过表达TLR4基因对胃癌细胞自噬的抑制作用及其机制

目的 采用慢病毒过表达胃癌细胞中Toll样受体4（TLR4）基因,探讨其对胃癌细胞自噬的作用,并阐明其作用机制。 方法 处于对数生长期的胃癌BGC-823细胞和SGC-7901细胞分为未感染组、阴性对照病毒组和基因过表达组,分别给予无慢病毒感染、空载体慢病毒和过表达TLR4慢病毒稳定感染。采用Western blotting法检测正常胃黏膜上皮GES-1细胞及胃癌BGC-823细胞、SGC-7901细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法分别检测各组细胞中TLR4、Beclin1和微管相关蛋白轻链3（LC3）mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中磷脂酰肌醇-3激酶／蛋白激酶B（PI3K／Akt）、磷酸化PI3K／磷酸化Akt（p-PI3K／p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）信号通路相关蛋白及细胞自噬相关蛋白（LC3、Beclin1和p62）蛋白表达水平。 结果 BGC-823细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平高于胃黏膜上皮GES-1细胞。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞增殖活性明显升高（P<0.05或P<0.01）。与阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）,BGC-823细胞中Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05）,SGC-7901细胞中LC3和Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中LC3和Beclin1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,p62、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。 结论 过表达TLR4基因可以通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路明显抑制胃癌细胞的自噬活性。     

黄连素对脂多糖诱导人脐静脉血管内皮细胞损伤的保护作用研究

目的探讨黄连素（BBR）对脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）损伤的保护作用及其机制。方法体外培养HUVECs,分为正常对照组(Control组)、LPS组、LPS+细胞自噬诱导剂雷帕霉素（RAPA）组、LPS+细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）组和LPS+BBR组,置于含相关药物的培养基中继续培养。采用EdU染色法检测细胞活性变化,荧光显微镜观察自噬流变化,Westernblot法检测自噬相关蛋白p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平变化。结果与Control组比较,LPS组EdU染色阳性细胞率明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）;与LPS组比较,LPS+RAPA组EdU染色阳性细胞率明显下降,而LPS+3-MA组EdU染色阳性细胞率明显上升,LPS+BBR组EdU染色阳性细胞率明显上升,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与Control组比较,LPS组自噬小体和自噬溶酶体数量均增加,p62和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平均上升（均P＜0.05）;与LPS组比较,BBR组自噬小体和自噬溶酶体数量均减少,p62和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平均下降（均P＜0.05）。结论LPS诱导HUVECs产生自噬,BBR通过抑制由LPS诱导产生的自噬来减轻LPS诱导的HUVECs损伤。     

头孢曲松对蛛网膜下腔出血大鼠海马神经细胞的保护作用及其机制

目的：探讨头孢曲松对蛛网膜下腔出血（SAH）大鼠的治疗作用,并阐明其作用机制。方法： 48只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组、SAH组、3-甲基腺嘌呤（3-MA）组和头孢曲松（CEF）组,每组12只。血管内穿刺法建立SAH模型,腹腔注射给药,3-MA给药剂量为15 mg·kg^-1,CEF给药剂量为500 mg·kg^-1。造模后24h处死大鼠,HE染色观察大鼠脑组织病理表现,TUNEL染色法检测神经细胞凋亡情况,免疫组织化学Western blotting法检测各组大鼠海马组织中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ阳性细胞数和蛋白表达水平及凋亡因子Caspase-3蛋白表达水平。结果：与SAH组比较,CEF组大鼠神经功能评分明显升高（P<0.01）;HE染色检测,SAH组大鼠海马区神经细胞肿胀,胞质疏松,核明显固缩、碎裂和溶解;与SAH组比较,CEF组大鼠神经变性有所逆转,出现较多正常神经组织形态;3-MA组神经细胞损伤更为严重,满视野死亡神经细胞,细胞层次紊乱。定量分析显示,与SAH组比较,CEF组坏死神经细胞数明显降低（P<0.05）,3-MA组坏死神经细胞数明显升高（P<0.05）。免疫组织化学法检测,与SAH组比较,CEF组大鼠海马组织中Beclin-1和LC3-Ⅱ阳性细胞数明显升高（P<0.05）,3-MA组大鼠海马组织中Beclin-1和LC3-Ⅱ阳性细胞数明显降低（P<0.05）。TUNEL染色法检测,与SAH组比较,CEF组凋亡细胞数明显减少（P<0.05）,3-MA组凋亡细胞数明显升高（P<0.05）。Western blotting法检测,与SAH组比较,CEF组大鼠海马组织中Caspase-3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,3-MA组Caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论：头孢曲松对蛛网膜下腔出血大鼠神经损伤具有保护作用,其作用机制可能与上调神经细胞自噬和减少细胞凋亡有关。     

