国产与进口无血清培养基和重组胰蛋白酶规模化培养Vero细胞效果的比较

目的   比较国产物料与进口物料对Vero细胞的培养效果及消化效果,以判断国产物料VirusPro^® VP无血清培养基（serum-free medium,SFM）（干粉）和Trpzyme重组胰蛋白酶是否适用于规模化Vero细胞培养。  方法 选取国产物料VirusPro^® VP SFM（干粉）和Trpzyme作为实验组,选取进口物料粉剂VP SFM和TryPLe Select作为对照组,在T瓶、10层细胞工厂（10-layer cell factory,CF10）和CF40连续规模化生产中,对特定代次、特定传代规模分别进行独立样本t检验,比较总消化时长、细胞收获密度和细胞存活率。结果  各代次中,国产物料组与进口物料组的细胞生长状态均相似且良好。T瓶、CF10和CF40传代的独立样本t检验结果显示,虽然国产物料组的T瓶、CF10、CF40总消化时长（17.33、19.17、19.17 mm）均分别大于进口物料组（9.17、16.33、17.42 mm）,但仅T瓶总消化时长差异具有统计学意义（t=-5.58,P＜0.05）。两组间细胞收获密度及细胞存活率的差异均不具有统计学意义（P>0.05）,T瓶传代阶段的细胞收获密度（进口物料组：3.03×10⁶ ml^-1;国产物料组：3.11×10⁶ ml^-1）均高于CF10（进口物料组：1.22×10⁶ ml^-1 ;国产物料组：1.13 ×10⁶ ml^-1）和CF40（进口物料组：9.90×10⁵ ml^-1;国产物料组：8.73×10⁵ ml^-1）。结论 国产物料VirusPro^® VP SFM（干粉）、Trpzyme均符合规模化Vero细胞培养所需。     

国产与进口牛血清促进Vero细胞生长的比较

 目的  通过对国产与进口牛血清促进Vero细胞生长的比较,筛选可替代进口血清用于轮状病毒疫苗生产中Vero细胞培养的国产牛血清。方法  以国产的3批胎牛血清和1批新生牛血清为待评血清,以进口胎牛血清为对照血清,制备细胞培养液。在T175细胞培养瓶（T瓶）和2层细胞工厂中连续传代培养Vero细胞各3代,观察每一代次的培养上清液、细胞形态和细胞汇合度,计算细胞收获量和与对照血清相比较的相对增长率。采用单样本t检验对细胞收获量与生产要求的细胞产量（T瓶：>1.50×10⁷ 个/ml;细胞工厂：>3.00×10⁸ 个/ml）进行比较。根据细胞相对增长率判断国产血清与进口对照血清促细胞生长活性的相近程度。结果  国产血清培养的Vero细胞生长状态均良好。T瓶培养时,国产血清组的细胞收获量为（1.56～9.30）×10⁷ 个/ml,与生产要求细胞产量的差异有统计学意义（t=2.44～3.76,P<0.05）,且t值均>0,说明符合生产要求。细胞相对增长率接近或超过100%。细胞工厂培养时,国产血清组的细胞收获量为（1.80～4.92）×10⁸ 个/ml,与生产要求产量的差异无统计学意义（t=－0.23～1.16,P>0.05）,但是只有1批胎牛血清和新生牛血清的细胞收获量均值>3.00×10⁸ 个/ml,且细胞相对增长率>90%。 结论  经与进口牛血清比较,国产的1批胎牛血清和1批新生牛血清可替代进口血清,用于轮状病毒疫苗生产中的Vero细胞培养。     

Vero细胞在无血清条件下制备乙型脑炎灭活疫苗

目的 探索Vero细胞在无血清条件下制备乙型脑炎灭活疫苗的工艺. 方法 用无血清培养基培养Vero细胞,并将乙型脑炎病毒P3V2株毒种接种于培养的Vero细胞,观察细胞和病毒的生长情况.收获病毒液,通过灭活、纯化制备乙型脑炎灭活疫苗,检测疫苗各项指标,并与有血清培养工艺制备的疫苗(2013年生产的疫苗)进行比较.结果 无血清培养基培养的Vero细胞生长良好,培养5d的细胞呈致密单层生长.3批无血清培养工艺制备的疫苗的第1、2和3次收获液的平均病毒滴度分别为8.847、8.319和7.194 lgLD50/ml.3批无血清培养工艺制备的疫苗半成品的平均抗原含量(1.51 EU/ml)与有血清培养工艺制备的疫苗(1.41 EU/ml)相当,但前者的宿主细胞蛋白含量(19.69 μg/L)则明显低于后者(63.90 μg/L).结论 乙型脑炎病毒可在无血清Vero细胞中良好生长,Vero细胞无血清培养工艺制备乙型脑炎灭活疫苗是可行的.     

