WNT代谢通路相关基因与中国人群非综合征型唇腭裂发病风险的交互作用

目的:利用全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS)数据,从基因-基因交互作用和基因-环境交互作用方面探索WNT代谢通路相关基因在中国人群非综合征型唇腭裂(non-syndromic oral clefts,NSOC)发生风险中的作用。方法:本研究样本来自“唇腭裂基因和交互作用的国际合作研究”项目在中国地区募集的806个非综合征型唇裂合并或不合并腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate,NSCL/P)核心家系和202个非综合征型单纯腭裂(non-syndromic cleft palate,NSCP)核心家系。通过收集研究对象的DNA样本和问卷调查获得基因型数据和母亲孕期环境暴露信息,利用此GWAS数据,采用条件Logistic回归模型探讨基因-基因交互作用和基因-环境交互作用,由R软件中的trio软件包完成。经过Bonferroni多重检验校正后,统计学检验的显著性阈值均设为P<3.47×10^-4。结果:经过数据质量控制后,NSCL/P核心家系和NSCP核心家系各纳入7个基因上的144个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点进入分析。在NSCL/P和NSCP家系中,分别有三对SNPs交互作用达到统计学显著性水平(P<3.47×10^-4):rs7618735(WNT5A)与rs10848543(WNT5B),rs631948(WNT11)与rs556874(WNT5A)以及rs631948(WNT11)与rs472631(WNT5A);rs589149(WNT11)与rs4765834(WNT5B),rs1402704(WNT11)与rs358792(WNT5A)以及rs1402704(WNT11)与rs358793(WNT5A)。此外,基因-环境交互作用分析未发现显著结果。结论:未发现WNT代谢通路相关基因-环境交互作用在NSCL/P和NSCP发病风险中的作用,但WNT代谢通路相关基因可能通过基因-基因交互作用影响NSOC的发病风险。     

WNT信号通路基因位点单体型与中国汉族人群非综合征型唇腭裂发病风险的关联

目的: 拟在1 008个中国人群非综合征型唇腭裂(non-syndromic oral clefts, NSOC)核心家系中探索WNT信号通路相关基因位点单体型在疾病发生风险中的作用。方法: 本研究数据来自一项全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS),研究人群为“唇腭裂基因和交互作用的国际合作研究”项目在中国地区募集的806个非综合征型唇裂合并或不合并腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P)核心家系和202个非综合征型单纯腭裂(non-syndromic cleft palate, NSCP)核心家系。分别在NSCL/P和NSCP家系中,通过传递不平衡检验(transmission disequilibrium test, TDT)探索基因单体型与疾病的关联。经过Bonferroni多重检验校正后,统计学检验的显著性阈值均设为P < 3.47×10^-4。单体型关联分析通过plink(v1.07)软件完成。结果: 经过数据质量控制后,NSCL/P核心家系和NSCP核心家系各纳入7个基因上的144个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点进行分析。NSCL/P家系中69个单体型与NSCL/P存在关联(P < 0.05),NSCP家系中34个单体型与NSCP存在关联(P < 0.05),但经过Bonferroni多重检验校正后,关联均不具有统计学意义(P>3.47×10^-4)。结论: 未发现WNT信号通路相关基因位点单体型在NSCL/P和NSCP发病风险中的作用。     