杨梅素对人卵巢癌SKOV3细胞自噬的诱导作用及线粒体分裂的促进作用

目的：观察杨梅素作用于人卵巢癌SKOV3细胞后细胞自噬的发生和线粒体分裂程度,探讨杨梅素对其线粒体分裂的影响及自噬的诱导作用。方法：体外培养SKOV3细胞,杨梅素给药剂量按0、20、40和60 g·L^-1分为对照组和低、中、高剂量杨梅素组,均作用12 h。流式细胞术检测各组细胞线粒体膜电位变化,MitoTracker Red荧光探针特异性标记线粒体观察其形态,Western blotting法检测动力相关蛋白1（Drp1）、线粒体分裂蛋白1（Fis1）和自噬相关蛋白LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ蛋白表达水平,采用间接免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3表达强度。结果：与对照组比较,各剂量杨梅素组细胞线粒体膜电位下降比例明显升高（t=3.27,t=6.85,t=5.49,P<0.05）。与对照组比较,各剂量杨梅素组细胞中线粒体数目增加,且线粒体砂砾感增强。与对照组比较,各剂量杨梅素组细胞中Drp1（t=4.35,t=3.28,t=6.17,P<0.05）和Fis1（t=8.32,t=6.74,t=9.27,P<0.05）蛋白表达水平明显升高,中和高剂量杨梅素组细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高（t=3.28,t=4.21,P<0.05）。间接免疫荧光检测,与对照组比较,随着杨梅素给药剂量增加,LC3表达强度逐渐增强。结论：杨梅素能够诱导人卵巢癌SKOV3细胞发生自噬,并对线粒体动分裂有明显促进作用。     

红景天苷对97H细胞自噬的影响

目的：探讨红景天苷对人高转移性肝癌细胞株97H自噬的影响。方法：97H细胞经红景天苷处理后,采用透射电镜、MDC染色和吖啶橙AO染色观察自噬现象;采用qRT-PCR方法检测自噬相关基因的mRNA水平;用Western blot方法检测自噬相关蛋白的表达。结果：红景天苷可诱导97H细胞发生自噬,且上调Beclin-1基因mRNA水平,下调p62基因mRNA水平（P<0.05）,上调Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达,下调p62蛋白的表达（P<0.05）。结论：红景天苷可以诱导97H细胞的自噬作用。     

线粒体靶向KillerRed增强辐射诱导HeLa细胞自噬作用及其机制

目的：探讨线粒体靶向KillerRed（mtKR）增强辐射诱导HeLa细胞线粒体失能及细胞自噬作用,并阐明其相关分子机制。方法：线粒体靶向质粒PTEN诱导激酶1（Pink1）-mtKR转染HeLa细胞后,进行可见光和4 Gy X射线照射,实验分为对照组、空载体组、Pink1-mtKR组、对照+4 Gy X射线照射组、空载体+4 GyX射线照射组和Pink1-mtKR+4 GyX射线照射组。X线照射后24 h,采用流式细胞术检测线粒体膜电位（MMP）和细胞自噬率,采用生化试剂盒检测线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ水平,采用Western blotting法检测自噬分子P62、Pink1、帕金蛋白（parkin）和线粒体外膜转换酶20（Tom20）的表达量。结果：Pink1-mtKR瞬时转染HeLa细胞后,给予可见光联合4 Gy X射线照射,与对照组比较,Pink1-mtKR组细胞MMP、线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ水平均明显降低（P<0.05）,细胞自噬率明显升高（P<0.05）,Pink1-mtKR+4 GyX射线照射组细胞MMP、线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ水平进一步降低（P<0.05）,自噬率进一步升高（P<0.05）。与对照组比较,Pink1-mtKR组和Pink1-mtKR+4 Gy X射线照射组细胞总蛋白中Pink1和parkin蛋白表达量无明显变化,而P62蛋白表达量增加,Pink1-mtKR组和Pink1-mtKR+4 Gy X射线照射组细胞线粒体蛋白中Pink1、parkin和Tom 20蛋白表达量均明显增加。结论：mtKR可增强辐射诱导的线粒体失能和自噬,其机制可能涉及到Pink1/parkin自噬通路的调控。     