人毛乳头细胞培养基的改进

目的:改进人毛乳头细胞(DPC)培养基,以便在体外快速、高效地获得人DPC.方法:用含100 ml/L胎牛血清(FCS)的DMEM和改进的DPC培养基(DPCM)培养人DPC.观察比较人DPC在两种培养基中的形态学和生物学特点.结果:人DPC在DPCM上的生长状况明显优于含100 mL/L FCS的DMEM,而且细胞传代次数可达18-20代.结论:DPCM较含100 mL/L FCS的DMEM,对DPC具有更显著地刺激生长的作用,是人DPC较好的培养基.     

人毛乳头细胞培养基的改进

目的:改进人毛乳头细胞(DPC)培养基,以便在体外快速、高效地获得人DPC.方法:用含100 ml/L胎牛血清(FCS)的DMEM和改进的DPC培养基(DPCM)培养人DPC.观察比较人DPC在两种培养基中的形态学和生物学特点.结果:人DPC在DPCM上的生长状况明显优于含100 mL/L FCS的DMEM,而且细胞传代次数可达18-20代.结论:DPCM较含100 mL/L FCS的DMEM,对DPC具有更显著地刺激生长的作用,是人DPC较好的培养基.     

3种中和剂对常用消毒剂在Vero细胞上的中和效果

 目的  研究0.5%硫代硫酸钠、10%胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth， TSB）培养基、10%Letheen肉汤培养基对实验室常用的4种消毒剂的中和效果，为疫苗生产和检定中科学选择中和剂提供依据。 方法  取生长良好的Vero细胞接种于96孔培养板，每组8个复孔，置于37 ℃、5% CO2培养过夜。将3种中和剂分别与杀孢子剂、0.5%“84”消毒液、酸性苯酸盐、碱性苯酚盐4种消毒剂中和后，接种于单层生长的Vero细胞，显微镜下观察细胞生长情况。结果  0.5%硫代硫酸钠分别与杀孢子剂、0.5%“84”消毒液中和后接种细胞，8孔细胞全部存活；而0.5%硫代硫酸钠分别与酸性苯酚盐和碱性苯酚盐的中和产物接种细胞后，细胞全部死亡。10% TSB培养基分别与酸性苯酚盐、碱性苯酚盐中和后接种细胞，8孔细胞全部存活；而10% TSB培养基分别与杀孢子剂和0.5%“84”消毒液的中和产物接种细胞后，细胞全部死亡。10%Letheen肉汤培养基接种细胞后，8个孔细胞全部死亡。结论  0.5%硫代硫酸钠可中和杀孢子剂和0.5%“84”消毒液的消毒作用，10%TSB培养基可中和酸性苯酚盐和碱性苯酚盐的消毒作用。10%Letheen肉汤培养对Vero细胞有毒性作用。     

无血清细胞培养基的主要补充因子及研究进展

无血清培养基是在合成培养基的基础上,引入成分完全确知或部分明确的血清替代成分,使培养基既满足细胞培养要求,又有效避免因使用血清而带来的问题,已被广泛应用于研究和生产中,特别是细胞工程生物制药中。本文概要的介绍了无血清培养基的发展历程和应用,无血清培养基的组成和主要的补充因子及其各自的作用,以及新近研究进展。     

胰蛋白酶对Madin-Darby犬肾细胞消化方法的研究

目的:考察不同胰蛋白酶及消化后是否弃去胰蛋白酶对Madin-Darby犬肾(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞消化效果的影响,并评价培养基中添加胎牛血清对减轻胰蛋白酶细胞毒性的作用。方法:选用5种胰蛋白酶分别消化MDCK细胞,消化5 min后弃去胰蛋白酶为弃去组,不弃去为保留组。观察消化...     

无血清培养基的研究进展

目的总结无血清培养基的组成、主要补充因子及作用、应用以及新近研究进展,为细胞培养等研究工作提供参考。方法查阅国内外文献资料进行整理和归纳。结果无血清培养基克服了完全培养基的种种弊端,且关于无血清培养基的研究取得了诸多进展。结论无血清培养基在生产实践中已得到广泛应用,进一步提高其通用性、降低成本、用于大规模生产的方法有待探索。     

Vero细胞生产的脊髓灰质炎灭活疫苗加强免疫的安全性及免疫原性[英]／Haastrup E，Thierry-Crstensen B，Jensen AM，et al／／Vaccine

通过Vero细胞培养及生产的脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)可最大程度地减少外源因子的污染，且有利于脊髓灰质炎病毒的繁殖。丹麦Statens血清研究所(SSI)建立了新的Vero细胞培养技术，所用的培养基不含动物源性物质和抗生素。为比较新技术生产的疫苗(IPVVERO)和传统技术生产的疫苗(IPVMKE)的安全性及免疫原性，丹麦Juliane Marie中心Haastrup等进行了临床试验。     

制备流感疫苗的细胞基质研究进展

考虑到鸡胚生产流感疫苗的局限性,研究者们开始关注细胞培养疫苗生产技术.此文主要介绍了几种常用的细胞基质(如Vero、PER.C6、Madin-Darby狗肾细胞和其他动物细胞),阐述了利用细胞培养技术制备流感疫苗的方法及研究进展.相关研究显示细胞基质生产的流感疫苗与鸡胚生产的流感疫苗相比,效果相似或者更好.     

