人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化

目的: 建立体外分离培养获得人脂肪间充质干细胞（human adipose derived mesenchymal stem cells,hADSCs）的方法,并观察其形态、免疫表型、生物学特性。初步探讨其体外成骨过程中出现成脂现象的原因及机制。方法 ： 剖宫产手术获得腹部皮下脂肪,0.15%Ⅰ型胶原酶消化法获得人脂肪间充质干细胞并进行体外培养。行MTT细胞增殖实验绘制增殖曲线,使用流式细胞及细胞免疫荧光技术检测细胞表面抗原,行成骨成脂分化鉴定其分化潜能。通过RT PCR技术检测成骨成脂过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ 2（peroxisome proliferator activated receptorγ 2,PPARγ 2）和骨桥蛋白mRNA表达情况。结果 ： 通过分离培养,获得了大量旋涡状生长的人脂肪间充质干细胞。MTT法显示细胞增殖能力强。流式细胞鉴定结果显示,CD29、CD73、CD105、CD166高表达,CD31、CD34、CD45、HLA DR低表达。细胞免疫荧光结果与之相符。hADSCs在特定诱导条件下,具有成骨成脂分化潜能。在成骨分化过程中同时伴有成脂发生。RT PCR结果显示,与对照组相比,成脂诱导组PPARγ 2 mRNA有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,成骨诱导组骨桥蛋白,PPARγ 2 mRNA均有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论： 建立了一种分离培养hADSCs简单可靠的方法。获得的细胞具有贴壁生长、增殖活性强、干细胞表型以及多向分化等特征。hADSCs体外成骨过程中,三酰甘油的形成对成骨具有一定的促进作用。     

Tribbles同源蛋白3抑制人脂肪间充质干细胞成脂向分化

目的:研究Tribbles同源蛋白3(Tribbles pseudokinase 3, TRIB3)在人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hASCs)成脂分化中的调控作用,为提高hASCs成脂向分化能力、并为基于hASCs的脂肪组织工程与软组织缺损修复提供新靶点与新思路。方法:通过慢病毒转染建立TRIB3稳定敲低(TRIB3敲低组)和过表达(TRIB3过表达组)的hASCs细胞系,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白质印迹实验(Western blot)检测慢病毒转染hASCs的转染效率和效果。通过油红O染色和定量、qRT-PCR等实验方法,检测敲低、过表达TRIB3对hASCs成脂分化能力的影响。结果:TRIB3敲低慢病毒转染后,TRIB3敲低组hASCs中TRIB3 mRNA表达量较对照组下降84.3%(P<0.01), TRIB3蛋白表达也显著下降,表明成功构建了TRIB3敲低的hASCs细胞系;TRIB3过表达慢病毒转染后,TRIB3过表达组TRIB3 mRNA表达量较对照组增高约1.6倍(P<0.01),TRIB3蛋白表达也显著升高,表明成功构建了TRIB3过表达的hASCs细胞系。在此基础上,油红O染色显示,TRIB3敲低的hASCs成脂诱导后胞浆内红色脂滴明显增多,定量结果表明TRIB3敲低组油红O着色较对照组显著增多(P<0.01)。与之相反,TRIB3过表达的hASCs成脂诱导后胞浆内红色脂滴明显减少,定量结果表明TRIB3敲低组油红O着色较对照组显著减少(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,敲低TRIB3的hASCs成脂诱导后,成脂分化相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα)和白细胞分化抗原36(cluster of differentiation 36, CD36)mRNA水平显著升高(P<0.01);TRIB3过表达的hASCs成脂诱导后成脂分化相关基因PPARγ、CD36和脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)mRNA水平明显下降。结论:TRIB3能够调控hASCs成脂分化能力,敲低TRIB3促进hASCs成脂分化,过表达TRIB3抑制hASCs成脂分化。     

