组相比,给予L-NAME治疗后,缺血再灌注大鼠脑组织半暗带区3-NT、Beclin1、LC3B表达均明显减少（P<0.05）。缺血再灌注小鼠脑组织半暗带区,Beclin1和LC3B分别与3-NT免疫荧光染色共定位。结论 L-NAME通过抑制NOS活性,减少NO的产生,直接避免神经元的氧化应激损伤;同时,氧化应激损伤的减弱也避免了自噬的进一步激活,起到了间接的神经保护作用。     

赤芍总苷对沙土鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的 观察赤芍总苷(TPG)对全脑缺血再灌注的保护作用。方法 采用结扎双侧颈总动脉12min再灌注24h建立沙土鼠全脑缺血再灌注模型,观察于造模24h后TPG对沙土鼠脑组织含水量、SOD与MDA及病理组织学的影响。结果 同模型组比较,TPG200、400mg/kg·b.w.组脑组织含水量明显低于模型组;模型组脑组织SOD活性明显降低,MDA含量明显提高,各给药组与模型对照组比较SOD明显升高,MDA含量显著下降;病理检查表明给药组的病理损伤较模型组轻。结论 赤芍总苷对全脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用。     

螯合锌离子对局灶性脑缺血再灌注大鼠半暗带区低氧诱导因子-1α表达的影响

目的 利用大脑中动脉梗塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）大鼠模型,观察脑缺血再灌注后脑组织低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）表达的动态变化,并给予脑缺血大鼠锌离子螯合剂［N,N,N’,N ’-tetrakis（2-pyridylmethyl）ethylenediamine,TPEN］进行干预,研究锌离子对MCAO大鼠脑组织HIF-1α表达的影响,探讨锌离子介导脑缺血再灌注损伤的相关机制。方法 采用数字表法将45只健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为3组：假手术组（Sham）、MCAO组和MCAO+TPEN组（于MCAO前30 min腹腔注射TPEN,剂量为15 mg/kg）,每组15只。使用线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉缺血90 min再灌注模型。术中监测大鼠肛温及平均动脉压,使其维持在正常范围。分别于再灌注3、12和24 h处死大鼠,迅速取脑,用免疫组化染色检测大鼠脑组织冰冻切片内缺血半暗带区HIF-1α的表达水平,用免疫荧光双标对HIF-1α在缺血脑组织的表达进行细胞定位。结果 假手术组大鼠未见HIF-1α染色阳性细胞,MCAO组大鼠脑组织缺血半暗带区HIF-1α的表达随再灌注时间延长逐渐增加（P<0.01）。给予15 mg/kg TPEN后,缺血再灌注各时间点大鼠脑组织缺血半暗带区内HIF-1α的表达比MCAO组明显减少（P<0.01）。缺血再灌注大鼠脑组织缺血半暗带区内,HIF-1α免疫荧光染色与神经元标志物NeuN免疫荧光染色共定位。结论 大鼠局灶性脑缺血再灌注后,脑组织神经元内HIF-1α表达随再灌注时间延长递增。螯合细胞内锌离子下调缺血再灌注大鼠脑内HIF-1α浓度,提示锌离子可能通过促进HIF-1α表达介导脑缺血损伤。     

丙泊酚后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的改善作用及其机制

目的 探讨丙泊酚后处理对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的改善作用及其对脑线粒体损伤的保护作用,阐明其作用机制。 方法 24只SD大鼠随机分为假手术组、模型组和丙泊酚后处理组,每组8只。模型组和丙泊酚后处理组大鼠采用结扎颈动脉法建立大脑中动脉阻塞局灶性脑缺血再灌注模型,丙泊酚后处理组大鼠于再灌注即刻股静脉输注20 mg·kg^－1·h^－1丙泊酚2 h,假手术组和模型组大鼠给予等量生理盐水。各组大鼠于再灌注24 h后进行神经功能缺损评分,采用HE染色法观察各组大鼠海马组织病理形态表现,采用相关试剂盒检测各组大鼠海马组织中氧化应激相关因子活性和水平,采用活性氧（ROS）荧光探针检测各组大鼠脑海马组织中ROS水平,采用TUNEL法检测各组大鼠海马组织中TUNEL阳性细胞率,采用Western blotting法检测各组大鼠海马组织中线粒体裂变、融合和生物发生相关蛋白及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯氧化酶4（Nox4）和核因子E2相关因子2（Nrf2）蛋白表达水平,免疫荧光法检测各组大鼠海马组织中Nrf2蛋白表达水平。 结果 与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高（P<0.05）,大鼠海马组织病理损伤明显,海马组织中超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和总抗氧化力（T-AOC）水平明显降低（P<0.01）,丙二醛（MDA）和ROS水平及TUNEL阳性细胞率明显升高（P<0.05）,动力相关蛋白1（DRP1）、裂变蛋白1（Fis1）、Nox4和Nrf2蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,视神经萎缩症蛋白1（OPA1）、线粒体融合蛋白2（Mfn2）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）和线粒体转录因子 A（TFAM）蛋白表达水平明显降低（P<0.05）;与模型组比较,丙泊酚后处理组大鼠神经功能缺损评分明显降低（P<0.05）,大鼠海马组织病理损伤明显改善,大鼠海马组织中SOD及GSH-Px活性和T-AOC水平明显升高（P<0.05）,MDA 水平、ROS水平和TUNEL阳性细胞率明显降低（P<0.05）,DRP1、Fis1和Nox4蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,OPA1、Mfn2、PGC-1α、TFAM和Nrf2蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。 结论 丙泊酚后处理可抑制脑缺血再灌注损伤大鼠海马组织细胞凋亡和氧化应激,促进线粒体融合和生物发生并抑制线粒体裂变,改善大鼠神经功能损伤,其机制可能与调控Nox4/Nrf2信号通路有关。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注脑组织中活性氧自由基表达的时程变化

