角膜缘干细胞克隆化培养影响因素的研究

目的探讨丝裂霉素C处理Swiss3T3成纤维细胞作为饲细胞的条件,了解兔角膜缘干细胞克隆化培养的增殖状况。设计对照实验研究。研究对象兔角膜缘干细胞单纯培养组,兔角膜缘干细胞与Swiss3T3成纤维细胞作为饲细胞的混合培养组。方法采用DMEM/F12培养基进行细胞培养,观察4.0μg/ml丝裂霉素C作用不同时间后3T3细胞数量的变化。DispaseⅡ酶消化兔角膜缘上皮细胞,与饲细胞混合接种,观察干细胞克隆形成情况,比较各代、各组的细胞克隆形成率(CFE)。用EDTA去除饲细胞,间接免疫荧光染色检测角膜缘干细胞克隆团表达增殖细胞核抗原(PCNA)情况。主要指标细胞数/毫升,细胞克隆形成率。结果4.0μg/ml丝裂霉素C处理2.5小时的Swiss3T3细胞,培养期间(约12日)细胞数量无明显变化,可作为饲细胞。与饲细胞共同培养的兔角膜缘干细胞形成细胞克隆团,细胞的平均CFE比较:有饲细胞组角膜缘干细胞明显高于无饲细胞组(t=2.982,P<0.01)。兔角膜缘干细胞冻存复苏后平均CFE比较,有饲细胞组明显高于无饲细胞组(t=3.007,P<0.01)。兔角膜缘干细胞克隆团中细胞PCNA染色为阳性。结论角膜缘干细胞与作为饲细胞的Swiss3T3成纤维细胞共同培养形成细胞克隆,其中含有干细胞,且具有高增殖力。     

角膜缘干细胞标志物的研究进展

角膜缘干细胞(LSCs)通过不断地增殖分化维持着角膜上皮的完整性和内稳态，对保护角膜和维持角膜透明性起着重要的作用。角膜缘干细胞缺乏症(LSCD)是目前角膜疾病致盲的主要原因之一，LSCs移植是治疗的热点。移植的有效性主要取决于LSCs占移植细胞总数的比例，因此明确识别LSCs至关重要。虽然LSCs标志物有很多，但它们的特异性备受争议，故LSCs移植的主要挑战之一是缺乏明确的细胞标记物。本文将对LSCs标志物的最新研究进展做一综述。     

联合标记在角膜缘干细胞鉴别中的应用

角膜缘干细胞是角膜上皮更新和修复的来源,眼表正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成.近年来,眼角膜缘干细胞的定位与鉴别也有了进一步发展,大量证据显示角膜缘干细胞位于角膜缘区域的微生境(niche)内,对微生境进行角膜缘相关标记物的研究也发现其区域内大量细胞高表达干细胞的相关标记.然而,到目前为止任何一种单独的标记物均不能特异性地鉴别角膜缘干细胞,而较可靠的方法是标记物的联合应用,或联合角膜缘于细胞自身的一些特征如小细胞特性、慢细胞周期特性等来进行鉴别.本文就角膜缘干细胞的鉴别以及联合标记在干细胞鉴别中的应用作一综述.     

联合标记在角膜缘干细胞鉴别中的应用

角膜缘干细胞是角膜上皮更新和修复的来源,眼表正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成.近年来,眼角膜缘干细胞的定位与鉴别也有了进一步发展,大量证据显示角膜缘干细胞位于角膜缘区域的微生境(niche)内,对微生境进行角膜缘相关标记物的研究也发现其区域内大量细胞高表达干细胞的相关标记.然而,到目前为止任何一种单独的标记物均不能特异性地鉴别角膜缘干细胞,而较可靠的方法是标记物的联合应用,或联合角膜缘于细胞自身的一些特征如小细胞特性、慢细胞周期特性等来进行鉴别.本文就角膜缘干细胞的鉴别以及联合标记在干细胞鉴别中的应用作一综述.     

联合标记在角膜缘干细胞鉴别中的应用

角膜缘干细胞是角膜上皮更新和修复的来源,眼表正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成.近年来,眼角膜缘干细胞的定位与鉴别也有了进一步发展,大量证据显示角膜缘干细胞位于角膜缘区域的微生境(niche)内,对微生境进行角膜缘相关标记物的研究也发现其区域内大量细胞高表达干细胞的相关标记.然而,到目前为止任何一种单独的标记物均不能特异性地鉴别角膜缘干细胞,而较可靠的方法是标记物的联合应用,或联合角膜缘于细胞自身的一些特征如小细胞特性、慢细胞周期特性等来进行鉴别.本文就角膜缘干细胞的鉴别以及联合标记在干细胞鉴别中的应用作一综述.     

