α7nAChR基因敲除HIV-1gp120转基因小鼠模型的构建

目的 通过构建双基因编辑小鼠模型（α7R-/-/gp120+）,为探索α7乙酰胆碱受体（α7 nAChR）介导gp120中枢神经毒性的作用和机制提供研究基础。方法 α7 nAChR基因敲除小鼠（α7R-/-）与HIV-1 gp120转基因小鼠（gp120+）杂交（F0）,从产生的F1小鼠中,选取基因型为α7R+/-/gp120+的小鼠进一步交配,得到F2小鼠。PCR法鉴定和筛选F3小鼠基因型,免疫组化分析双转基因动物模型蛋白表达;体外实验使用gp120蛋白和α7 nAChR抑制剂处理小胶质细胞,ELISA检测各组IL-1β与TNF-α表达情况。结 果 F3小鼠的PCR结果符合预期,其中有2只双基因编辑成功的小鼠。免疫组化结果显示双基因编辑小鼠（α7R-/-/gp120+）的脑组织缺乏α7 nAChR的同时高表达gp120蛋白。体外实验结果表明Gp120可促进小胶质细胞分泌IL-1β与TNF-α,而抑制α 7nAChR后IL-1β与TNF-α表达明显降低（P<0.001）。结论 α7R-/-/gp120+双基因修饰小鼠成功构建,且具有稳定遗传的特点,可为后续探索α7 nAChR介导gp120中枢神经毒性的作用和机制提供重要的动物模型。     

gp120转基因小鼠制备及初步鉴定

目的构建HIV-1B’亚型gp120转基因载体,制备gp120转基因小鼠。方法扩增gp120全长序列,根据读码框架定向连接到pSEAP2-control外分泌性真核表达载体上,插入GFAP启动子,回收含启动子-gp120-增强子的功能片段制备转基因小鼠,PCR和RT-PCR验证基因整合与mRNA转录。结果酶切鉴定与测序验证均证明构建了受GFAP启动子调控的gp120转基因载体,蛋白印迹分析显示其分泌性和组织特异性都很高;RT-PCR证实转基因小鼠存在gp120mRNA转录。结论成功构建了gp120转基因载体,并生产了founder小鼠。     

密码子优化的HIV-1型gp120基因重组腺病毒载体疫苗的构建与鉴定

目的 构建密码子优化型gp120基因重组腺病毒载体（rAden-mgp120）,为研发新型HIV预防性疫苗奠定基础.方法 首先利用PCR的方法扩增mgp120基因,将目的基因克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得重组穿梭载体克隆pENTR/D-TOPO-mgp120.经过穿梭载体克隆与表达载体（pAd-CMV/VS-DEST）间的重组反应获得表达克隆质粒pAden-mgp120,表达克隆线性化后转染HEK293A包装细胞,得到复制缺陷型重组腺病毒rAden-mgp120.结果 经PCR和测序鉴定,重组载体rAden-mgp120构建正确,转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为6.8x1011pfu/ml,该重组腺病毒载体能正确表达mgp120蛋白.结论 成功构建了重组腺病毒rAden-mgp120为HIV-1预防奠定了基础.     

Pumilio家族基因诱导性敲除小鼠模型的构建

目的：为探究出生后Pumilio家族的功能及其缺失对个体的影响,构建Pumilio1（Pum1）和Pumilio2（Pum2）双基因诱导性敲除的小鼠模型。方法：通过小鼠交配实验得到R26-ER^T2 Cre/+Pum1^flox/flox Pum^2-/-小鼠,并将同窝雄鼠设为对照组和实验组。分别对实验组3周和成年小鼠注射他莫昔芬,在DNA、RNA和蛋白水平表征主要脏器中Pum1的敲除效果;并表征精子发生过程中的病理变化、细胞增殖及凋亡情况。结果：实验组3周和成年雄鼠的胸腺和睾丸组织中Pum1表达水平极低,敲除效率均高于50%,Pum1和Pum2双基因诱导性敲除小鼠模型构建成功。在注射他莫昔芬结束的第21天,3周雄鼠胸腺、脾脏和睾丸的重量明显下降,睾丸病理HE染色实验显示精子形成障碍,TUNEL和BrdU染色后计数结果显示睾丸中生精细胞凋亡增加、增殖减慢。成年小鼠在注射他莫昔芬恢复后,Pum1在胸腺、心、肝、睾丸中的表达仍有降低,但睾丸病理HE染色显示精子发生未见异常。结论：该模型的建立首次展示Pumilio家族蛋白作为未来药物靶标的潜能,为深入研究Pumilio的功能及作为肿瘤治疗靶蛋白的研究奠定了理论基础。     