Alamandine通过结合MrgD受体促进大鼠皮下脂肪间充质干细胞成脂分化

目的：探讨血管紧张素1?7［angiotensin（1?7）,Ang（1?7）］脱羧形成的一种肽Alamandine对大鼠脂肪来源的间充质干细胞（adipose?derived mesenchymal stem cell,ADSC）成脂分化的影响,以及Alamandine调控成脂分化的机制。方法：用不同浓度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）的Alamandine处理大鼠ADSC,光镜观察脂滴大小,细胞内甘油三酯、总胆固醇测定,油红O染色法检测成脂分化程度,Western blot检测脂肪分化相关蛋白标志物。确定最适浓度后,检测Alamandine处理大鼠ADSC不同天数的细胞成脂分化程度。血管紧张素Ⅱ（angiotensinII,AngⅡ）和Alamandine共处理大鼠ADSC,相同方法检测成脂分化程度,探讨Alamandine与AngⅡ对ADSC成脂分化的影响。Mas相关G蛋白偶联受体D（mas associated G protein coupled receptor D,MrgD）拮抗剂处理大鼠ADSC,同样的方法检测成脂分化,验证Alamandine促进成脂分化的作用受体。 结果：不同浓度Alamandine处理大鼠ADSC,发现Alamandine促进大鼠ADSC成脂分化,且成明显剂量依赖性。选取10 μmol/L Alamandine处理大鼠ADSC,分别在1、3、6、10 d检测成脂分化指标,随着处理天数增加,成脂分化程度也逐渐增加且在第10天达到顶峰。AngⅡ单处理大鼠ADSC抑制了成脂分化,而且AngⅡ减弱了Alamandine促成脂分化效应。同时MrgD拮抗剂D?pro7抑制了Alamandine对大鼠ADSC的促成脂分化效应。结论：Alamandine通过作用于大鼠ADSC的MrgD起到促进成脂分化的作用。     

影响骨髓间充质干细胞成脂化的部分因素

摘要：随着人口的不断增长和老龄化社会的到来,骨质疏松症及其所引起的骨折已成为严重危害人类健康的世界性公共卫生问题。目前,全世界约2亿多人患有骨质疏松症。研究发现,骨质疏松症患者骨髓中的脂肪细胞与松质骨的骨量成反比,骨量的减少与骨髓腔内脂肪细胞增多总是相伴出现。[1]而骨髓间充质干细胞是近年来发现的一种易于扩增、具有多种分化潜能的细胞,在不同诱导条件下,能够向成骨细胞、脂肪细胞等不同的细胞系分化[2]。许多体内、外实验证明能结合在PPAR、糖皮质激素、雌激素、维生素D 、雄激素受体上的配体可调节MSCs向成骨和成脂肪分化。因此探讨骨髓间充质干细胞成脂分化的影响因素对骨质疏松症防治具有重要意义,可以为临床上治疗骨质疏松提供新思路。为了进一步了解骨质疏松与骨量减少、骨髓脂肪增多的关系,我从细胞核激素受体水平上对影响BMSCs分化为脂肪细胞的因素作一综述。     

大鼠颅骨骨缝间充质干细胞与骨髓间充质干细胞成骨及成脂能力比较研究

目的 分离培养大鼠颅骨骨缝间充质干细胞(CSSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs),比较两种间充质干细胞体外成骨、成脂诱导的差异.方法 采用出生后5天的SD大鼠,分离培养CSSCs和BMSCs,并进行鉴定.体外对CSSCs和BMSCs进行成骨成脂诱导,采用免疫荧光检测,碱性磷酸酶(ALP)染色,茜素红染色,油红O染色...     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。     

