脐带间充质干细胞无血清培养体系的筛选

目的：筛选培养脐带间充质干细胞的无血清培养基。方法：采集新生儿脐带标本,将脐带剪成组织碎块,随机分为A组、B组、C组,分别加入MesenCult、Ultraculture和AM-V 3种不同的无血清培养基进行培养。观察3组脐带原代细胞游出时间和细胞形态,检测细胞的增殖能力、分化能力和表面抗原的表达。结果：A组、B组、C组原代细胞从组织块长出的平均时间分别是17 d、6 d、7 d。显微镜下观察可见,从组织块游出的细胞散在分布,呈短梭形或多角形,形态饱满,折光性好,生长融合时A组和B组细胞呈旋涡状生长,细胞折光性好,大小均一,C组细胞细长,折光性稍差,无明显的旋涡状生长的特征。3组均表达CD105、CD90、CD73抗原,不表达CD34、CD45、HLA-DR抗原;3组各标志物的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。3组间充质干细胞均具有向成脂细胞、成骨细胞分化的能力,C组分化能力弱于A组和B组。结论：B组培养体系用时较短,干细胞特性保持较好,价格适宜,可以作为大规模培养人间充质干细胞的首选培养基。     

脐带间充质干细胞无血清培养的实验研究

目的建立一种简单的体外无血清培养扩增人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）的方法。方法利用酶消化法分离hUCMSCs,在无血清干细胞培养体系下培养扩增,进行形态学观察,CCK-8法分析细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞表面抗原表达及细胞周期,进行成骨、成脂诱导分化。结果hUCMSCs呈典型的成纤维细胞形态,具有较强的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈阳性表达,而CD34、CD45呈阴性表达。3周可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用酶消化法和无血清的培养体系能够快速分离培养出大量hUCMSCs,该方法扩增得到的间充质细胞具备稳定的细胞标记物和生长状态,可用于各种治疗的临床试验。     

无动物源成分培养基用于人脐带间充质干细胞培养的研究

目的建立一种无动物源成份无血清的间充质干细胞培养基XF/SF-MSCM,并探讨其支持人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)体外增殖、维持分化潜能的效果。方法组织块贴壁法分离获得原代人脐带间充质干细胞,P1代起分别使用自制的XF/SF-MSCM培养基与含10%胎牛血清的传统培养基(SC-MSCM)对脐带间充质干细胞进行连续培养传代至P6代,观察比较两组P6代细胞的形态及增殖能力,以流式细胞术检测连续传代后细胞的免疫学表型,比较其成骨、成脂肪的分化潜能。结果分离获得的原代P0脐带间充质干细胞,分别在XF/SFMSCM与SC-MSCM两种培养基中连续培养传代,细胞增殖能力及形态无显著差别。两组P6代细胞的生长曲线相似,但XF/SF-MSCM组间充质干细胞贴壁的紧密程度稍低;流式细胞检测结果显示,XF/SF-MSCM组细胞保持了间充质干细胞的免疫学表型,高表达CD29、CD44、CD90,不表达CD31、CD34、CD45并维持了良好的成骨和脂肪细胞的分化能力。结论本室制备的无动物源成份无血清培养基XF/SF-MSCM可支持脐带间充质干细胞的体外扩增,维持其免疫学表型及分化潜能,提供数量充足的高质量间充质干细胞,满足临床治疗及生物医学研究的需要。     

无血清培养基对深低温冻存复苏后的间充质干细胞免疫功能的研究

目的:探讨无血清培养基对冻存后的间充质干细胞（HUC-MSCs）免疫调节功能的影响,明确其成脂成骨生物学特性,为临床应用奠定基础。方法:（1）分离脐带中的HUC-MSCs,传代纯化后深低温冻存。（2）冻融后的HUC-MSCs分别以含10%胎牛血清的培养基（SCM）,无血清培养基两种培养条件培养。（3）观察两组细胞生长状态,革兰染色计数,计算细胞活率。（4）流式细胞术检测两组细胞的表面标志物。（5）成脂成骨诱导,茜红素染色和油红染色观察诱导情况。结果:（1）两组细胞均以漩涡状贴壁,无血清培养基培养的细胞体积略小。（2）在细胞总数及活性方面,两组细胞有些微差异,可忽略不计。（3）流式细胞术显示其对PE-CD34不表达,对PE-CD105、PE-CD90、PE-CD73、PE-CD44和PE-CD29高表达。（4）对无血清培养基（SFM）所培养得到的HUC-MSCs历经约21 d的成骨细胞和脂肪细胞专向分化诱导,发现其具有可媲美SCM培养的HUC-MSCs的分化能力。结论:无血清培养基同有血清培养基相比,对深低温冻存复苏后的间充质干细胞免疫调节功能无明显差异,可替代有血清培养基进行细胞培养。     