肝细胞特异性Sirt3基因敲除小鼠模型的构建

目的 运用Cre-loxP技术构建肝细胞特异性沉默信息调节因子3(silence information regulator 3,Sirt3)基因敲除(Sirt3^Δhep)小鼠,为研究肝细胞Sirt3基因在疾病中的生物学功能提供重要动物模型。方法 将loxP标记的Sirt3^flox/flox小鼠与Alb-Cre纯合子(Alb-Cre^+/+)小鼠进行交配,F1代Sirt3^flox/-/Alb-Cre^+/-小鼠再与Sirt3^flox/flox小鼠进行交配并鉴定,F2代基因型为Sirt3^flox/flox/Alb-Cre^+/-的小鼠即为本实验所构建的Sirt3^Δhep小鼠,Sirt3^flox/flox/Alb-Cre^-/-小鼠即为对照小鼠Sirt3^flox/flox小鼠。提取鼠尾DNA,通过PCR鉴定子代小鼠的基因型;免疫荧光双染观...     

HIV-1 gp120分子结构针对机体免疫应答的研究进展

HIV-1是引起艾滋病流行的主要病原体,本文就gp120的基因及分子结构进行了阐述,分析了gp120与宿主细胞相关分子的相互作用和gp120对T细胞、单核/巨噬细胞、B细胞的作用原理。     

HIV-1 gag-gp120嵌合基因重组杆状病毒载体的构建

目的 :构建含有 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体。方法 :利用基因重组技术将 B亚型中国株 HIV- 1的结构基因 gag与 gp12 0嵌合后再通过大肠杆菌 /杆状病毒系统构建重组杆状病毒载体。结果 :酶切电泳显示基因重组正确 ,电镜显示重组杆状病毒大量扩增。结论 :含有B亚型 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体构建成功 ,为进一步研究Gag- gp12 0嵌合蛋白的表达及其生物学活性奠定了基础。     

HIV-2env(gp120)基因在大肠杆菌中的表达

ＨＩＶ－２Ｅｎｖ蛋白（ｇｐ１２０）是病毒粒子吸附靶细胞膜上ＣＤ４受体的关键蛋白，ｇｐ１２０与ＣＤ４受体结合过程是ＨＩＶ感染机体的第一步。本文应用ＤＮＡ重组技术将ＨＩＶ－２ｅｎｖ（ｇｐ１２０）基因克隆到ｐＥＴ１７ｂ的Ｔ７启动子下游ＥｃｏＲＶ位点，构建成ｐＥＴ１７ｂ－ｇｐ１２０重组质粒，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示在３５０００（Ｍｒ）处有一特异蛋白带，表达量占菌体总蛋白的５．８％。蛋白印迹试验分析此蛋白能与ＨＩＶ－２阳性血清发生特异性反应。ＨＩＶ－２ｅｎｖ基因在大肠杆菌中的表达成功，为ＨＩＶ诊断试剂和疫苗的研究提供有益资料。     

人载脂蛋白A1基因转基因小鼠的建立

目的 建立系统性表达人载脂蛋白Al(APOA1)基因的转基因小鼠.方法 将人APOA1基因插入系统性表达启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立人APOA1转基因C57BL/6J小鼠.并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平,血生化分析检测不同月龄转基因小鼠与同龄野生型小鼠的血脂指标.结果 建立了2个不同表达水平的人APOA1基因的转基因小鼠品系;转入的人APOA1基因在血液、肝脏、心脏、肾脏、脾脏、血管组织中均有明显表达;血生化分析结果显示不同月龄转基因小鼠的血浆高密度脂蛋白胆固醇水平高于同龄的野生型小鼠,甘油三酯水平低于同龄野生型小鼠.结论 成功建立了系统性表达人APOA1基因的转基因小鼠,为研究高血脂以及高血脂相关的心血管病提供了工具.     

