猪骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的诱导研究

探讨利用血管基质成分将猪骨髓间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞的可能性.其方法为以DMEM作为基础成分,添加制备好的血管基质成分和胎猪血清作为诱导猪骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的生化条件.结果表明在培养液中观察到了血管内皮细胞.利用血管基质成分将猪骨髓间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞是可能的.     

诱导性多能干细胞体外定向诱导分化的研究进展

胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究已成为发育生物学和细胞移植治疗学的研究热点,但伦理及免疫排斥问题一直阻碍胚胎干细胞（ES）的研究和临床应用。近两年,科学家成功地从多种成体细胞获得了诱导性多能干细胞（iPS细胞）,iPS细胞具有和胚胎干细胞相似的特性,由于其可来自自体成体细胞,因而可避开伦理及免疫排斥问题,是胚胎干细胞良好的替代材料,具有广阔的应用前景。iPS只有诱导分化为成熟的功能细胞才能用于疾病的治疗。主要介绍iPS细胞向成熟细胞分化的研究现状及目前存在的一些问题。     

一种人诱导多能干细胞向内皮细胞定向分化方案的建立及鉴定

背景：人诱导多能干细胞是一种与胚胎干细胞性状高度类似的多能干细胞,其具备三胚层分化潜能和持续自我更新能力,因此能够为临床细胞替代治疗提供足量目的细胞。目的：构建并鉴定一种高效的基于人诱导多能干细胞的内皮细胞定向分化实验方案。方法：采用免疫荧光技术对人诱导多能干细胞干性和增殖活性进行鉴定。采用转录因子重组蛋白和小分子化合物时序性调控系列信号通路,即在第0,1,2,5天顺序加入激活素A、GSK通路抑制剂CHIR99021/骨形态发生蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子/血管内皮生长因子/骨形态发生蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子/血管内皮生长因子/CHIR99021,人诱导多能干细胞经历心脏中胚层、内皮前体细胞命运转变并最终分化成为有功能的内皮细胞。采用明场显微镜、实时定量PCR、免疫荧光动态观察不同阶段细胞形态特征和分子标记物,采用血管成环实验验证内皮细胞的体外血管形成功能。结果与结论：(1)人诱导多能干细胞内源性高表达诱导多能干细胞干性特异标记物(OCT4、NANOG、SSEA4)和增殖标记物(Ki67);(2)开始分化后的人诱导多能干细胞经历了诱导多能干细胞、心脏中胚层、内皮前体细胞、内皮细...     

人胚胎干细胞接种在鼠尾胶原包被培养板上定向分化为血管内皮细胞

背景：胚胎干细胞在体外可诱导分化为血管内皮细胞,进而形成血管,因而成为血管组织工程理想的种子细胞来源之一。 目的：探讨建立定向诱导人胚胎干细胞向血管内皮细胞分化的方法。 方法：在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养人胚胎干细胞H1,将H1细胞团块转移到鼠尾胶原包被的培养板,贴壁24- 48 h后,培养基换为含不同辅助因子和内皮细胞生长添加剂的EGM-2内皮细胞培养基。 结果与结论：①在EGM-2内皮细胞培养基诱导下,细胞逐步表达内皮细胞特异性标记基因VEGFR-2、PECAM1、vWF、CD34、VE-cadherin、GATA-2。②分化细胞表达内皮细胞特异性标记VE-cadherin、CD31。③分化细胞具有吞噬低密度脂蛋白功能。说明将人胚胎干细胞接种在鼠尾胶原包被培养板上,通过EGM-2内皮培养体系诱导,可直接分化为功能性血管内皮细胞。为研究胞外基质对诱导胚胎干细胞血管内皮细胞分化的作用以及相关信号分子机制打下了基础。     