二氢杨梅素的体外护肝作用：基于脂噬介导的LO2细胞脂质蓄积及HepG2细胞增殖

目的 基于脂噬途径研究二氢杨梅素（DMY）对LO2细胞脂质蓄积的防治效果及其机制,并探索其对HepG2细胞的增殖抑制。方法 FBS诱导LO2细胞建立脂肪变性模型,研究分别设置对照组：10%FBS-DMEM正常培养;模型组：50%FBS-DMEM;阳性对照组：100 μg/mL DMY+10%FBS-DMEM;处理组（L-DMY组：50 μg/mL DMY+50%FBS-DMEM;M-DMY组：100 μg/mLDMY+50%FBS-DMEM;H-DMY组：200 μg/mL DMY+50%FBS-DMEM）及恢复对照组：先50% FBS-DMEM培养,后10%FBS-DMEM培养。油红O染色测定脂滴累积。试剂盒测定TC、TG、LDL水平和AST、ALT和LDH酶活性。AO染色观察自噬溶酶体数量,透射电镜观察自噬体数量。Western blot检测自噬蛋白LC3表达量。MDC染色观察自噬体形成情况,q-PCR测定LC3、ATG7、AMPK、mTOR、p62和Beclin1的mRNA表达水平。细胞周期阻滞实验分析HepG2细胞周期比例,流式细胞术检测HepG2细胞凋亡情况,细胞DNA断裂实验检测HepG2细胞DNA的完整情况。结果 DMY干预和预处理可抑制LO2细胞的脂质蓄积,并且降低TC、TG、LDL水平和AST、ALT和LDH酶活性,差异具有统计学意义（P<0.05）;DMY可促进LO2细胞的自噬体和自噬溶酶体的形成,并促进自噬蛋白LC3的表达;DMY可减轻高FBS诱导的LO2细胞自噬体形成抑制,并上调LC3（P< 0.01）、ATG7（P<0.01）、Beclin1（P<0.05）和AMPK（P<0.001）的mRNA水平,下调p62（P<0.001）和mTOR（P<0.001）的mRNA水 平。DMY可阻滞HepG2细胞的有丝分裂和细胞增殖（53.90% vs 14.62%; 32.31% vs 70.17%）,诱导HepG2细胞的晚期凋亡（4.74% vs 57.86%）和DNA断裂。结论 DMY通过调节AMPK/mTOR介导的脂噬途径减少LO2细胞的脂质累积,通过阻滞细胞周期和促进凋亡抑制HepG2增殖,发挥体外护肝作用。     