BHA诱导人脐带间充质干细胞分化为神经细胞

目的:探讨丁基羟基茴香醚(BHA)能否将人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)诱导分化为神经细胞.方法:正常培养的第4代hUC-MSCs利用200 μmol·L-1 BHA加2 mmol·L-1巯基乙醇(β-ME)进行诱导.每12 h观察细胞形态变化,并于诱导后24和72 h收集细胞,提取RNA,RT-PCR检测基因表达情况,于第3天进行免疫荧光染色.结果:诱导12 h后即有少量细胞发生形态变化,随着时间的推移变化越来越明显,72 h时绝大部分细胞都已变成神经细胞形态.免疫荧光染色nestin、GFAP及NSE阳性.RT-PCR检测诱导后24 h开始有nestin、MAP及NF-L表达,72 h后nestin和NF-L表达减少,MAP表达增强,同时NeuroD1也有较强表达,表明此时已分化为成熟的神经元细胞.结论:BHA能快速地将hUC-MSCs诱导分化为神经细胞.     

当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的：研究当归体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的作用。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养。MSC用20μl当归注射液／ml含10％胎牛血清的L—DMEM为预诱导条件，预诱导24h后用当归注射液100μl/ml不含胎牛血清的L—DMEM进行诱导。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。当归诱导3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE及nestin呈阳性、GFAP性。结论:大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

清脑灵诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞

目的观察清脑灵煎剂是否能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞。方法通过贴壁法分离获得大鼠骨使髓间充质干细胞,体外扩增培养,用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。用浓度为1mg/mL的清脑灵煎剂诱导MSCs,分别于5h、12h、1d、3d、7d在倒置显微镜下观察细胞形态变化,用免疫细胞化学方法观察被诱导细胞巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果流式细胞仪检示MSCs不表达CD11b、CD45,诱导后细胞的免疫细胞化学示nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阴性细胞。结论清脑灵能诱导MSCs分化神经元样细胞。     

无血清培养基分离培养脐带间充质干细胞的研究

目的探讨应用无血清培养体系分离培养脐带间充质干细胞,明确其成骨生物学特性,为临床应用奠定实验基础。方法在无血清干细胞培养体系下,利用组织块贴壁培养法分离培养,扩增脐带间充质干细胞,在倒置显微镜进行形态学观察,流式细胞检测鉴定其表面标记CD34、CD44、CD90及CD45的表达,成骨诱导液培养2～3周后观察其细胞形态学变化,茜素红染色鉴定其成骨情况。结果脐带组织块接种后第1次更换培养液12h后,有少量梭形的细胞从脐带组织边缘爬出,培养5～6d左右成单层状生长,12d左右梭形状细胞呈现复层生长趋势,细胞表面标记CD44、CD90均呈阳性为间充干细胞来源,CD34、CD45均呈阴性为非造血干细胞来源;细胞经成骨诱导2～3周后具有良好的分化成骨能力。结论利用无血清的人间充质干细胞专用培养基培养体系,脐带组织培养法能够分离培养出大量的脐带间充质干细胞,避免了培养中异种蛋白的混入而降低临床排异反应。     

人脐带间充质干细胞的培养鉴定及其向神经元细胞分化的研究

目的研究脐带间充质干细胞（UC-MSCs）在体外分离、培养、扩增和鉴定以及向神经元分化的方法.方法 30例符合入选标准的脐带采用贴壁法分离得到UC-MSCs,选用20%FBS血清培养液进行原代培养,再选用10%FBS扩增培养液进行一般传代.用神经分化培养基诱导UC-MSCs向神经细胞分化,在荧光显微镜下观察细胞形态,透射电镜观察UC-MSCs超微结构,用流式细胞仪分析其表面特性,采用直接和间接免疫荧光法检测细胞悬浮液的表型特征,用抗人神经纤维M、突触素、微管蛋白、半乳糖神经酰胺的单克隆抗体检测各代之间神经诱导形成率.结果 12 h后细胞开始贴壁生长,超微结构观察表现出未分化细胞的特征,CD123、CD49、CD29、CD73和CD166均为阳性,免疫荧光检测人UC-MSCs分化成神经细胞.结论 UC-MSCs长期传代培养,生物学特性稳定,具有向神经细胞分化的潜能.     