不同诱导时间下大鼠脂肪间充质干细胞成骨的差异

目的观察诱导时间的不同对大鼠脂肪间充质干细胞分化为成骨细胞的影响。方法脂肪间充质干细胞（ADSCs）分诱导组和非诱导组。诱导组在细胞接种同时（A组）、50%～60%融合时（B组）、85%～95%融合时（C组）分别加入同一浓度的由地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠。非诱导组的A、B、C组由普通培养基培养不加入诱导剂。结果经钙钴染色后,诱导组大部分细胞呈阳性反应,以细胞达85%～95%融合时的结节体积最大。非诱导组未见片状阳性细胞。茜素红染色后可见红色结节,以细胞达85%～95%融合时诱导培养组形成结节较早。细胞内碱性磷酸酶活性检测表明诱导组与同期非诱导组相比细胞内碱性磷酸酶活性明显提高。结论 ADSCs经过诱导后,可向成骨细胞方向分化;诱导组细胞内碱性磷酸酶活性明显高于同期非诱导组;初始接种密度相同的情况下,ADSCs间相互接触程度越高,成骨能力越强。     

兔不同部位脂肪间充质干细胞成骨能力的差异

目的观察兔不同部位来源的脂肪间充质干细胞（ADSCs）分化成骨的能力。方法分别从一只新西兰兔的腹股沟、腹膜后、颈背部取出脂肪组织并提取脂肪间充质干细胞,体外培养传至第5代,加入诱导剂分别进行成骨诱导,不加入诱导剂的为对照组。观察通过钙钴染色、茜素红染色、碱性磷酸酶活性检测细胞成骨能力。结果经钙钴染色及茜素红染色后,诱导组大部分细胞呈阳性反应,以腹股沟部脂肪间充质干细胞的结节体积最大,对照组未见明显阳性细胞。细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性检测表明诱导组比对照组ALP活性明显升高（P〈0.05）;腹股沟部脂肪间充质干细胞ALP活性较颈背部及腹膜后高,差异有统计学意义（P〈0.05）;颈背部与腹膜后相比较无明显差异（P〉0.05）。结论兔ADSCs经过体外诱导后,具有成骨能力;腹股沟部脂肪可作为骨组织工程种子细胞来源的较佳取材部位。     

Induced differentiation of adipose-derived stromal cells into myoblasts

This study aimed to induce the differentiation of isolated and purified adipose-derived stromal cells(ADSCs) into myoblasts,which may provide a new strategy for tissue engineering in patients with stress urinary incontinence(SUI).ADSCs,isolated and cultured ex vivo,were identified by flow cytometry and induced to differentiate into myoblasts in the presence of an induction solution consisting of DMEM supplemented with 5-azacytidine(5-aza),5% FBS,and 5% horse serum.Cellular morphology was observed under an i...     

Ultrastructure and electrophysiology of astrocytes differentiated from adult adipose-derived stromal cells

Background  Adipose-derived stromal cell (ADSC) differentiation into neural cells in vitro is becoming widely studied. However, there are few reports on astrocytes following differentiation, and particularly on maturation and electrophysiology. In this study, we used various methods to determine ADSC-derived astrocyte maturity.

Methods  Chemical induction with isobutylmethylxanthine (IBMX) was used to differentiate adult ADSCs into astrocytes followed by hematoxylin-eosin (HE) staining to observe morphology and transmission electron microscopy for cellular ultrastructure assessment. Immunofluorescence was used to detect expression of neural stem cell marker nestin as well as glial markers glial fibrillary acidic protein (GFAP) and S-100. In addition, we measured membrane potentials in bis-(1,3-dibarbituric acid) trimethine oxanol-labeled ADSCs and astrocytes by stimulation with a high potassium solution under an inverted fluorescence microscope. Finally, cell cycle distribution was detected by flow cytometry.

Results  Typical astrocyte morphology was shown by HE staining after 48-hour differentiation. Glial fibril was observed with transmission electron microscopy. GFAP and S-100 were not expressed in the control group, but were expressed within 24-hour differentiation and reached a maximum at day 14 with no change up to day 28. Nestin was weakly expressed in control cells and also reached a maximum at day 14 with the percentage of positive cells constant until day 21 followed by a decrease. Differentiated cell membrane potentials after stimulation with potassium were slightly increased, and then gradually declined over time. There was no significant membrane potential change in the control group. Flow cytometry showed that the percentage of cells in G0/G1 phase was 93% and only 5% in S phase.