联合标记在角膜缘干细胞鉴别中的应用

角膜缘干细胞是角膜上皮更新和修复的来源,眼表正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成.近年来,眼角膜缘干细胞的定位与鉴别也有了进一步发展,大量证据显示角膜缘干细胞位于角膜缘区域的微生境(niche)内,对微生境进行角膜缘相关标记物的研究也发现其区域内大量细胞高表达干细胞的相关标记.然而,到目前为止任何一种单独的标记物均不能特异性地鉴别角膜缘干细胞,而较可靠的方法是标记物的联合应用,或联合角膜缘于细胞自身的一些特征如小细胞特性、慢细胞周期特性等来进行鉴别.本文就角膜缘干细胞的鉴别以及联合标记在干细胞鉴别中的应用作一综述.     

联合标记在角膜缘干细胞鉴别中的应用

角膜缘干细胞是角膜上皮更新和修复的来源,眼表正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成.近年来,眼角膜缘干细胞的定位与鉴别也有了进一步发展,大量证据显示角膜缘干细胞位于角膜缘区域的微生境(niche)内,对微生境进行角膜缘相关标记物的研究也发现其区域内大量细胞高表达干细胞的相关标记.然而,到目前为止任何一种单独的标记物均不能特异性地鉴别角膜缘干细胞,而较可靠的方法是标记物的联合应用,或联合角膜缘于细胞自身的一些特征如小细胞特性、慢细胞周期特性等来进行鉴别.本文就角膜缘干细胞的鉴别以及联合标记在干细胞鉴别中的应用作一综述.     

联合标记在角膜缘干细胞鉴别中的应用

角膜缘干细胞是角膜上皮更新和修复的来源,眼表正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成.近年来,眼角膜缘干细胞的定位与鉴别也有了进一步发展,大量证据显示角膜缘干细胞位于角膜缘区域的微生境(niche)内,对微生境进行角膜缘相关标记物的研究也发现其区域内大量细胞高表达干细胞的相关标记.然而,到目前为止任何一种单独的标记物均不能特异性地鉴别角膜缘干细胞,而较可靠的方法是标记物的联合应用,或联合角膜缘于细胞自身的一些特征如小细胞特性、慢细胞周期特性等来进行鉴别.本文就角膜缘干细胞的鉴别以及联合标记在干细胞鉴别中的应用作一综述.     

联合标记在角膜缘干细胞鉴别中的应用

角膜缘干细胞是角膜上皮更新和修复的来源,眼表正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成.近年来,眼角膜缘干细胞的定位与鉴别也有了进一步发展,大量证据显示角膜缘干细胞位于角膜缘区域的微生境(niche)内,对微生境进行角膜缘相关标记物的研究也发现其区域内大量细胞高表达干细胞的相关标记.然而,到目前为止任何一种单独的标记物均不能特异性地鉴别角膜缘干细胞,而较可靠的方法是标记物的联合应用,或联合角膜缘于细胞自身的一些特征如小细胞特性、慢细胞周期特性等来进行鉴别.本文就角膜缘干细胞的鉴别以及联合标记在干细胞鉴别中的应用作一综述.     

联合标记在角膜缘干细胞鉴别中的应用

角膜缘干细胞是角膜上皮更新和修复的来源,眼表正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成.近年来,眼角膜缘干细胞的定位与鉴别也有了进一步发展,大量证据显示角膜缘干细胞位于角膜缘区域的微生境(niche)内,对微生境进行角膜缘相关标记物的研究也发现其区域内大量细胞高表达干细胞的相关标记.然而,到目前为止任何一种单独的标记物均不能特异性地鉴别角膜缘干细胞,而较可靠的方法是标记物的联合应用,或联合角膜缘于细胞自身的一些特征如小细胞特性、慢细胞周期特性等来进行鉴别.本文就角膜缘干细胞的鉴别以及联合标记在干细胞鉴别中的应用作一综述.     