抗菌肽LL-37对结肠癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及其机制

目的：探讨抗菌肽LL-37对结肠癌小鼠肿瘤生长和细胞凋亡的影响,阐明其抗肿瘤作用的可能分子机制。方法：构建LL-37过表达结肠癌HT-29细胞,采用qRT-PCR和Western blotting法检测HT-29细胞中LL-37 mRNA和蛋白表达水平。30只BALB/c小鼠随机分为对照组（给予未经感染的HT-29细胞）、空载组（给予感染空载质粒的HT-29细胞）、LL-37过表达组（给予感染LL-37过表达载体的HT-29细胞）、AMPK抑制剂组[给予感染空载体的HT-29细胞后,立刻尾静脉注射2 mg·kg^-1（Dorsomorphin,Dor）]和联合组（给予感染LL-37过表达载体的HT-29细胞后,立刻尾静脉注射2 mg·kg^-1 Dor）,每组6只。采用结肠癌HT-29细胞复制结肠癌小鼠模型,观察各组小鼠肿瘤体积并绘制生长曲线,感染24 d后剥离肿瘤测量质量并计算抑瘤率,TUNEL染色检测各组小鼠肿瘤细胞凋亡情况,Western blotting法检测各组小鼠肿瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ及AMPK/mTOR通路相关蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR及p-mTOR表达水平。结果：与对照组和空载组比较,LL-37过表达组小鼠结肠癌HT-29细胞中LL-37 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,肿瘤质量和体积明显降低（P<0.05）,抑瘤率升高（P<0.05）,肿瘤细胞凋亡数减少,肿瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值均明显升高（P<0.05）,p-mTOR/mTOR比值明显降低（P<0.05）;与空载组比较,AMPK抑制剂组小鼠肿瘤质量和体积明显升高（P<0.05）、抑瘤率降低（P<0.05）,肿瘤细胞凋亡数减少,自噬相关蛋白Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值明显降低（P<0.05）,p-mTOR/mTOR比值明显升高（P<0.05）;与LL-37过表达组比较,联合组小鼠肿瘤组织中Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值明显降低（P<0.05或P<0.01）,p-mTOR/mTOR比值明显升高（P<0.01）。结论：抗菌肽LL-37能激活AMPK/mTOR信号通路促进细胞自噬,进而抑制结肠癌HT-29荷瘤小鼠的肿瘤生长。     

“Sirt1-自噬”在低氧诱导小鼠成牙骨质细胞凋亡中的作用

目的：初步研究“Sirt1-自噬”在低氧诱导小鼠成牙骨质细胞OCCM-30凋亡中的作用。方法：体外培养小鼠成牙骨质细胞,随机分为对照组、低氧组、低氧+Sirt1激活剂白藜芦醇组、低氧+自噬抑制剂3-MA组、低氧+白藜芦醇+Sirt1抑制剂ex527组、低氧+白藜芦醇+3-MA组,MDC染色观察自噬溶酶体变化;LC3Ⅱ免疫荧光检测自噬体变化;透射电镜观察自噬体;Western blot检测Sirt1、LC3Ⅱ、p62等蛋白表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;不同组间结果数据采用单因素方差分析,组间采用LSD-t分析。结果：低氧组较对照组自噬溶酶体含量（P=0.000）及自噬体数量（P=0.000）明显增加,LC3Ⅱ蛋白表达明显增加（P=0.001）,p62蛋白表达明显减少（P=0.000）,细胞凋亡率增加（P=0.000）;低氧+白藜芦醇组较低氧组自噬溶酶体（P=0.019）及自噬体数量（P=0.000）、LC3Ⅱ蛋白表达（P=0.049）、Sirt1蛋白表达（P=0.000）明显增加,p62蛋白表达明显减少（P=0.000）,细胞凋亡率减少（P=0.021）;低氧+白藜芦醇+ex527组...     

溶酶体膜蛋白sidt2介导肝脏细胞的凋亡：不通过抑制自噬溶酶体途径

目的 研究溶酶体膜蛋白Sidt2敲除后在肝脏细胞中调控凋亡的途径。方法 利用Crispr-Cas9技术构建Sidt2敲除的人肝脏(HL7702)细胞模型,检测Sidt2和自噬关键蛋白LC3-/、P62蛋白水平,MDC染色观察自噬体形成情况,通过EdU和流式细胞实验观察Sidt2对肝脏细胞增殖活性和凋亡的影响,并且使用0、10、25、50、100、200μmol/L的氯喹(CQ)摸索肝脏细胞CQ饱和浓度,检测对其自噬流的影响,以及使用CQ进一步探索影响肝脏细胞的增殖活性其凋亡水平的机制。结果 成功构建HL7702细胞Sidt2^+/+组及Sidt2^-/-组。Sidt2基因缺失可导致肝脏细胞增殖被抑制和凋亡水平的增加,自噬关键蛋白LC3-/和P62在蛋白水平上的表达均增加且自噬体含量增加(P<0.05)。结果显示50μmol/L CQ作用下肝脏细胞自噬达到饱和状态,50μmol/L CQ使Sidt2基因缺失时LC3B和P62的表达均增加(P<0.05),且CQ进一步降低肝脏细胞活性,并促进其凋亡水平(P<0.05)。结论在离体水平...     