Conclusion  ADSCs were differentiated into mature astrocytes with typical characteristics including morphology, ultrastructure, marker protein expression, mature potassium channels and mitotic capacity.

     

甘草中5种活性物质对人脂肪间充质干细胞的抗衰老作用

目的 研究甘草中5种活性物质甘草酸(GA)、甘草苷(LQ)、异甘草苷(ILQ)、芹糖甘草苷(LA)和芹糖异甘草苷(ILA)对人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)抗衰老效果.方法 用CCK-8法测定不同浓度甘草5种活性物质对hADSCs增殖的影响,选择5种化...     

低能量激光照射对人脂肪基质细胞增殖分化的影响

目的： 研究低能量激光照射（low level laser irradiation,LLLI）的照射剂量对人脂肪基质细胞（human adipose-derived stromal cells,hASCs）增殖与分化作用的影响,为LLLI进一步在骨组织工程中的应用奠定基础。方法： 将P4代hASCs接种于孔板中,24 h后利用半导体激光器（980 nm,100 mW~12 W）连续照射4 d。以增殖培养基为空白对照组(PM组),实验组接受2、4、6、8 J/cm2的激光照射,连续7 d进行细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）增殖检测。当细胞达到70%的融合后将一半细胞更换为成骨培养基（osteogenic medium,OM）,根据培养基及累计接受的激光总能量密度分为6组：PM、OM、PM+LLLI2 J/cm2、OM+LLLI2 J/cm2、PM+LLLI4 J/cm2、OM+LLLI4 J/cm2。于第7天进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色及定量检测,于第14、21天进行矿化沉积检测,于第7、14天进行实时定量PCR检测成骨相关基因的表达,探究低能量激光对hASCs成骨分化的影响,结果采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。结果： PM+LLLI4 J/cm2组细胞增殖速率最快,OM各组的ALP染色均呈阳性表达,且染色深度随激光能量密度的增高而加重。第14天时,OM各组随激光照射能量升高,矿化结节体积明显增大、数目增多;第21天时,OM组间茜素红染色结果无明显差异。ALP及茜素红定量结果均与相应染色结果趋势一致。hASCs实时定量PCR结果提示,LLLI可促进ALP和Runx2的表达,且促进作用与照射剂量呈正相关。结论： LLLI具有促进hASCs增殖分化的作用,且在一定剂量范围内,这种促进作用会随照射剂量的增大而加强,当达到峰值后随照射剂量的增大而减弱。     

成人脂肪基质细胞体外诱导分化为神经前体细胞的数量达峰时间研究

目的 研究成人脂肪基质细胞(ADSC)诱导分化为神经前体细胞数量达峰时间和诱导分化后神经前体细胞的超微结构特征.方法 应用β-巯基乙醇诱导成人ADSC向神经前体细胞和神经元样细胞分化,倒置相差显微镜观察诱导前后细胞形态;免疫荧光细胞化学染色法检测诱导分化后细胞神经巢蛋白(nestin)的表达情况;透射电镜观察诱导分化3h时的神经前体细胞超微结构.结果 体外培养的成人ADSC诱导分化3h时nestin的表达到高峰,为(86.25±4.82)%,透射电镜观察神经前体细胞的超微结构可见细胞表面突起较多,胞质中细胞器丰富,细胞核大,核/浆比例大,双层核膜且有较多核孔,常染色质多,异染色质少.结论 β-巯基乙醇诱导成人ADSC分化3h时神经前体细胞数量达到高峰,且超微结构研究证实此时细胞处于分裂增殖旺盛期.