MTA1转基因小鼠的构建及鉴定

目的将人的MTA1外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建稳定高表达MTA1的小鼠模型。方法通过RT-PCR方法克隆人的MTA1编码序列,将MTA1插入真核表达载体pcDNA3.1构建pcDNA3.1-MTA1载体,回收片段后利用显微注射技术将目的基因片段注入到受精卵的雄原核中,使用MTA1特异性的引物经PCR鉴定出基因型阳性的转基因小鼠,再利用Western-blot及免疫组化方法检测MTA1在转基因小鼠全身级织表达情况。结果成功构建了MTA1转基因注射片段。在320枚显微注射受精卵中挑选出300枚存活卵移植到10只ICR小鼠假孕受体的输卵管中,10只ICR小鼠均怀孕,移植成功率为100%,共生出子代鼠80只,经PCR检测其中共有9只整合了MTA1基因,整合率为11.25%。经PCR鉴定MTA1整合阳性的F1代小鼠,再经Western-blot和免疫组化分析检测MTA1表达水平在脑、肺、肝、肠等组织中表达明显增高,肾、骨骼肌表达无差异。结论成功构建了脑、肝、肺、结肠高表达MTA1的转基因小鼠,为进一步MTA1研究奠定了良好的研究模型。     

PiggyBac转座酶转基因小鼠模型的建立

目的 建立表达PiggyBac转座酶转基因小鼠模型,为研究PiggyBac转座子介导基因修饰在小鼠中的应用提供工具。方法利用Cytomegalovirus (CMV) 启动子驱动PiggyBac转座酶基因的表达,经显微注射法建立C57BL/6J表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测PiggyBac转座酶在小鼠生殖系睾丸中的表达情况。PiggyBac转座酶转基因小鼠活性的检测,是通过与转座子供体转基因小鼠杂交检测供体位置变化来确定的。结果显微注射产生7只转基因小鼠并能传代,经RT-PCR筛选出一株在睾丸中相对高表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠。随后与转座子供体转基因小鼠杂交,子代双阳小鼠与野生型小鼠杂交基因型分离,产生的子代转座子供体单阳性小鼠中具有转座子供体片段的转座反应。结论成功建立了表达PiggyBac转座酶转基因小鼠动物模型,该模型为PiggyBac转座子技术在小鼠中的应用提供了有价值的工具动物。     

HIV-1膜蛋白gp120V3环的神经毒性研究

目的 体外观察人类免疫缺陷病毒-1（human immunodeficiency virus-1,HIV-1）膜蛋白gp120 V3环的神经毒性.方法通过小鼠大脑皮质原代神经细胞培养条件下TUNEL检测和培养上清乳酸脱氢酶释放试验,结合抗微管蛋白-2（microtubule associated protein-2,MAP-2）免疫荧光试验,观察人重组gp120蛋白神经毒性,并通过蛋白印迹法初步探讨其与凋亡调控蛋白bax与bcl-2的关系.结果重组人gp120 V3环多肽可诱导神经元凋亡和抑制神经突起形成,并呈浓度依赖性.gp120 V3环诱导神经细胞凋亡与抑制bcl-2表达有关.结论 HIV-1膜蛋白gp120 V3环具有神经毒性.     

甘丙肽过表达转基因小鼠的制作和鉴定

目的 建立甘丙肽（galanin,GAL）过表达转基因小鼠,为后续研究甘丙肽基因功能提供动物模型. 方法 重组质粒PDGFβ-GAL经XbaⅠ、HindⅢ双酶切后,将连接有启动子的甘丙肽基因片段回收纯化,用显微注射法将甘丙肽基因注入400枚受精卵的雄原核中,选取发育正常的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管壶腹部,待其产仔.用PCR方法鉴定子代小鼠基因型,蛋白印迹分析（Western blot）鉴定子代小鼠体内GAL蛋白表达情况. 结果 获得子代小鼠50只,有8只小鼠在基因组上整合有GAL基因,整合率为16％：Western blot显示转入的基因片段PDGF β-GAL在脑组织中的表达水平比肝组织高.结论 通过显微注射法成功建立了GAL过表达转基因小鼠模型.     