中国人群Hedgehog通路基因与非综合征型唇腭裂的亲源效应

目的:探索非综合征型唇腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate,NSCL/P)这一类常见出生缺陷的可能致病机制,在Hedgehog(HH)通路基因中(PTCH1、PTCH2、SHH、SMO)探索基因多态性对NSCL/P的关联关系以及亲源效应(parent-of-origin effects,PoO)对NSCL/P发病风险的影响。方法:纳入806个中国非综合征型唇腭裂核心家系,对HH通路基因(PTCH1、PTCH2、SHH、SMO)的83个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms,SNPs)进行传递不平衡检验(transmission disequilibrium test,TDT), 并采用对数线性模型进行亲源效应分析。家系样本来自“唇腭裂基因和交互作用的国际合作研究”项目。采用Plink进行TDT检验;通过R软件中的Haplin v6.2.1软件包开展亲源效应分析。采用Bonferroni法进行多重检验校正。结果:经过质量控制,共纳入65个SNPs进行分析,Bonferroni显著性水平为7.7×10 ^-4(0.05/65)。未校正P值前,关联分析发现rs4448343与NSCL/P存在关联(P=0.023), 6个单体型(rs10512249-rs4448343、rs1461208-rs7786445、rs10512249-rs4448343、rs16909865-rs10512249-rs4448343、rs1461208-rs7786445-rs12698335、rs288756-rs288758-rs1151790)与NSCL/P存在关联(P<0.05);6个单体型(rs288765-rs1233563、rs12537550-rs11765352、rs872723-rs288765-rs1233563、rs288765-rs1233563-rs288756、rs6459952-rs12537550-rs11765352、rs12537550-rs11765352-rs6971211)具有潜在的PoO效应(P<0.05)。以上结果经过多重检验校正,均无统计学意义(P>7.7×10 ^-4)。结论:未发现HH通路基因多态性与NSCL/P的关联,未发现HH通路基因通过PoO效应影响NSCL/P发病风险。     

中国人群Hedgehog通路基因与非综合征型唇腭裂的亲源效应

目的:探索非综合征型唇腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate,NSCL/P)这一类常见出生缺陷的可能致病机制,在Hedgehog(HH)通路基因中(PTCH1、PTCH2、SHH、SMO)探索基因多态性对NSCL/P的关联关系以及亲源效应(parent-of-origin effects,PoO)对NSCL/P发病风险的影响。方法:纳入806个中国非综合征型唇腭裂核心家系,对HH通路基因(PTCH1、PTCH2、SHH、SMO)的83个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms,SNPs)进行传递不平衡检验(transmission disequilibrium test,TDT), 并采用对数线性模型进行亲源效应分析。家系样本来自“唇腭裂基因和交互作用的国际合作研究”项目。采用Plink进行TDT检验;通过R软件中的Haplin v6.2.1软件包开展亲源效应分析。采用Bonferroni法进行多重检验校正。结果:经过质量控制,共纳入65个SNPs进行分析,Bonferroni显著性水平为7.7×10 ^-4(0.05/65)。未校正P值前,关联分析发现rs4448343与NSCL/P存在关联(P=0.023), 6个单体型(rs10512249-rs4448343、rs1461208-rs7786445、rs10512249-rs4448343、rs16909865-rs10512249-rs4448343、rs1461208-rs7786445-rs12698335、rs288756-rs288758-rs1151790)与NSCL/P存在关联(P<0.05);6个单体型(rs288765-rs1233563、rs12537550-rs11765352、rs872723-rs288765-rs1233563、rs288765-rs1233563-rs288756、rs6459952-rs12537550-rs11765352、rs12537550-rs11765352-rs6971211)具有潜在的PoO效应(P<0.05)。以上结果经过多重检验校正,均无统计学意义(P>7.7×10 ^-4)。结论:未发现HH通路基因多态性与NSCL/P的关联,未发现HH通路基因通过PoO效应影响NSCL/P发病风险。     

WNT9B基因多态性与宁夏地区非综合征型唇腭裂的相关性及生物信息学分析

目的 探讨WNT9B单核苷酸多态性（SNP）与宁夏地区非综合征型唇腭裂（NSCL/P）的相关性。方法 收集宁夏医科大学总医院口腔颌面外科504例NSCL/P患儿的外周静脉血样本及本地区同期出生的正常新生儿血样455例。对WNT9B基因上常见的18个SNP进行基因分型及连锁不平衡和单倍型分析,筛选具有统计学差异的SNP位点;通过3DSNP、Regulome DB数据库对所筛选SNP位点的三维互作基因、三维互作SNPs、染色质状态进行分析总结。结果 WNT9B基因2个SNP位点的等位基因频率在病例组和对照组中的差异具有统计学意义（rs62071984,P=0.031 8,OR=1.477;rs1530364,P=0.028 4,OR=1.250）;连锁分析结果表明,18个SNP共形成3个Block,Block 2中的WNT9B AAGCGCAATCG单倍型在病例组和对照组间的差异具有统计学意义（P=0.047 8,OR=0.696）;三维互作分析结果发现,与差异性目标SNP位点相关的三维互作基因包括GOSR2和WNT9B;相关的三维互作SNPs包括rs4968282等11个SNP位点。染色...     