目的 采用大鼠大脑中动脉梗死(middle cerebral artery occlusion, MCAO)再灌注模型,研究缺血脑组织再灌注后活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的时程变化,探讨ROS在脑缺血损伤中的作用。方法 采用数字表法将25只健康雄性SD大鼠随机分为5组:假手术(Sham)组,MCAO组(缺血90 min,再灌注3、6、12、24 h),每组5只大鼠。使用线栓法制作大鼠缺血90 min再灌注模型,术中监测大鼠平均动脉压及肛温,使其保持在正常范围。每组大鼠分别于再灌注后3、6、12、24 h时处死,迅速取脑组织进行TTC染色,检测大鼠脑梗死体积,并制作新鲜脑组织冰冻切片,采用ROS特异性染色方法——H₂DCF-DA荧光染色法,检测再灌注后不同时间点缺血半暗带区ROS的表达。结果 1) 在MCAO手术过程中,Sham组以及MCAO组大鼠的平均动脉压及肛温差异无统计学意义。2)Sham组大鼠脑内无缺血半暗带区,其相应脑区内只可见极少量的H₂DCF-DA阳性染色细胞。而MCAO组大鼠再灌注后3,6,12,24 h 4个时间点,脑组织半暗带区域均可见大量的H₂DCF-DA阳性染色细胞。且从再灌注3 h起,MCAO组大鼠脑组织半暗带区域H₂DCF-DA阳性染色细胞数量持续增加,其中再灌注6 h与3 h相比,差异有统计学意义(P<0.05),再灌注24 h与12 h相比,差异有统计学意义(P<0.05)。3)TTC染色结果显示,Sham组大鼠无脑梗死发生。MCAO组大鼠脑组织随再灌注时间的延长(从3 h 到24 h),相对梗死体积逐渐增大,差异有统计学意义(P<0.05)。4) MCAO组大鼠脑组织H₂DCF-DA阳性细胞数目与脑梗死体积比率呈正相关(r=0.833,P<0.01)。结论 局灶性脑缺血模型大鼠再灌注后缺血侧脑组织中ROS量随再灌注时间延长递增,ROS在脑缺血再灌注损伤中具有重要作用。     

淫羊藿黄酮对慢性脑缺血低灌注致大鼠脑白质病变的影响

目的 研究淫羊藿黄酮(epimedium flavonoids, EF)对慢性脑缺血低灌注损伤模型大鼠脑白质病变的影响。方法 采用双侧颈总动脉结扎(permanent bilateral common carotidartery occlusion, 2VO)法制备慢性脑缺血低灌注大鼠模型,采用数字表法将大鼠随机分为5组:假手术组,模型组,EF中、高剂量(100、200 mg/kg)给药组,阳性对照药尼莫地平组,于2VO术后24 h开始灌胃给药,一天1次,连续给药6周。采用新物体识别实验评价各组大鼠认知功能的变化,磁共振观察各组大鼠脑白质损伤变化,坚牢蓝(luxol fast blue, LFB)染色观察各组大鼠胼胝体部位髓鞘结构变化。结果 新物体实验结果中模型组大鼠分辨指数较假手术组大鼠显著降低,而与模型组相比,各给药组大鼠的分辨指数明显升高。磁共振结果显示模型组大鼠脑白质胼胝体及视束部位纤维束受损,EF给药能明显保护神经纤维的完整性,减轻2VO术后脑白质损伤。LFB染色结果显示,长期慢性脑缺血低灌注引起大鼠胼胝体部位髓鞘结构紊乱,而EF给药后可显著减轻髓鞘脱失现象。结论 EF可减少2VO术后大鼠脑白质髓鞘结构异常,减轻脑白质损伤,进而改善模型大鼠认知功能障碍。     

谷红注射液对脑缺血大鼠大脑皮质线粒体功能的改善作用

目的 观察谷红注射液对缺血再灌注损伤大鼠大脑皮质线粒体功能的影响。方法 采用线栓法制备SD大鼠大脑中动脉梗阻（MCAO）复灌模型,术后即刻给药,连续给药14天后通过神经功能缺损症状评分及贴纸去除实验评价药效。采用Western blot法检测线粒体自噬相关蛋白Beclin1、Parkin、KIFC2、SNAP-25及UCP3的表达变化。结果 与模型组相比,谷红注射液能显著减轻缺血再灌注模型大鼠的神经功能缺损症状及恢复感觉运动功能,并有效逆转缺模型大鼠大脑皮质组织中线粒体与上述自噬相关蛋白表达的变化。结论 谷红注射液改善脑缺血损伤的作用机制可能与激活线粒体自噬功能有关。     