饥饿对Beclin-1依赖的Ana-1细胞自噬和凋亡的影响

目的：研究饥饿对Ana-1细胞自噬和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法：体外培养Ana-1细胞,将细胞分为对照组（饥饿0h）和饥饿3、6、9、12、24h组（饥饿组）,观察饥饿对细胞自噬与凋亡的影响;将Ana-1细胞分为空白对照组、饥饿组、3-甲基腺嘌呤（3-MA）组、3-MA联合饥饿组,孵育24 h,采用Western blotting法检测各组细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白表达水平和凋亡相关蛋白Caspase-3蛋白水平,采用倒置显微镜观察饥饿6、12和24 h组细胞形态表现。结果：与对照组比较,饥饿6、12和24h组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,饥饿3、6、9、12和24 h组Ana-1细胞中Beclin-1蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）,饥饿3、6、9、12和24 h组Ana-1细胞中Caspase-3水平明显降低（P<0.01）,呈时间依赖性;倒置显微镜下观察,与对照组比较,不同时间饥饿组细胞形态发生改变,细胞皱缩、出现碎片,随着时间的延长,细胞变化更加明显。与饥饿组比较,3-MA联合饥饿组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平及Caspase-3蛋白水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）。结论：饥饿可诱导Beclin-1依赖的Ana-1细胞自噬并引起细胞凋亡。     

环状RNA hsa＿circ＿0009735对胃癌细胞上皮间质转化、细胞周期和自噬的影响

目的：探讨环状RNA hsa＿circ＿0009735在胃癌组织和细胞中的表达,阐明其对胃癌细胞上皮间质转化(EMT)、迁移、细胞周期和自噬的影响。方法：取正常胃黏膜GES-1细胞、胃癌MGC-803细胞、 MKN-45细胞和HGC-27细胞。将hsa＿circ＿0009735小干扰RNA和阴性对照转染MGC-803细胞,将胃癌MGC-803细胞分为si-hsa＿circ＿0009735组和阴性对照组;将对照质粒和hsa＿circ＿0009735过表达质粒转染入HGC-27细胞,将胃癌HGC-27细胞分为OE-hsa＿circ＿0009735组和对照质粒组;MGC-803细胞转染细胞自噬质粒pcDNA-eGFP-LC3后分为空白组和不同浓度(0.25、0.50、1.00和2.00 mg·L^-1)雷帕霉素组。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测胃癌组织和细胞中hsa＿circ＿0009735表达水平,激光共聚焦显微镜观察各组MGC-803细胞形态表现和细胞中自噬小体数,Transwell小室实验检测各组迁移细胞数,流式细胞术检测不同细胞周期各组细胞百分率,W...     

槲皮素对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞AKT/mTOR信号通路及自噬的影响

目的：分析槲皮素对人脐静脉内皮细胞自噬和增殖的影响,探讨其与AKT/mTOR信号通路调控的关系及机制。方法：培养人脐静脉内皮细胞,MTT法检测细胞活力,MDC染色法检测自噬泡水平,Western印迹检测自噬相关蛋白水平,运用3-MA研究槲皮素对自噬和细胞增殖的影响。结果：槲皮素能增加人脐静脉内皮细胞活力(P<0.01),上调细胞中MDC染色标记的荧光颗粒,并伴随浓度的上调明显增加(P<0.01),能促进脐静脉内皮细胞中自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平表达(P<0.01),降低p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平(P<0.01)。与槲皮素组比较,槲皮素+3-MA组细胞活力和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均明显降低(P<0.05),p-mTOR/mTOR明显增加(P<0.05)。结论：槲皮素可通过抑制AKT/mTOR信号通路诱导细胞自噬来调控脐静脉内皮细胞增殖。     