细胞工厂培养原代地鼠肾细胞工艺的建立及优化

 目的  采用40层细胞工厂(40-layer cell factory, CF40)工艺培养原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞,优化乙脑减毒活疫苗的生产工艺。 方法  用不同浓度新生牛血清培养不同接种密度PHK细胞,比较各组PHK细胞数量,确定CF40工艺的PHK细胞接种密度和新生牛血清浓度。通过对比CF40和15 L转瓶采用不同新生牛血清的PHK细胞培养情况,比较两种工艺对新生牛血清的选择性。对4个厂家CF40培养的PHK细胞数量进行单因素方差分析,判定对CF40的选择性。结果  CF40工艺的最有条件为PHK细胞接种密度为6.1×10⁵ ml^-1、新生牛血清浓度6%。CF40工艺对新生牛血清的选择性较低,能比转瓶工艺更稳定地培养更多的PHK细胞。4个厂家CF40培养的PHK细胞数量之间的差异无统计学意义（F=0.23,P＞0.05）,对CF40选择性低。 结论  采用CF40可以制备出满足乙脑减毒活疫苗生产要求的PHK细胞。     

体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及诱导分化为心肌细胞的研究

目的通过分离、培养脂肪间充质干细胞观察其生物学特性及诱导分化为心肌细胞,为心肌再生提供良好的干细胞来源。方法胶原酶消化分离成人脂肪来源的间充质干细胞并进行传代培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪测定CD29、CD31、CD34、CD44及细胞周期,MTT绘制细胞生长曲线。用第3代细胞进行诱导分化,观察不同浓度5-氮杂胞苷(5-Aza,1,3,5,10,15,20μmol/L)及不同作用时间(12,24,48,72h)诱导其向心肌细胞分化的差别,采用最佳浓度10μmol/L,最佳作用时间24h进行实验,分别在第7,14,21,28天用免疫细胞荧光染色鉴定心肌细胞α-横纹肌、肌球蛋白重链(MHC)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达,第14天反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌发育相关基因NKX2.5的表达。结果倒置相差显微镜下观察原代细胞,可见细胞呈梭型、核圆形或椭圆形,偶见双核。传代细胞核原代细胞形态相似,排列有了一定的方向性。流式细胞仪检测结果显示,第1、3、5代细胞均高表达CD29和CD44;而CD31始终表达很弱,可认为呈阴性表达;CD34在第1、3代细胞弱表达,在第5代细胞表达逐渐减弱为阴性。细胞生长曲线显示前3d处于细胞潜伏状态,第4天进入对数生长期,第10天达到顶峰。细胞周期检测结果显示G1期细胞为85.93%,S期为7.24%,G2期为6.83%。10μmol/L5-Aza诱导后7d进行免疫细胞荧光染色,未见有α-横纹肌、MHC、cTnI表达。14d少量细胞α-横纹肌和MHC阳性表达,cTnI阴性表达。21d表达α-横纹肌和MHC的细胞数量增多,并可见少量cTnI阳性表达。28dα-横纹肌、MHC、cTnT阳性表达数目均增多,RT-PCR结果显示NKX2.5呈阳性表达。结论成人脂肪中可以分离出脂肪间充质干细胞并且可以在体外培养传代,经过5-Aza的诱导可以向心肌细胞分化,为干细胞移植治疗和组织工程学种子细胞提供了更多的选择。     

补肾方剂对大鼠骨髓基质干细胞增殖与分化的影响

目的观察补肾方剂对体外培养SD大鼠骨髓基质干细胞细胞增殖、分化及矿化的影响。方法应用四甲基偶氮唑盐法、硝基苯磷酸盐法及茜素红染色方法观察不同浓度补肾方剂对体外培养骨髓基质干细胞在1、2、3、4、5d时的增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化结节形成的影响。结果不同浓度的补肾方均可促进骨髓基质干细胞增殖率提高,以中、高浓度组的作用较为明显(P<0.01);不同浓度补肾方剂可使ALP活性增强(P<0.01);中、高浓度组补肾活血方矿化结节数量显著多于对照组(P<0.01)。结论补肾方剂具有促进骨髓基质干细胞的增殖、分化及矿化的作用。