定向诱导人尿液细胞源性多能干细胞向多巴胺能神经元的分化

目的探讨定向诱导人尿液来源诱导性多能干细胞(U-iPS)向多巴胺(DA)能神经元分化。方法单层贴壁法体外培养U-iPS,通过时向性添加TGF-β及BMP信号通路抑制剂,SHH细胞因子,GSK3β抑制剂Chir99021将U-iPS诱导为DA能神经前体细胞(NPCs),通过添加BDNF/GDNF等细胞因子将其进一步分化为DA能神经元。在诱导分化的4个时间点(第0天、7天、14天及25天)采用RT-qPCR和免疫荧光检测多能干细胞标志物Oct4与Nanog的表达;NPCs标志物Nestin、Pax6和Foxa2的表达;DA神经前体细胞标志物Lmx1a和En1的表达;神经元标志物Tuj1的表达以及DA能神经元标志物TH的表达情况。以人皮肤成纤维细胞来源的iPS(F-iPS)向DA能神经元的诱导分化作为对照进行分化效率的比较。结果 U-iPS在第0天表达多能干标志物Oct4和Nanog;诱导第7天能转化为Nestin、Pax6及Foxa2阳性的NPCs;第14天转化为Lmx1a和En1阳性的DA能神经前体细胞;第25天分化得到的神经元样细胞表达神经元标志物Tuj1,其中部分细胞表达DA能神经元标志物TH。各时间点神经类细胞标志物的表达与F-iPS诱导分化得到的神经类细胞标志物的表达差异无统计学意义(P0.05)。结论 U-iPS细胞具有向DA能神经元分化的潜力,能在体外经过诱导分化得到TH阳性的DA能神经元,且与F-iPS向DA能神经元分化的效率无明显差异。     

人胚胎干细胞向内皮细胞的分化诱导

BACKGROUND:Human embryonic stem cells exhibit self-renewal and multi-differentiation potential, and can differentiate into endothelial cells under certain induction conditions. OBJECTIVE:To explore induced conditions of the human embryonic stem cells differentiating into endothelial cells and to investigate the effect of vascular endothelial growth factors on the endothelial differentiation of human embryonic stem cells. METHODS:After resuscitation, passage 40 human embryonic stem cell lines H9 were subjected to suspension culture to prepare embryos, and after 5-day culture, these cells were cultured in attachment medium to differentiate into embryoid bodies, followed by induction with 50 µg/L vascular endothelial growth factors. Passage 2 and 15 embryonic stem cells after induced differentiation were taken for Dil-Ac-LDL uptake test and immunohistochemical staining, respectively. RESULTS AND CONCLUSION:After 1-day culture, cord-like or polygonal monolayer cells around embryoid bodies showed bud-like and radial growth with a relative rapid speed merging into surrounding colonies; at 2-3 days, the number of suspension cells increased further, but the small-round cells in the center began to die; at 5 days, embryoid bodies started to passage, and aggregated cells exhibited typical paving stone-like appearance. Moreover, some human embryonic cells after induced differentiation could actively take up fluorescent labeled LDL, and red fluorescent particles appeared. Additionally, passage 15 embryonic stem cells after induced differentiation could express CD31 and FLK-1. These findings suggest that human embryonic stem cells induced by vascular endothelial growth factors can differentiate into endothelial cells.     

成体干细胞诱导多能干细胞的研究进展

通过存在于卵母细胞中的一些未确定的因子,以成年细胞对动物进行克隆证实成年细胞能被重编程为胚胎干细胞(ESCs).近年来,某些转录因子被发现具有诱导体细胞且有多潜能性的特性,从而可以在不使用卵母细胞的情况下获得性能上与胚胎干细胞大体一致的诱导多能干细胞(iPS).iPS细胞为细胞多能性机制的研究、特定疾病模型的建立以及在...     

间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究进展

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一种起源于中胚层的成体干细胞,可以向所有中胚层来源的细胞及部分外胚层来源的细胞分化,且MSCs具有来源广泛、易于体外分离培养、免疫原性低,移植后无免疫排斥反应和易于基因转染等特点。血管内皮细胞属于中胚层细胞,MSCs可定向诱导分化为血管内皮细胞,在体外构建成理想的血管移植物,用于心脏组织工程瓣、血管组织工程以及再生医学领域。本文就间充质干细胞的生物学特性及诱导分化为内皮细胞的相关研究以及研究中存在的问题作一综述。     

诱导多能干细胞的研究进展

人类组织工程的最终目的 是细胞在体外生长、分化为功能组织和器官以替代、修复、维持或者增强受损组织和器官功能.胚胎干细胞由于具有体外无限扩增的能力以及分化为机体各种类型细胞的潜能而成为组织工程中首选的细胞来源.主要就应用不同转录因子Oct3/4、Sox2、c-myc、Klf4、Nanog和LIN28经逆病毒导入未经遗传修改的成纤维细胞,从而使该类细胞去分化与重编程成具有分化为其它各种类型细胞的多能干细胞的研究进展作一综述.     

诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立

背景：目前,大量文献报道了诱导多能性干细胞系的建立,但大规模体外诱导分化造血祖细胞的研究还缺乏深入的探讨。 目的：建立诱导多能性干细胞体外定向诱导形成造血祖细胞的方法。 方法：采用慢病毒感染的方法将含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导人皮肤成纤维细胞,获得了诱导多能性干细胞;在诱导分化体系中添加了Y-27632,克服干细胞扩增中的凋亡现象;运用OP9细胞产生的条件培养液建立诱导多能性干细胞体外定向分化形成造血祖细胞的分化体系。 结果与结论：①前3代细胞克隆传代时,诱导多能性干细胞发生凋亡的现象很多,很难大规模扩增培养。培养基中添加阻断ROCK活化的抑制剂,能够明显抑制胚胎干细胞的凋亡。②诱导多能性干细胞在OP9细胞条件培养液作用下,经过体外诱导分化,形成CD34+造血祖细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

人诱导性多能干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 观察人诱导性多能干细胞（iPS细胞）定向分化为神经干细胞（NSCs）的潜能。方法 用维甲酸（RA）诱导人iPS细胞向NSCs分化。倒置显微镜下观察iPS细胞的形态变化,RT-PCR检测NANOG, OCT4, SOX2的表达;免疫组织化学方法检测NESTIN、SOX2、β-TUBULIN Ш和GFAP的表达。结果RA诱导后第4天,贴壁的拟胚体出现了早期神经祖细胞特有的神经管样结构并不断增多,细胞表达神经巢蛋白NESTIN,而对照组未观察到神经管样结构。神经管样结构内的细胞能分化为β-TUBULIN Ш阳性的神经元,但GFAP阳性的星形胶质细胞少见。结论 人iPS细胞具有定向分化为NSCs的潜能,并能模拟神经发育过程。     

miR-148a促进人诱导性多能干细胞向心肌样细胞的分化

文题释义：人诱导性多能干细胞来源的心肌样细胞：在体外直接将人诱导性多能干细胞定向诱导分化为心肌样细胞具有供者个体基因的特异性,不仅可以进行发病机制的深入研究,还可以进行个体化药物治疗测试,为精准个性化治疗带来希望。来自于患者自身体细胞的心肌细胞扩增速度快,没有免疫排斥和伦理问题,但目前的主要问题是来自于人诱导性多能干细胞的心肌样细胞成熟程度不佳,分化的细胞不具备成人心肌细胞的电生理活动,且纯化有一定困难。 微小RNA的调节作用：微小RNA是一类内源性的非编码单链RNA,通常含有19-22个核苷酸,可通过靶向结合mRNA而使其降解或抑制其翻译,发挥对靶基因的转录后调控作用。近年来,基于芯片分析技术发现有多个miRNA在心肌分化发育或干细胞向心肌样细胞定向分化过程中发挥调控作用,有正向调控也有负向调控。 背景：研究发现,miR-148a可以促进人骨髓间充质干细胞定向分化为成熟心肌样细胞,但关于miR-148a对人诱导性多能干细胞向心肌样细胞分化的影响则未见报道。 目的：探讨miR-148a对人诱导性多能干细胞向心肌样细胞分化的影响。 方法：将人诱导性多能干细胞分为3组向心肌样细胞诱导分化,对照组细胞不做处理,低表达组细胞用miR-148a抑制物处理28 d,高表达组细胞用miR-148a模拟物处理28 d;另取常规培养28 d的人诱导性多能干细胞为空白对照组。CCK-8检测细胞增殖活力,qRT-PCR检测miR-148a mRNA的表达,免疫荧光染色和Western blot检测MHC和cTnT蛋白的表达。 结果与结论：①低表达组细胞内miR-148a mRNA表达、细胞增殖活力低于空白对照组和对照组,高表达组高于其他3组(P < 0.01);②空白对照组无MHC和cTnT的阳性表达,对照组、低表达组和高表达组均有MHC和cTnT的阳性表达;③低表达组细胞MHC和cTnT蛋白表达低于对照组,高表达组高于其他3组(P < 0.01);④以上结果提示,miR-148a可促进人诱导性多能干细胞向心肌样细胞分化。 ORCID: 0000-0003-1698-4393(毛庆) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells

Current EC differentiation protocols are inefficient, and the phenotypes of the differentiated ECs are only briefly stable, which significantly inhibits their utility for basic science research. Here, a remarkably more efficient hiPSC-EC differentiation protocol that incorporates a three-dimensional (3D) fibrin scaffold is presented. With this protocol, up to 45% of the differentiated hiPSCs assumed an EC phenotype, and after purification, greater than 95% of the cells displayed the EC phenotype (based on CD31 expression). The hiPSC-ECs continued to display EC characteristics for 4 weeks in vitro. Gene and protein expression levels of CD31, CD144 and von Willebrand factor-8 (vWF-8) were significantly up-regulated in differentiated hiPSC-ECs. hiPSC-ECs also have biological function to up-take Dil-conjugated acetylated LDL (Dil-ac-LDL) and form tubular structures on Matrigel. Collectively, these data demonstrate that a 3D differentiation protocol can efficiently generate ECs from hiPSCs and, furthermore, the differentiated hiPSC-ECs are functional and can maintain EC fate up to 4 weeks in vitro.     

质粒重编程诱导多潜能干细胞及定向分化神经干细胞

目的 　探讨游离质粒载体重编程诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)为非整合型诱导多潜能干细胞,并在体外定向分化为神经干细胞(neural stem cells, NSCs), 为神经干细胞移植治疗神经损伤提供稳定、安全的细胞来源。 方法　使用电转仪将质粒pEP4-EO2S-ET2K转入小鼠MEFs, 经诱导培养重编程为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs), iPSCs在不同诱导培养基中经2次悬浮及贴壁培养分化为NSCs,在体内及体外实验鉴定iPSCs多向分化潜能特性及NSCs特性。 结果　体内外实验显示iPSCs具有与胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)相似的多向分化潜能, 且不整合外源性基因。iPSCs进一步分化的NSCs其相关标志基因表达与野生型NSCs相近,且较iPSCs显著增加,免疫荧光显示NSCs高表达NSC标志物 NESTIN及PAX6,在体外存活能分化为神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞。 结论　游离质粒能重编程诱导非整合型iPSCs, 并定向分化为神经干细胞及神经元, 是神经损伤修复的理想种子细胞。     

miR-375对人类诱导多能干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响

目的:探讨微小RNA-375(miR-375)在调控人类诱导多能干细胞(hiPSCs)分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)过程中的作用及可能机制。方法:构建miR-375过表达的慢病毒载体,转染hiPSCs获得miR-375稳定表达的miR-375-hiPSCs,体外诱导其定向分化为IPCs,采用real-time PCR、流式细胞术及ELISA等方法对其标志性基因、分化效率、胰岛素和C肽释放量等进行检测;生物信息学结合萤光素酶报告基因实验预测并验证miR-375的靶基因,real-time PCR及Western blot检测靶基因的表达。结果:过表达miR-375可上调胰岛β细胞标志性转录因子HNF4α、MafA、Pdx1、Pax6、Nkx6.1、glucokinase和insulin的表达,分化效率由对照组的22.3%提高至38.6%;高糖刺激后胰岛素释放量由成年胰岛细胞分泌量的1/8提高到1/5;过表达miR-375可影响靶基因REST和WNT5A的蛋白翻译水平。结论:miR-375可通过干扰靶基因REST和WNT5A的翻译水平,开启胰岛素分泌相关特异性基因的表达,从而促进hiPS...     

促红细胞生成素对小鼠诱导多能干细胞源性神经干细胞向功能性神经元样细胞分化的影响

目的:探讨促红细胞生成素体外对小鼠诱导多能干细胞(iPSCs)来源的神经干细胞神经分化的影响。方法:神经干细胞培养基培养诱导iPSCs分化为神经干细胞,设4个浓度加入含促红细胞生成素的培养基,免疫细胞化学荧光鉴定神经元标志物微管相关蛋白2(MAP-2)、神经干细胞标志物巢蛋白的表达。FM 1-43染色技术观察FM 1-43染色颗粒消失的情况。结果:iPSCs在条件培养液的诱导下形成神经干细胞克隆,15 U/ml促红细胞生成素处理后神经干细胞克隆球向神经元方向分化,呈MAP-2阳性细胞。新分化的神经元有大量FM 1-43绿色阳性颗粒。结论:iPSCs体外诱导可获得神经干细胞,促红细胞生成素浓度为15 U/ml时可促进iPSCs源性神经干细胞向功能性的神经元方向分化。     