人脐带间充质干细胞体外培养的生物学特性研究

目的建立人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外培养的方法,探讨该方法培养的脐带间充质干细胞特性及分化潜能。方法用新取的脐带制成细胞悬液,放入含10%胎牛血清的DMEM/F-12混合培养基培养,动态观察原代培养细胞的生长过程。取生长状态良好的第三代细胞(P3),MTT检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测表面标志物CD29、CD44、CD31、CD45、CD34,鉴定hUC-MSCs;诱导hUC-MSCs分化成为脂肪细胞,鉴定所分离的hUC-MSCs具有多向分化能力。结果来源于人脐带培养的MSCs呈现梭形生长,经流式细胞仪检测示CD29(98.3%)、CD44(99.2%)阳性,CD34(0.3%)、CD31(0.8%)、CD45(0.4%)阴性,经过诱导分化,证实hUC-MSCs有成脂分化潜能。结论采自脐带标本分离培养可获得稳定、均质性良好的hMSCs,并具有多向分化能力。     

Targeted induction of differentiation of human bone mesenchymal stem cells into neuron-like cells

A systematic method of isolating and culturing human bone mesenchymal stem cells （hMSCs）, and inducing them to differentiate into neuron-like cells in vitro was established. The hMSCs were isolated from bone marrow with the lymphocyte-separating medium, cultured and expanded in vitro, and induced after addition of compound neuro-revulsants. The morphological changes of hMSCs were observed, and the expression of surface markers in induced hMSCs was immunocytochemically identified during induction period. The hMSCs could be separated, cultured and expanded in vitro. After induction by compound neuro-revulsants for 48 h, the changes of neuron-like cells, such as cellular shrinkage and neurite growth, were observed in some cells. The immunochemical staining revealed nestin （＋） or NF （＋）, and GFAP （-）. It was concluded that hMSCs were successfully cultured and induced to differentiate into neuron-like cells.     

BDNF基因转染促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的: 将脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)基因转入骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC),使其作为种子细胞和基因治疗的载体将BDNF基因导入脊髓损伤组织,为探索一种更为有效的脊髓损伤治疗方法提供实验基础。方法: 分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞;实验组应用已构建的pEGFP-N1-BDNF进行基因转染,空质粒组用pEGFP-N1空质粒进行转染,阴性对照组只加入培养基,并进行Western 印迹分析;将转染BDNF的实验组、转染空质粒组和未转染的阴性对照组细胞在体外向神经元样细胞诱导分化,比较3组细胞诱导后神经元样细胞分化率,并进行统计学分析。结果: 流式细胞检测培养细胞CD90(+),CD44(+), CD34(-)、CD45(-);经Western印迹检测证实实验组MSC表达BDNF-EGFP;实验组细胞向神经元样细胞分化率高于空质粒组和未转染的阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论: BDNF基因转染MSC后,可以促进其向神经元样细胞分化,BDNF在MSC向神经元样细胞分化过程中具有重要作用。     

脐血间质干细胞肌源性诱导后细胞生理变化

目的探讨5-氮胞苷(5-aza)、心肌细胞裂解液和心肌诱导液等三种肌源性诱导方法对脐血间质干细胞(MSCs)生理性质的影响。方法MSCs以密度梯度离心法取自足月妊娠犬,免疫组化检测细胞表面抗原,经5-aza、心肌细胞裂解液和心肌诱导液诱导后,Western blotting检测心肌转录因子Nkx2.5的表达,膜片钳检测细胞动作电位,激光共聚焦显微镜检测细胞内游离Ca2 浓度的变化。结果MSCs表达CD29和CD71,不表达CD11a、CD11b和CD34;诱导后三组细胞均有Nkx2.5的表达,5-aza和心肌细胞裂解液诱导后的细胞可检测到动作电位,三组细胞胞内Ca2 浓度不同。结论肌源性诱导后的MSCs只部分具有心肌细胞的生理特性,功能上与心肌细胞的差异仍较为显著。     

脐带间质干细胞多向分化潜能的鉴定

目的:研究脐带间质干细胞的多向分化潜能,为心血管组织工程研究提供一个新的种子细胞来源?方法:采用胶原酶胰酶消化脐带组织,将获得的细胞传代培养,流式细胞仪鉴定细胞表面分子,再以不同方法使其向骨?脂肪?心肌和内皮细胞方向诱导,分别采用Von Kossa?油红O染色和免疫组化对分化的细胞进行鉴定?结果:脐带间质干细胞分别向成骨细胞和成脂肪细胞诱导培养后,Von Kossa染色和油红O染色阳性?在5-氮胞苷诱导后,心肌特异性抗体肌动蛋白α-actin和肌球蛋白myosin免疫组化染色阳性?在VEGF诱导后,细胞形成网格样结构,免疫荧光示CD31?CD34染色阳性?结论:脐带间质干细胞具有分化为骨?脂肪?心肌和内皮细胞的潜能,是非常有前途的心血管组织工程种子细胞来源?     