非综合征型唇腭裂相关环境因素的研究

目的探讨与非综合征型唇腭裂发生相关的一些环境因素。方法对175例非综合征型唇腭裂患儿以及170例正常新生儿双亲进行回顾性问卷调查,收集相关的环境因素进行统计学分析。结果运用χ2检验发现,父亲吸烟、母亲流产史、孕期病史、孕期服药史、被动吸烟、维生素叶酸补给在病例组和对照组比较有显著性差异(P<0.05)。Logistic单因素分析显示,在进入方程的11个因素中:父亲吸烟、母亲流产史、孕期病史、孕期服药史、被动吸烟、维生素叶酸补给6个因素有统计学差异(P<0.05)。将这6个因素进行Logistic多因素分析,结果显示这6个因素都与非综合征型唇腭裂的发生具有相关性(P<0.05),是非综合征型唇腭裂发生的危险因素。结论多种环境因素与非综合征型唇腭裂的发生具有相关性。     

利用二代测序数据探索SPRY基因家族与中国人群非综合征型唇腭裂的关联

目的 探索SPRY基因家族中的单核苷酸多态性及亲源效应与中国人群非综合征型唇腭裂发病风险的关联。方法 研究基于病例-双亲设计,以2016—2018年于北京大学口腔医院募集的 183个中国人群非综合征型唇裂合并或不合并腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate,NSCL/P)核心家系(549人)为研究对象。利用其二代测序数据中的SPRY基因家族相关信息,展开单核苷酸多态性和亲源效应分析。该测序研究采用二阶段设计,第一阶段对24个家系进行全外显子组测序探索潜在阳性信号,第二阶段在159个家系的独立样本中对第一阶段结果进行验证。采用问卷调查收集NSCL/P患者及其父母的基本情况、患病情况、临床特征及孕期环境暴露等信息。收集患儿及其父母的血液并提取DNA进行基因检测以获取遗传信息。单核苷酸多态性分析采用传递不平衡检验,亲源效应分析采用Z检验,统计分析使用PLINK(v1.07)软件完成。第一阶段的多位点分析采用以家系为基础的序列核心关联检验方法,由R软件(v3.5.1)famSKAT-RC包完成。采用Bonferroni法对验证结果进行多重检验校正。结果 经过质量控制,第一阶段共有22个SPRY基因家族的位点纳入分析,结合位点的注释、功能预测结果及统计检验结果,纳入rs1298215244 (SPRY1)和rs504122 (SPRY2)两个位点进入二阶段验证。二阶段传递不平衡检验发现,rs1298215244: T>C、rs504122: G>C两种常见变异以及rs504122: G>T罕见变异与NSCL/P的关联达到Bonferroni多重检验校正后的显著性水平,位于SPRY1的rs1298215244: T>C其亲源效应矫正前具有统计学意义,但未能通过多重检验校正。结论 发现SPRY基因家族中的单核苷酸多态性与中国人群NSCL/P的发病风险存在关联,但未发现SPRY基因家族具有亲源效应。     

中国人群非综合征性唇腭裂TGFA基因Taq I多态性研究

目的：探讨转化生长因子-α（TGFA）与中国人群非综合征性唇腭裂（NS－CL／P）的关系。方法：应用聚合酶链式反应（PCR）结合限制性内切酶酶切（RFLP）方法，对103名健康体检者和124名非综合征性唇腭裂患者进行TGFA基因多态性检测。PCR后直接用限制性内切酶酶切检测基因多态性。结果：单侧唇裂伴腭裂和双侧唇裂伴腭裂均与正常对照组有显著性差异。而单侧唇裂和单纯性腭裂与正常对照组无显著性差异。有家族史患者与无家族史患者等位基因频数在统计学上无显著性差异。结论：中国人群非综合征性唇腭裂TGFA基因中存在Taq I多态性位点，TGFA TaqI位点与中国人群非综合征性唇腭裂相关。     