Abstract：

Objective To reseach the time point of the highest percentage of neural precursor cells derived from adipose stromal cells (ADSCs) in vitro, and to observe the ultrastructure features of neural precursor cells. Methods Used the β-mercaptoethanol to induce ADSCs to differentiate into neural precursor cells and neuron-like cells. The morphology of the uninductedcells and inducted cells were observed with inverted phase contrast microscope. The expression of nestin which was the marker of neural precursor cell in each group was detected using immunofluorescence staining method. The ultrastructural feature of cells which was induced for 3 hours were observed. Results The highest ratio of positive expression of nestin was 3 hours following induction,with the ratio ( 86.25 ± 4.82) %. There were many protuberance on the cell membrane under transmission electron microscopy.There were plenty of organelles in the neural precursor cells. The neural precursor cells had a large size nucleus,large nucleoplasmic index, much extended chromatin,and less condensed chromatin. The nucleus had double-layer nuclear envelope, more nuclear pore on the nuclear envelope. Conclusion The time point of the highest percentage of neural precursor cells derived from ADSCs is 3 hours,and the ultrastructral feature of induced neural precursor cells confirm that cells at this time point are in a state of split active period.     

壳聚糖挂膜修饰聚丙烯网片与兔脂肪源性间充质细胞的黏附性研究

目的 研究壳聚糖挂膜修饰聚丙烯网片的技术参数及其与兔脂肪源性间充质细胞(ADSCs)的黏附性.方法 分别称取1、1.25和1.5g壳聚糖加2％的乙酸溶液、5％的戊二醛和50％的正庚烷溶解后,得到质量分数分别为2.0％、2.5％和3.0％的壳聚精铸膜液.将聚丙烯网片在壳聚糖铸膜液中反复浸泡、晾干后得到壳聚糖挂膜修饰的聚丙烯网片.将兔ADSCs接种于壳聚糖挂膜的聚丙烯网片上,培养24 h后观察细胞与材料的黏附性.结果 三种浓度的壳聚糖铸膜液挂膜修饰的聚丙烯网片柔软性均较挂膜前下降,壳聚糖铸膜液浓度越高,聚丙烯网片柔软性越低,而且3.0％铸膜液修饰的聚丙烯网片出现涂敷效果不均匀的现象.兔ADSCs在壳聚糖挂膜修饰的聚丙烯网片材料上生长良好.兔ADSCs与未挂膜的聚丙烯网片共培养24h后,表面未见细胞生长.结论 2.5％壳聚糖铸膜液为挂膜修饰聚丙烯网片的理想浓度.壳聚糖挂膜修饰的聚丙烯网片与兔ADSCs有良好的黏附性.     

不同细胞促进脂肪移植存活的实验研究

摘要：目的探讨应用自人脂肪组织来源的不同细胞辅助脂肪移植,寻找促进移植物存活率的最佳种子细胞的有效方法,为干细
胞进一步运用于临床提供实验依据。方法从临床抽脂病人获取脂肪组织并提炼细胞,将0.3 ml待移植的脂肪颗粒分别与以下
细胞进行混合处理：（1）低氧脂肪来源间充质干细胞（A组）;（2）脂肪来源间充质干细胞（B组）;（3）血管基质层细胞（SVFs）（C
组）;（4）加完全培养基的单纯脂肪颗粒为对照组（D组）脂肪颗粒与相应细胞混合后,注射移植于6只裸鼠背部皮下。术后3个月
观察移植物情况,通过组织学、HE染色等方法进行分析。结果A~D组湿重分别为（61.67±8.165）、（91.67±1.472）、（96.67±
5.164）和（40.83±4.916）mg,A、B、C组脂肪存活率均高于D组（P<0.05）,B、C两组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）且都高
于A组。A、B、C组血管密度均高于组D,且C组明显高于其他3组（P<0.05）。A、B、C组存活脂肪细胞计数均高于D 组,且B、C
组最高（P<0.05）,纤维组织计数均低于D组（P<0.05）。结论来源于人自体干细胞复合脂肪颗粒能够显著提高移植脂肪组织的
成活率,其中血管基质层细胞及脂肪来源间充质干细胞移植脂肪的存活率最高。
     