转录因子诱导人脐带间充质干细胞转分化为视网膜色素上皮样细胞的研究

目的 探讨采用关键转录因子将人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)转分化为视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)样细胞的方法。方法 通过流式细胞技术鉴定hUC-MSCs的表面标记分子;通过诱导hUC-MSCs分化成为脂肪、骨和软骨细胞确定其多系分化能力;采用慢病毒包装系统获得分别含有11个转录因子Sox2、Pax6、Rax、Six6、Nr2e1、Otx2、Lhx2、Crx、Mitf-A、Klf4和c-Myc的病毒,并通过感染hUC-MSCs来诱导hUC-MSCs向RPE样细胞分化。结果 hUC-MSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,但不表达CD11b、CD34, CD45和HLA-DR等分子标记,在成脂、成骨、成软骨分化培养基中可分化为脂肪、骨和软骨细胞。视网膜及RPE发育相关的关键转录因子能够将hUC-MSCs直接转分化为RPE样的细胞,并表达ZO-1、RPE65、Bestrophin-1(Best-1)、CK8/18、Cralbp、Mertk、Tyrosinase(Tyr)、PEDF等RPE细胞的特征分子。结论 视网膜及RPE发育相关的关键转录因子可直接将hUC-MSCs分化为RPE样细胞。     

非病毒诱导体系高效诱导脐带来源间充质干细胞向胰岛细胞分化

目的探讨非病毒法诱导脐带来源间充质干细胞(UC-MSC)向胰岛素分泌细胞分化的可行性,为胰岛细胞移植治疗糖尿病提供临床移植数量级的细胞。方法从人脐带分离间充质干细胞,体外分阶段诱导分化为胰岛细胞。采用RT-PCR方法比较胰岛细胞分化过程中转录因子foxa2、sox17、pdx1、ngn3、pax4、insulin和glut-2在诱导组和非诱导组中的表达水平;免疫荧光染色方法检测胰岛素和C-肽在诱导终末阶段细胞中的表达定位;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测胰岛素及C-肽的分泌以及细胞对葡萄糖刺激的反应性。结果诱导第1阶段末,诱导后细胞foxa2和sox17的表达明显高于未诱导细胞(P均<0.05);诱导第2阶段末,诱导细胞pdx1、ngn3和pax4的表达明显高于未诱导细胞(P均<0.05);诱导第3阶段末,诱导细胞的insulin和glut-2表达明显高于未诱导细胞(P均<0.05)。免疫荧光染色结果显示,胰岛素和C-肽均表达于诱导终末分化阶段的细胞,效率可达90%以上。ELISA检测结果显示,诱导第3阶段末细胞胰岛素总量为(346.3 739±32.5 149)μU/ml,明显高于未诱导细胞的(17.69...     

人脐带间充质干细胞在脊髓损伤修复中的研究进展

脊髓损伤发病率和致残率高,至今尚无完全修复损伤脊髓的治疗方法。随着干细胞移植技术的发展,有望从根本上修复损伤的脊髓。而在所有干细胞中,人脐带间充质干细胞可能是最佳的移植选择。动物研究已证实人脐带间充质干细胞具有巨大的脊髓损伤修复潜力,但临床转化并不顺利。本文将着重讨论人脐带间充质干细胞对脊髓损伤的神经修复机制,以及临床最佳移植途径、剂量、时机和临床安全性、有效性。     

人类脐带血间充质干细胞的培养及鉴定

目的对人类脐带血中的有核细胞进行分离培养及鉴定,观察能否得到间充质干细胞。方法抽取人类脐带静脉血,进行细胞分离和培养,并进行荧光激活细胞分析。结果脐带血中间充质干细胞与骨髓中的类似,其外表呈纤维样;流式细胞术鉴定结果表明这种细胞能表达CD29、CD44、CD90、CD95、CD105、CD166以及MHCⅠ(组织相容性抗原复合体Ⅰ),但不能表达CD14、CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、CD117、CD152以及MHCⅡ(组织相容性抗原复合体Ⅱ);并且具有分化成骨细胞和脂肪细胞的潜能。结论可以从人类脐带血中成功分离培养得到间充质干细胞。