基因芯片筛选非综合征型唇腭裂差异表达基因的初步研究

目的：利用全基因组表达谱芯片技术,分析非综合征型唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without palate,NSCL/P）患儿与正常儿童基因表达的差异,筛选出非综合征型唇腭相关基因。方法：采用离心柱法分别提取正常儿童和NSCL/P患儿腭部组织各3例的总RNA,经纯化后逆转录为cDNA,利用荧光染料（Cy3）标记aaUTP,转录合成标记的cRNA,经纯化及质检后与Agilent 4 × 44 k人类全基因组表达谱芯片杂交,扫描荧光信号图像,对芯片原始数据进行归一化处理,利用倍数差异和t检验筛选差异表达基因,采用上海博豪生物在线分析系统进行基因的功能注释和关联分析,明确差异基因的生物学功能,选取特定的差异表达基因,应用实时荧光PCR技术验证芯片结果的可靠性。结果：筛选出差异基因共254个,其中表达上调的有151个,表达下调的有103个。选取5条差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证,ADH1C（t=5.132,P=0.000）、RDH10（t=2.960,P=0.039）、HIST1H2BD（t=4.446,P=0.001）3条基因表达下调,KAT2B（t=-4.945,P=0.000）、FOSB（t=-3.666,P=0.005）2条基因表达上调,差异有统计学意义,且与芯片结果表达趋势一致。结论：NSCL/P患儿基因表达与正常儿童存在明显差异,分析这些差异基因,有助于阐明NSCL/P的发病机制,为疾病的预防提供理论依据。     

橘皮素通过抑制Notch信号通路干预小鼠肝纤维化进程

目的 探讨橘皮素对胆汁淤积性肝纤维化小鼠模型的治疗机制。方法 将45只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组（n=10）、胆总管结扎手术（biliary duct ligation, BDL）模型组（n=15）、橘皮素治疗组（n=10）及单纯橘皮素用药组（n=10）。药物治疗组中,BDL手术10d后开始橘皮素灌胃,模型建立30d后采血处死各组小鼠并留取肝组织。通过H-E染色、Masson及天狼星红染色分析各组小鼠肝组织纤维化程度;采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测各组小鼠血清肝功能指标丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)及纤维化指标透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)水平;通过蛋白质印迹、荧光定量聚合酶链反应(PCR)、免疫组织化学方法检测各组小鼠肝组织中羟脯氨酸(Hyp)含量及Notch通路各组分表达量变化;通过免疫组化法检测肝纤维经典通路TGF-β1/smads通路各组分表达量变化。结果 造模30d后,与BDL模型组相比,橘皮素治疗组小鼠肝纤维化假小叶减少,纤维化病理评分值低（P<0.05）;胶原纤维沉积减少（P<0.05）,Ⅰ型胶原纤维总量减少（P<0.05）;小鼠肝功能指标ALT、AST明显降低（P<0.05）,纤维化指标HA、LN降低（P<0.05）;Hyp含量降低（P<0.05）,Notch信号通路组分Notch1、RBPJ、Hes1、Hey1蛋白及RNA表达量均下调（均P<0.05）;肝纤维化TGF-β1/smads经典通路组分TGF-β1、smad2及smad3表达量下调（均P<0.05）。结论 橘皮素作为Notch信号通路抑制剂可通过与TGF-β1/smads通路相互作用延缓肝纤维化进程。     