一氧化氮清除剂Carboxy-PTIO对短暂性局灶性脑缺血大鼠PERK/p-eIF2α通路的调节作用

目的 观察一氧化氮（nitric oxide,NO）清除剂Carboxy-PTIO （C-PTIO）对大脑中动脉梗死（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型大鼠再灌注后24 h脑组织中PERK/p-eIF2α通路介导的细胞死亡的影响,探究NO的产生对大鼠脑内内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）介导的神经元凋亡的影响。方法 将18只健康雄性SD大鼠依据数字表法随机分为假手术（Sham）组、MCAO组和MCAO+C-PTIO组,每组6只。大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型制作采用改良线栓法,并于缺血90 min后拔出线栓进行再灌注。术中监测大鼠肛温,使其维持在正常范围。于再灌注后24 h处死大鼠,迅速取脑,用免疫荧光染色检测大鼠脑组织冰冻切片缺血半暗带区p-eIF2α和C/EBP homologous protein （CHOP）的表达水平,用免疫荧光双标法将NO介导的蛋白质损伤标志物3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine,3-NT）分别与p-eIF2α和CHOP进行定位。结果 1） Sham组大鼠没有p-eIF2α和3-NT染色阳性细胞,偶见CHOP染色阳性细胞,MCAO组大鼠脑组织缺血半暗带区3-NT、p-eIF2α、CHOP均大量表达（P<0.05）。2）与MCAO组相比,经腹腔注射给予C-PTIO后,缺血再灌注大鼠脑组织半暗带区3-NT、p-eIF2α、CHOP表达均明显减少（P<0.05）。3）缺血再灌注大鼠脑组织半暗带区,3-NT分别与p-eIF2α和CHOP免疫荧光染色共定位。结论 在脑缺血再灌注过程中,NO介导的氧化应激损伤引起ERS,并激活PERK/eIF2α通路引起细胞凋亡;抑制NO的产生,可以减弱这一过程,起到神经保护作用。     

2型糖尿病大鼠骨髓干细胞条件培养基促进糖尿病大鼠脑梗死后神经功能恢复

目的 探讨2型糖尿病（T2DM）大鼠骨髓干细胞条件培养基（BMSC-CM）对T2DM大鼠脑缺血/再灌注损伤后神经功能恢复的影响.方法 将成年雄性SD大鼠用烟酰胺、链脲佐菌素（STZ）诱导制作T2DM模型,制备T2DM大鼠BMSC-CM,线栓法制作T2DM大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）脑缺血/再灌注模型.实验动物分为空白对照组、单纯培养基组和条件培养基治疗组（每组n=6）.治疗组分别于术后24、48 h经尾静脉注射T2DM大鼠BMSC-CM（10 ml/kg）,单纯培养基组经尾静脉注射培养基DMEM,空白对照组未给予任何干预措施.术后1、7、14天分别进行神经功能缺损评分（mNSS）和足错步试验.结果 术后第1天,各组mNSS、足错步次数比较差异无统计学意义（P＞0.05）.术后第7、14天,条件培养基治疗组mNSS、足错步次数明显低于空白对照组和单纯培养基组（P＜0.05）,空白对照组与单纯培养基组mNSS、足错步次数差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 T2DM大鼠BMSC-CM可明显促进T2DM大鼠脑梗死后的神经功能恢复.     

间歇性低氧干预对脑缺血大鼠神经功能恢复的影响

目的:探究脑缺血后间歇性低氧干预的神经保护作用及机制。方法:8周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为假手术组（SHAM,n=6）、脑缺血-静息组（MCAO-SED,n=7）和脑缺血-间歇性低氧组（MCAO-IH,n=7）。术后1周开始对MCAO-IH组进行低氧干预,持续4周。每周进行改良神经损伤程度评分（mNSS）;干预4周后采用MRI检测大鼠脑梗死体积;Western 印迹法检测脑皮质梗死边缘区脑组织腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α（PGC-1α）的表达量。 结果:与MCAO-SED组相比,MCAO-IH组死亡率无差异（14.29%,P>0.05）;mNSS评分显著降低（P<0.05）;脑梗死体积明显减小（P<0.01）;梗死边缘区AMPK和PGC-1α表达量显著升高（PAMPK<0.001,PPGC-1α<0.05）。相关性分析结果显示,梗死边缘区AMPK和PGC-1α表达量与mNSS评分之间均呈显著负相关（P<0.05）。结论:间歇性低氧干预可通过上调脑组织中AMPK和PGC-1α蛋白表达,进而减小脑梗死体积,促进运动功能恢复,可能通过激活AMPK/PGC-1α信号通路发挥神经保护作用。