去除型人皮肤成纤维饲细胞系的建立及其重建角膜表层的研究

目的探讨去除型人皮肤成纤维饲细胞系的建立及其重建角膜表层的相关研究。方法将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、端粒酶逆转录酶(hTERT)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)3种基因导入人皮肤成纤维细胞,建立荧光标记的永生化的可去除型TERT+TK-D人源饲细胞系。将创建的细胞系经丝裂霉素C处理后作为饲养细胞与人角膜缘干细胞共培养,并与3T3饲细胞的培养结果作比较。结果 TERT+TK-D细胞系在体外经过6个月的连续传代后仍然表达绿色荧光蛋白,保持旺盛的分裂能力,对更昔洛韦敏感。TERT+TK-D组的克隆形成率(colony forming efficiency,CFE)为(11.77±0.21)%,与3T3组CFE[(12.8±1.61)]%比较,差异无统计学意义(P=0.332);经过共培养,两组都形成了4～5层复层上皮细胞片。角膜缘干细胞克隆和上皮细胞片的免疫荧光染色及Real-time PCR定量分析结果显示,TERT+TK-D组角蛋白K3表达低于3T3组;PCR结果证实TERT+TK-D饲细胞在更昔洛韦作用下凋亡、裂解,没有混入培养获得的角膜上皮细胞片中。结论转基因荧光标记的永...     

角膜缘微环境细胞的研究进展

角膜缘微环境细胞（limbal niche cell,LNC）是近年来发现的一种来自于角膜缘干细胞微环境且具有血管内皮祖细胞和间充质干细胞特性的多能干细胞。LNC具有分化为血管内皮细胞、角膜上皮细胞、角膜基质细胞等多种细胞的潜能。体外实验发现,LNC在三维立体培养环境中可以维持角膜缘干细胞的特性;动物实验发现,LNC可以预防和治疗碱烧伤所致的角膜缘干细胞缺乏。LNC还可以促进角膜基质的无瘢痕修复,减少修复过程中的新生血管化,提示其可以重建角膜基质。因此,在角膜缘干细胞缺乏、角膜基质损伤等疾病的治疗中,LNC可能是一种理想的治疗细胞。     

3D共培养模型对体外培养兔角膜缘干细胞的影响

目的　探讨三维（three-dimension，3D）共培养模型对体外扩增兔角膜缘干细胞（limbal stem cells，LSCs）的作用。方法　体外培养兔LSCs，以牙周膜干细胞（human periodontal stem cell，HPDLSCs）作为饲细胞建立共培养模型，根据载体不同分为3组，纤维蛋白胶组:将兔LSCs、HPDLSCs、纤维蛋白胶3D共培养；羊膜组:将兔LSCs、HPDLSCs、羊膜3D共培养；对照组:将兔LSCs、HPDLSCs共培养。共培养5 d后，用倒置显微镜、HE染色、扫描电镜观察兔LSCs的细胞形态，采用免疫荧光染色检测各组兔LSCs阳性标志物p63的表达，并比较各组p63的阳性率。结果　共培养5 d后，倒置显微镜、HE染色观察细胞形态，羊膜组、纤维蛋白胶组细胞排列紧密，呈大小不等的团块状集落，细胞大小基本一致；对照组细胞排列相对稀疏；扫描电镜下观察见纤维蛋白胶组和羊膜组细胞与载体贴附良好。免疫荧光染色显示纤维蛋白胶组、羊膜组和对照组LSCs的p63阳性率分别为（69.93±8.76）％、（78.36±8.56）％和（58.59±8.31）％，三组间总体比较差异有统计学意义（F=9.43，P=0.000）。两两比较中纤维蛋白胶组、羊膜组LSCs的p63阳性率均大于对照组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。纤维蛋白胶组、羊膜组的p63阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论　以纤维蛋白胶、羊膜作为载体，HPDLSCs作为饲细胞的3D共培养模型有助于体外扩增兔LSCs。     

角膜缘干细胞体外培养的研究进展

角膜缘干细胞是位于角膜缘Vogt栅栏区的一种成体单能干细胞,其可通过自我更新以补充角膜上皮的损伤修复,在维持正常角膜上皮完整性、角膜透明度以及维持正常视力中发挥着重要作用。各种原因造成的角膜缘干细胞缺失将导致患者角膜混浊、眼表血管化,最终失明,目前治疗相关疾病的主要方法为体外培养角膜缘干细胞后再行移植治疗,其中如何高效地体外扩增角膜缘干细胞成为治疗成功与否的关键,本文就角膜缘干细胞定位、获取方法以及体外扩增方式等进行综述。     

角膜缘干细胞龛的概念及其研究进展

干细胞龛是成体干细胞的集中存储部位,通过特定的细胞外基质和龛细胞提供特殊的微环境,对维持干细胞的高增殖力和诱导定向分化起关键作用.角膜缘干细胞(LSC)是目前公认的角膜上皮的成体干细胞,其相关理论基础与临床研究发展迅速,但是,目前对LSC龛的了解略显滞后.本文对LSC龛在角膜缘上皮小囊结构的定位;龛环境中血清源性和基质细胞源性细胞因子引发LSC胞内特定的信息通路;受损的角膜缘龛环境影响LSC的存活和功能以及LSC体外培养中通过羊膜载体重建龛环境等重要问题进行归纳,分析了LSC龛的研究现状.     