基于MAPK信号通路的中药治疗支气管哮喘的实验研究进展

综述中药干预丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路治疗支气管哮喘的实验研究进展。MAPK信号转导途径是参与支气管哮喘发病及进展的一条重要通路,通过调控免疫/炎症细胞和气道结构细胞,引起气道高反应和气道重塑,造成Th1/Th2免疫应答失衡,最终诱发支气管哮喘。相关调控因子包括c-Jun氨基端激酶(JNK)、p38和细胞外信号调节激酶(ERK)等。近年来实验研究显示,多种中药复方(止哮汤、柴朴汤等)、中药单味药及其提取物(川贝母、黄芪多糖等)和中药单体(姜黄素、欧前胡素等)可通过抑制MAPK通路,改善哮喘症状,减轻气道炎症,逆转气道重塑,调节Th1/Th2平衡,在防治支气管哮喘方面取得显著疗效。     

抑制 MEK／ERK 通路对孤独症模型大鼠病症行为的影响

目的：探讨抑制 MEK ／ERK 通路对孤独症模型大鼠病症行为的影响。方法大鼠怀孕12．5 d 后采用一次性腹腔注射丙戊酸钠（VPA）制备孤独症幼大鼠模型。 U0126处理组于 VPA 注射后每天给大鼠口服400μg／kg MEK ／ERK 通路抑制剂U0126直至断奶。将出生幼鼠分为4组：对照组、VPA 处理组、U0126处理组、VPA 联合 U0126处理组。在幼鼠出生后35 d 进行社会交往行为检测、神经行为学检测,并分离提取脑组织蛋白通过 Western blot 分析 MEK／ERK 通路关键蛋白 MEK 与 ERK表达情况。结果与对照组比较,VPA 处理组社会交往能力下降、在中央区活动时间增加、站立次数减少,符合孤独症行为特征;U0126处理组无明显行为学变化;但 VPA 联合 U0126处理组能明显改善 VPA 处理导致的孤独症行为症状。 Western blot 结果显示,与对照组比较,VPA 处理可增强大鼠前额叶、海马及小脑组织中 MEK 与 ERK 磷酸化水平;而 VPA 联合 U0126处理组则能抑制上述脑组织中 MEK 与 ERK 磷酸化水平。结论 U0126可改善孤独症模型大鼠的病症行为,机制可能与抑制脑组织中MEK ／ERK 通路相关。     

人脐带间充质干细胞连续静脉注射对大鼠的安全性及肝脏的影响

探讨人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）多次注射对大鼠的安全性及肝脏的影响,为hUC-MSCs临床应用的安全性提供支持。方法 取SPF级健康SD大鼠50只,随机分成阴性对照组（生理盐水）、溶媒对照组（白蛋白）、hUC-MSCs高剂量（1.0×107 cells/kg）、中剂量（5.0×106 cells/kg）、低剂量组（2.5×106 cells/kg）,每组10只,尾静脉注射给药4次,1次/周。在末次给药后24 h,采集大鼠血样,检测血生化指标（TBIL、AST、ALT、GGT）、血清细胞因子(IFN-γ、IL-17、TNF-α)以及T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+);观察大鼠肝脏重量、脏体比指数及组织病理学变化;提取大鼠肝脏组织总RNA,qRT-PCR分析Act1、IL-17A、Hsp90aa1基因水平的表达情况。结果 hUC-MSCs高、中、低剂量组多次静脉注射后,大鼠血生化、血清细胞因子IFN-γ、IL-17、TNF-α以及T淋巴细胞亚群、肝脏重量、脏体指数及组织病理学变化与阴性对照组、溶媒对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。hUC-MSCs可明显降低肝组织中IL 17A mRNA表达水平,对Act1、Hsp90aa1 mRNA表达未见明显影响（P＞0.05）。结论 hUC-MSCs在1.0×107、5.0×106、2.5×106 cells/kg剂量下多次静脉注射大鼠安全性好,可下调IL-17A水平     