作用于HIV gp120的进入抑制剂研究进展

HIV-1病毒为包膜病毒,其感染靶细胞的第一步是由HIV包膜蛋白表面亚基gp120与靶细胞上的CD4分子和辅助受体(趋化因子受体CCR5或CXCR4等)结合,导致gp41的构型发生改变,启动病毒包膜与靶细胞膜的融合.与gp120相结合的一些抗体、蛋白、多糖、多肽和小分子化合物,都可能影响HIV-1病毒包膜和靶细胞膜融合...     

人sCD40L转基因小鼠模型的构建

目的研究阻断CD40-CD40L共刺激信号通路对移植皮肤免疫排斥反应的影响。方法通过RT-PCR技术克隆了呈可溶性表达的CD40L分子胞外区(sCD40L),利用K14启动子构建了sCD40L皮肤特异性表达载体,并利用该载体制备了转基因小鼠。结果所克隆的CD40L胞外区片段其大小及序列符合预期;以哺乳动物表达载体PCI为骨架,通过DNA重组,获得了含K14启动子和sCD40L编码区的皮肤特异性表达载体K14-sCD40L;通过显微注射和胚胎移植,PCR筛选检测:49只G0代小鼠有1只小鼠扩增出特异性条带,阴性对照无条带。结论成功建立sCD40L转基因阳性小鼠。     

严密型四环素调控系统调控的表达HCV-C基因双转基因小鼠模型的建立

目的 制备严密型四环素调控系统调控下表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)基因的双转基因小鼠,为进一步阐明核心蛋白Core与HCV感染所致的疾病以及与肝细胞癌发生的关系奠定基础.方法 严密型四环素调控部分(ApoE-rtTA-tTS)转基因阳性鼠和反应部分(TRE-HCV-C)转基因阳性鼠交配产生仔鼠,经PCR和Southcm blot分析筛选出阳性鼠.免疫组织化学检测HCV-C蛋白双转基因小鼠肝组织内表达情况及其肝脏的病理变化.结果 得到了2只携带有两种基因(tTS和HCV-C)的双转基因小鼠,成功制备了严密型四环素调控系统的HCV-C双转基因小鼠.结论 结果表明,所建立的严密型四环素调控系统在动物模型中是可行的和有效的,它消除了普通四环素调控系统存在的本底泄漏表达的缺点,是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具.     

一种红色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立广泛表达红色荧光蛋白(RFP)的转基因小鼠,便于组织和细胞移植研究.方法:把DsRed基因片段插入到pCAGGS载体的强启动子下游构建转基因载体pCAG-DsRed.经细胞转染验证,受精卵原核注射,建立红色荧光蛋白转基因C57BL/6小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型;红色荧光蛋白在组织中的表达情况,则通过荧光显微镜检测小鼠各组织器官冰冻切片.结果:pCAG-DsRed载体可以在真核细胞中表达RFP,经基因型分析和表型观察,得到两只红色荧光蛋白的首建鼠.经荧光显微镜观察各组织冰冻切片发现红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,其中在神经系统和肌肉组织中表达量较高.结论:成功建立了一种红色荧光蛋白转基因小鼠,红色荧光蛋白在转基因小鼠的神经系统和肌肉组织等中高表达.     

人免疫缺陷病毒I型外膜糖蛋白gp^120和gp^160在重组痘苗…

人免疫缺陷病毒Ｉ型（ＨＩＶ－１）是严重威胁人类健康的病原体，其主要抗原是病毒外膜糖蛋白ｇｐ＾１６０（ｇｐ＾１２０＋ｇｐ＾４１）。本文报道运用遗传工程技术，在噬菌体Ｔ７启动子或痘苗病毒启动子ｐ７．５控制下，在重组痘苗病毒系统中构建和表达ＨＩＶ－１ｇｐ＾１２０和ｇｐ＾１６０。进一步研究表明，在此系统中表达的重组ＨＩＶ－１ｇｐ＾１２和ｇｐ＾１６０以糖蛋白形式存在，保留着病毒在自然状况下的抗原表位构象，可