聚氨酯介导TRIB2-siRNA转染人源脂肪干细胞的体外成脂分化

目的 使用阳离子型聚氨酯(cationic polyurethane,CPU)介导TRIB2-siRNA体外转染人源脂肪干细胞沉默TRIB2基因表达,研究基因沉默效率及基因沉默对干细胞成脂分化的影响.方法 在氮/磷(N/P)为10:1的条件下,混合CPU与TRIB2-siRNA或阴性对照siRNA(NC)制备复合物,并...     

P糖蛋白抑制对体外培养骨髓间充质干细胞成脂分化的影响

 目的 探讨P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）活性抑制对骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cell,BMSC）在糖皮质激素诱导下成脂分化的影响。方法 体外培养SD大鼠BMSC,分别给予维拉帕米（verapamil）5.09 μmol/L（A组）、10.18 μmol/L（B组）和20.36 μmol/L（C组）,加入等量生理盐水作为阴性对照（CTRL组）。培养至第7天,用罗丹明123荧光染料结合流式细胞仪技术检测P糖蛋白活性,各组再以1×10^-6 mol/L地塞米松诱导7天。分别于第7天和第14天,检测各组三酰甘油含量（triglycerides,TG）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）活力。结果 第7天时,A、B和C组的罗丹明123平均荧光强度和阳性细胞数均高于CTRL组（P<0.01）;A组低于B组（P<0.01）,C组最高（P<0.01）;各组TG含量和AKP活力的差异无统计学意义。第14天时,A、B和C组的TG含量分别为（15.00±0.32）、（15.53±0.52）和（16.46±0.50）mmol/L,均高于CTRL组的（14.03±0.66）mmol/L （P<0.05）,A组低于B组（P<0.05）,C组最高（P<0.05）;A、B和C组的AKP活力分别为（113.60±10.83）、（89.60±6.07）和（60.00±26.24）U/L,均低于CTRL组的（199.80±68.75）U/L（P<0.01）,A组低于B组（P<0.05）;C组最低（P<0.05）。结论 P糖蛋白活性抑制剂（维拉帕米）能降低BMSC的P糖蛋白活性,促进糖皮质激素诱导的成脂分化。     

利福平抑制地塞米松诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的机制研究

目的 明确利福平对糖皮质激素诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stroma cell, BMSC)成脂分化的作用。方法 体外培养Sprague-Dawley大鼠BMSC并随机分为4组: 5μg/ml利福平+10-6mol/L地塞米松(A),PBS+10-6mol/L地塞米松(B),5μg/ml利福平(C)和PBS(D)。分别应用罗丹明123结合流式细胞仪方法和酶联免疫吸附法检测5μg/ml利福平对BMSC的P糖蛋白活性和胞内地塞米松蓄积浓度影响。各组孵育14d后,分别进行油红O染色和碱性磷酸酶染色,定量检测三酰甘油含量、碱性磷酸酶活力、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ) mRNA和Runt相关转录因子2(Runx2)mRNA表达。结果 利福平减少BMSC胞内罗丹明123强度和胞内地塞米松蓄积量(P＜0.01)。B组诱导BMSC成脂分化、PPARγ mRNA表达增加和三酰甘油含量升高。A组、C组和D组BMSC未发生成脂分化,PPARγ mRNA表达增加和三酰甘油含量无统计学差异。A组BMSC碱性磷酸酶活性和Runx2 mRNA表达最强(P＜0.01),B组碱性磷酸酶活性和Runx2 mRNA表达下降(P＜0.01)。结论 利福平上调BMSC的P糖蛋白活性,抑制糖皮质激素诱导的成脂分化。