基于Hippo/TAZ信号通路探讨胃苏颗粒对幽门螺杆菌诱导的慢性萎缩性胃炎的作用惠桃1 柏江锋2 杭亮*3

目的：探讨胃苏颗粒(WSG)对幽门螺杆菌诱导的慢性萎缩性胃炎(CAG)动物模型的影响及其作用机制。方法：50只SD大鼠随机分为对照组、模型组和WSG低、中、高剂量组。除对照组外,其余组建立幽门螺杆菌感染的CAG模型。从第8周开始,WSG每日灌胃WSG(8、16、32? mg/kg),连续4周。试验结束时,通过HE染色评估胃黏膜损伤的组织病理学改变。采用qPCR和Western blot分析胃组织中LATS2、TAZ 的mRNA和蛋白表达。此外,用幽门螺杆菌感染GES-1细胞,并用WSG对其进行干预。采用CCK-8试验分析细胞活力,并分析Hippo/TAZ信号通路表达情况。结果：干预4周后,WSG各剂量组胃粘膜损伤明显减轻,胃粘膜糜烂长度明显缩短,UI评分和炎症评分均呈剂量依赖性降低(P<0.01)。幽门螺杆菌可显著增加TAZ的表达,并降低 LATS2的表达。WSG治疗以剂量依赖的方式逆转了TAZ和 LATS2表达的变化,特别是与CAG组相比,WSG中、高剂量的TAZ和 LATS2蛋白和mRNA表达表现出显著差异(P<0.05)。与幽门螺杆菌感染组相比,40 μM(83.44±5.46)和20 μM WSG组(75.47±8.31)的GES-1细胞活力显著增加(P<0.05)。qPCR和免疫荧光染色的结果显示,WSG干预增加了GES-1细胞中LATS2、WWC2表达,但降低了TAZ表达。此外,WWC2 siRNA预处理削弱了WSG诱导的LATS2活化,并促进了TAZ的表达(P<0.05)。结论：幽门螺杆菌诱导CAG的形成与Hippo/TAZ信号通路有关,WSG通过抑制Hippo/TAZ信号传导发挥了其胃肠道保护作用。     

蛋白酶体抑制剂RA190对口腔腺样囊性癌的调节作用

目的 探讨蛋白酶体抑制剂双苄基吡啶酮（RA190）通过非ATP酶依赖性调节颗粒13(Rpn13)抑制泛素-蛋白酶体通路途径对口腔腺样囊性癌的作用,揭示RA190对腺样囊性癌ACC-2细胞增殖、凋亡的调节作用和可能机制。方法 确定ACC-2细胞表达Rpn13后,选择RA190对ACC-2细胞的合适剂量（600 nmol/L）;实验分为ACC-2组、ACC-2-Rpn13-siRNA组、RA190-ACC-2-Rpn13-siRNA组;敲除ACC-2细胞中Rpn13的表达;用RA190处理ACC-2细胞;用RA190处理敲除Rpn13的ACC-2细胞;MTT法观察各组细胞增殖、凋亡情况;Western blotting检测各组细胞Survivin、TIP30、泛素化蛋白相对表达量;qRT-PCR检测Survivin和TIP30 m RNA相对表达量。结果 敲除Rpn13后的细胞组中Rpn13蛋白相对表达量较ACC-2细胞组降低（P <0.05）。MTT法检测显示,不同剂量的RA190作用ACC-2细胞后光密度（OD）比较,差异有统计学意义（P <0.05）。与ACC-2组比较,...     

熄风口服液对美解眠致痫大鼠的抗癫痫作用及其脑内c-fos基因表达的影响

目的 探讨熄风口服液对美解眠致痫大鼠发作时间及其大脑皮层和海马c—los基因表达的影响。方法 选用Wistar大鼠，观察熄风口服液对美解眠致痫大鼠发作时间的影响。并以美解眠诱导制作癫痫动物模型，应用免疫组化方法观察熄风口服液对其脑内c—fos基因表达的影响。结果 服药组大鼠注射美解眠后首次抽搐发作的时间（SB）和第一次达到V级发作的时间（RFSvS）延长。美解眠致痫大鼠脑内c-fos基因表达明显增强，熄风口服液能明显阻断其表达，并显示出良好的抗癫痫作用。结论 熄风口服液能缓解美解眠所致的癫痫发作，其作用机制可能与降低脑内c—fos基因表达水平有关。