Partial enrichment of a population of human limbal epithelial cells with putative stem cell properties based on collagen type IV adhesiveness

The concept that corneal epithelium stem cells reside in limbus has been recognized for more than a decade, but isolation of these stem cells has not been accomplished. This study was an initial attempt to isolate a population of human limbal epithelial cells enriched for certain putative stem cell properties based on their phenotype. Epithelial cells harvested from fresh human limbal rings and their primary cultures were allowed to adhere to collagen IV-coated dishes for 20 min and 2 hr, sequentially. The rapidly adherent cells (RAC), slowly adherent cells and non-adherent cells were evaluated for certain stem cell properties: (a) BrdU-label retention, (b) expression of basal cell (integrin beta1, p63, ABCG2) and differentiation (involucrin, keratin 12) markers, and (c) colony forming efficiency (CFE) and growth capacity on a 3T3 fibroblast feeder layer. Among unfractionated cells and the three selected populations, the RAC, accounting for about 10% of whole population, were enriched 5-fold in BrdU label-retaining cells, displayed the highest number of integrin beta1 and p63 positive and involucrin negative cells, expressed high levels of DeltaNp63 and ABCG2 mRNA, and lacked involucrin and K12 expression, and possessed the greatest CFE and growth capacity. These findings demonstrated for the first time that human limbal epithelial cells with stem cell properties can be partially enriched by their adhesiveness to collagen IV. The RAC population enriched for certain putative stem cell properties may prove useful in the future for transplantation to diseased and damaged corneas with limbal stem cell deficiency.     

培养兔自体角膜缘干细胞移植的实验研究

目的 观察以羊膜为载体的兔角膜缘于细胞膜片移植治疗兔角膜缘于细胞缺损的效果。方法 制造兔角膜缘干细胞缺损的动物模型,以右眼为实验眼,从兔左眼取角膜缘组织,将兔角膜缘干细胞消化下来,接种于铺有羊膜的无菌六孔培养板中,待细胞形成多层角膜上皮细胞后,对兔角膜缘干细胞缺损动物模型行角膜缘干细胞羊膜移植术,并对治疗后的角膜进行裂隙灯及病理学检查。结果 临床和组织病理学染色证实：体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上继续增生、分化为多层角膜上皮细胞;角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整、基质细胞浸润减轻、新生血管减少或消失。结论 应用角膜缘干细胞羊膜移植术可恢复其角膜上皮结构的完整性,减少角膜新生血管的形成,维持角膜缘的细胞屏障功能。     

培养角膜缘干细胞羊膜移植治疗碱烧伤动物的实验研究

目的 观察培养生长于羊膜的角膜缘干细胞移植的治疗角膜缘碱烧伤伤的效果。方法 将兔角膜缘干细胞在的代培养后接种于羊膜,对新西兰大白兔角膜缘碱烧伤动物模型行角膜缘干细胞羊膜移植术,并对治疗后的角膜进行临床及病理学检查。结果 体外培养的兔角膜缘士细胞可在羊膜上继续增殖、分化为密集的角膜上皮细胞层;角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整基质细胞浸润减轻、新生血管减少。组织病理学染色证实,角膜缘     

兔角膜缘上皮细胞端粒酶表达的实验研究

目的探讨将角膜上皮各区域表层和基底层细胞端粒酶作为角膜缘干细胞标志物的可能性。方法采用端粒重复序列扩增(TRAP)方法分别对8只新西兰大白兔(8只眼)角膜缘和中央透明角膜上皮细胞端粒酶活性进行定性分析,并利用生物发光技术对角膜缘和中央透明角膜上皮细胞端粒酶活性进行定量分析。其中4只兔(4只眼)结膜下注射5氟尿嘧啶(5-Fu)20mg,4只兔(4只眼)未注射任何药物。结果8只兔眼透明角膜上皮细胞平均生物发光值为34912,端粒酶表达均为阴性;角膜缘上皮细胞平均生物发光值为165575,端粒酶表达均为阳性,二者比较差异有统计学意义(P=0．001)。5-Fu注射组角膜缘上皮细胞平均生物发光值为185396,未注射5-Fu组角膜缘上皮细胞平均生物发光值为145754,二者比较差异有统计学意义(P=0．02)。阳性对照组生物发光值为210832,阴性对照组生物发光值为34793。结论角膜缘上皮细胞端粒酶表达阳性而透明角膜上皮细胞表达阴性,表明角膜缘存在具有极强增殖能力的干细胞,端粒酶可能成为角膜干细胞的标志物。