Wnt3a在大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中对神经细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨Wnt3a在大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤中对神经细胞自噬和凋亡的作用及影响。 方法 将75只健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组)、蛛网膜下腔出血组(SAH组)及干预组(Wnt3a组),每组25只;采用枕大池自体注血方法建立SAH模型,各组于出血后0、12、24、48、72 h取脑。Western bloting检测LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值、Beclin-1、Caspase-3的表达情况,免疫组化染色技术观察各组大鼠海马的自噬和凋亡情况。 结果 Western bloting结果显示,SAH组LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1出血后呈升高趋势,于24 h达高峰,24 h时间点Wnt3a组LC3Ⅱ、Beclin-1的表达较SAH组明显(P<0.05)。SAH组出血后Caspase-3升高,48h达高峰,Wnt3a组Caspase-3表达较SAH组减少(P<0.05)。免疫组化结果显示,与SAH组相比,Wnt3a组24 h时间点Beclin-1阳性神经元增多,48 h时Bax阳性神经元与凋亡细胞均减少(P<0.05)。 结论 Wnt3a可以促进大鼠蛛网膜下腔出血后神经元自噬,减少神经元细胞凋亡,对神经元具有保护作用。     

黄芩苷对脂多糖诱导的大鼠滑膜RSC-364细胞自噬的抑制作用

目的：探讨黄芩苷通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素（PI3k/Akt/mTOR）信号通路对脂多糖（LPS）诱导的大鼠滑膜RSC-364细胞自噬的影响,并阐明其作用机制。方法：将对数生长期大鼠滑膜RSC-364细胞分为对照组、模型组、地塞米松（DXMS）组、10 μmol·L^-1黄芩苷组、20 μmol·L^-1黄芩苷组和40 μmol·L^-1黄芩苷组。对照组RSC-364细胞只加入培养基,其他各组RSC-364细胞均采用1 mg·L^-1LPS体外刺激12 h制作炎症细胞模型。采用MTT法检测各组RSC-364细胞存活率,RT-PCR法检测各组RSC-364细胞中PI3k、Akt、mTOR、Beclin1和微管相关蛋白-轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ） mRNA表达水平,Western blotting法检测各组RSC-364细胞中Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12、LC3-Ⅱ和P62蛋白表达水平。结果：与对照组比较,模型组RSC-364细胞存活率明显升高（P<0.01）,模型组RSC-364细胞中PI3k、Akt、mTOR mRNA和P62蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）,Atg5、Atg7、Atg12、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA及蛋白表达水平明显升高（P<0.01）;与模型组比较,不同浓度黄芩苷组RSC-364细胞存活率明显降低（P<0.05或P<0.01）,RSC-364细胞中PI3k、Akt、mTOR mRNA和P62蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）,Atg5、Atg7、Atg12、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA和蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01）。结论：黄芩苷可能通过激活PI3k/Akt/mTOR信号通路抑制LPS诱导的RSC-364细胞自噬。     

我的梦想是做“百年老店”——记首都医科大学三博脑科医院神经外科于春江教授

目的 探讨干预miRNA-181a(miR-181a)促进多发性骨髓瘤凋亡的机制。方法 首先检测健康志愿者外周血、骨髓瘤患者骨髓、骨髓瘤细胞株MM1S中miR-181a的表达水平。再将miR-181a抑制剂(miR-181a inhibitor)及对照siRNA分别转染进MM1S细胞,回复实验进一步验证miR-181a功能。流式细胞术检测凋亡率和线粒体膜电位,透射电镜观察线粒体超微结构及自噬泡,Western blotting检测Cleaved-caspase-3、Bcl-2/Bax、LC3 Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62、Parkin。结果 骨髓瘤及MM1S细胞株中miR-181a的相对表达水平显著升高(P<0.05),分别为1.57±0.09及1.64±0. 06。miRNA-181a 抑制剂作用下,MM1S细胞的凋亡率及Cleaved-caspase-3显著高于健康对照组及阴性转染对照组,电镜下自噬泡数目增加而且线粒体结构毁坏严重,线粒体膜电位水平低下伴有Bcl-2/Bax、LC3 Ⅱ/LC3-Ⅰ水平的显著升高,而P62水平的显著降低。过表达Parkin的回复实验显示,miRNA-181a 抑制剂对骨髓瘤细胞的作用明显降低。结论 抑制miRNA-181a可以升高Parkin表达水平,进而促进该基因通路介导的线粒体自噬,抑制骨髓瘤细胞的增殖。