高效制备人诱导多能干细胞并诱导分化为心肌细胞

目的 提高人诱导性多能干细胞(hiPSC)转化效率,缩短其产生周期,并避免引入异源基因.方法 利用GP2-293反转录病毒包装系统对人包皮成纤维细胞(HFFs)进行转化,引入小分子物质,并对类胚胎干细胞(ESC)克隆进行独立培养,检测标记蛋白,定向诱导分化能力和核型分析.结果 HFFs经转化后,20 d出现形态与ESC克隆相似的hiPSC,比经典法缩短了10 d,效率提高约12倍.它们与ESC同样表达标记蛋白;体外成功定向分化为心肌细胞.核型分析表明该hiPSC染色体核型正常.结论 建立稳定的转化效率高、周期短的hiPSC生成体系,并成功诱导分化成心肌细胞,为心血管疾病的模型构建和临床研究提供实验基础.     

小鼠诱导型多潜能干细胞定向分化为功能性肝细胞

目的:探讨在体外诱导型多潜能干细胞(IPS)能否遵循正常肝脏发育途径定向分化为具备良好生理功能的肝细胞。方法:根据正常肝脏体内发育的规律,序贯应用肝脏发育所需的生长因子,设计特色培养基,诱导IPS细胞遵循正常发育途径定向高效分化为肝细胞:首先将IPS细胞定向分化为前层确定性内胚层细胞(ADE),再进一步分化为肝细胞。结果:在本研究中IPS细胞在体外可循正常发育通路定向诱导为肝细胞:先分化为前层内胚层细胞,再继续分化为肝细胞。分化的各时段实时定量RT-PCR检测显示:在mRNA表达的水平,IPS细胞经历了肝细胞在体内从胚胎干细胞的发育过程,内胚层细胞特异性RNA如CXCR4、Sox17和FOXA2在分化的早期明显升高,而早期肝细胞特异性RNA如HNF4和AFP在分化的中期开始升高,肝细胞成熟特异性RNA如白蛋白在分化的晚期才达高峰,同时IPS细胞的未分化标记RNA如OCT4在早期就明显下调。同mRNA表达一致,在分化的第20d,大部分的肝脏细胞表达甲胎蛋白和白蛋白(阳性率80%)。更为重要的是IPS来源肝细胞在体外具有典型成熟肝细胞的功能,能够摄取和释放靛青绿(ICG)并具有药物代谢酶细胞色素P450酶的活性。结论:IPS细胞在体外能够遵循正常肝脏发育通路,序贯表达肝脏发育各阶段的特色基因和蛋白,能够高效分化为有功能的肝细胞,本研究可能为临床终末期肝病进行细胞治疗提供肝细胞。     

Differentiation of mouse-induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes in vitro

In order to investigate the effective method to induce mice-induced pluripotent stem (miPS) cells into cardiomyocytes in vitro and to investigate the effect of vitamin C on cardiomyocyte differentiation from miPS cells to find a highly efficient and clinically safe method. MiPS cells were isolated and expanded to form embryoid bodies (EBs) using the hanging drop way. EBs were induced using differentiation medium containing vitamin C (10^?4 mmol/ml). The control group did not receive any form of inducer. The time and frequency at which beating cardiomyocytes appeared and the percentage of beating colonies were determined to investigate the function of vitamin C on cardiac myocytes differentiation from miPS cells. Beating cell areas were found in (62.5 ± 1.7%) of EBs when using differentiation medium containing vitamin C, which was at a significantly greater frequency than in the control group (7.6 ± 2.6%). Beating cardiomyocytes within the two groups were positive for troponin (cTnT) staining. Vitamin C markedly increased the productivity of miPS cell differentiation into cardiomyocytes, as supported by expression of the unique cardiac protein cTnT. The vitamin C is suitable candidate for the induction of miPS cell differentiation into cardiomyocytes in vitro.