性别因素对CC57BL/6小鼠日本血吸虫感染所致肝脏病理及抗体免疫的影响

目的探讨性别因素对日本血吸虫感染所致C57BL/6小鼠肝脏病理及抗体免疫的影响。方法雌、雄C57BL/6小鼠分别感染日本血吸虫8周,应用HE染色、天狼星红染色观察小鼠肝脏病理变化。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测雌、雄C57BL/6小鼠血清抗可溶性成虫抗原(SWA)和可溶性虫卵抗原(SEA)特异性Ig G抗体水平,采用流式细胞术检测雌、雄C57BL/6小鼠脾脏、淋巴结中滤泡辅助性T(Tfh)细胞和调节性T(Treg)细胞水平。结果感染日本血吸虫8周后,雌[(28.050±3.576)×10~4μm~2]、雄小鼠肝组织中平均单个虫卵肉芽肿面积[(26.740±4.093)×10~4μm~2]差异无统计学意义(t=0.241,P=0.821);天狼星红染色结果显示,感染日本血吸虫雌、雄小鼠肝纤维化程度差异亦无统计学意义[天狼星红染色阳性区域平均比例:(7.667±1.856)%vs.(7.667±1.764)%;t=0,P=1;平均光密度:(0.023±0.003)vs.(0.027±0.007);t=0.447,P=0.678]。ELISA检测结果显示,雌、雄小鼠感染日本血吸虫8周后血清抗SWA[(2.098±0.037)vs.(1.970±0.071);t=1.595,P=0.162]和SEA特异性Ig G抗体水平[(3.738±0.039)vs.(3.708±0.043);t=0.512,P=0.623]差异均无统计学意义。流式细胞术检测结果表明,感染日本血吸虫8周后雌、雄小鼠脾脏[雌鼠:(8.645±1.356)%vs.(1.730±0.181)%,t=5.055,P=0.002;雄鼠:(8.470±1.161)%vs.(1.583±0.218)%,t=5.829,P=0.001]、淋巴结[雌鼠:(3.218±0.153)%vs.(1.095±0.116)%,t=11.040,P 0.001;雄鼠:(3.673±0.347)%vs.(0.935±0.075)%,t=8.994,P 0.001]中Tfh细胞比例均显著高于未感染小鼠,但雌、雄小鼠脾脏[(8.645±1.356)%vs.(8.470±1.161)%;t=0.098,P=0.925]和淋巴结[(3.218±0.153)%vs.(3.673±0.347)%;t=1.332,P=0.241]中Tfh细胞比例差异均无统计学意义。感染日本血吸虫8周雄鼠脾脏中Treg细胞比例与未感染小鼠无显著差异[(10.060±0.361)%vs.(10.130±0.142)%;t=0.174,P=0.867],而日本血吸虫感染雌鼠脾脏中Treg细胞比例显著高于未感染小鼠[(10.530±0.242)%vs.(9.450±0.263)%;t=3.021,P=0.023],但感染日本血吸虫雌、雄小鼠脾脏中Treg细胞比例差异无统计学意义[(10.530±0.242)%vs.(10.060±0.361)%;t=1.077,P=0.323];日本血吸虫感染8周后,雌[(17.150±0.805)%vs.(13.100±0.265)%;t=4.781,P=0.003]、雄鼠淋巴结中Treg细胞比例均较未感染小鼠显著增加[(18.550±0.732)%vs.(12.630±0.566)%;t=6.402,P 0.001],但感染日本血吸虫雌、雄小鼠淋巴结中Treg细胞比例差异无统计学意义[(17.150±0.805)%vs.(18.550±0.732)%;t=1.287,P=0.246]。结论利用C57BL/6小鼠研究日本血吸虫感染所致肝脏病理及抗体产生机制时,不需要考虑性别因素。     

经脾注射日本血吸虫虫卵诱发C57BL／6鼠肝脏细胞反应的初…

为探讨日本血吸虫虫卵肉芽肿形成机理和病理作用，本实验改进Ｂｏｔｒｏｓ方法，设虫卵可溶性抗原（ＳＥＡ）致敏组和未致敏组，选用Ｃ５７ＢＬ／６鼠经脾注射虫诱发小鼠日本血吸虫肝肉芽肿，并对虫卵诱发的细胞反应进行了观察。结果显示：（１）经脾注射虫卵诱发小鼠肝肉芽肿方法简单，安全，有效，所建模型，特别是致敏组模型在肉芽肿形成机理研究中较有价值。（２）ＳＥＡ致敏可加强日本血吸虫肝肉芽肿形成。（２）抗体或抗原抗体     

慢性日本血吸虫感染C57BL／6小鼠体内Th1／Th2细胞凋亡的检测

目的 观察日本血吸虫感染晚期C57BL／6小鼠体内Th1、Th2细胞凋亡水平的变化。方法运用流式细胞技术，采用表面分子、胞内因子同时染色的三色标记和间接标记的方法，对日本血吸虫感染13周的C57BL／6小鼠脾脏、淋巴结中的Th1、Th2细胞的凋亡水平进行观察。结果日本血吸虫感染晚期C57BL／6小鼠与正常小鼠相比，Th1、Th2细胞凋亡均显著增加，但Th1细胞凋亡较多而Th2细胞凋亡较少。此阶段Th1细胞凋亡比Th2细胞更加易感。结论Th1、Th2细胞凋亡易感性的不同可能是导致血吸虫感染晚期Th2极化的原因之一，此为血吸虫感染过程中Th极化研究提供了新的证据。     

重组日本血吸虫副肌球蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的检测

目的 探讨重组日本血吸虫副肌球蛋白（rSj97)免疫小鼠产生抗感染保护力的机制。方法 用ELISA法对每次免疫前、攻击感染前的免疫小鼠血清中特异性抗体的动态及滴度进行检测。结果 第1次免疫后即产生了特异性抗体,第2次加强免疫后抗体水平进一步上升,攻击感染前达最高。攻击感染前的血清抗体滴度测定结果显示,平均抗体滴度达1：51 200。结论 rSj97免疫小鼠可引起明显的体液免疫应答。     

重组日本血吸虫副肌球蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的检测

目的探讨重组日本血吸虫副肌球蛋白(rSj97)免疫小鼠产生抗感染保护力的机制.方法用ELISA法对每次免疫前、攻击感染前的免疫小鼠血清中特异性抗体的动态及滴度进行检测.结果第1次免疫后即产生了特异性抗体,第2次加强免疫后抗体水平进一步上升,攻击感染前达最高.攻击感染前的血清抗体滴度测定结果显示,平均抗体滴度达151200.结论rSj97免疫小鼠可引起明显的体液免疫应答.     

日本血吸虫酚氧化酶抗原诱导免疫对病鼠肝脏病理变化的影响

目的观察日本血吸虫酚氧化酶天然蛋白抗原诱导免疫对病鼠肝脏的病理变化.方法将42 d活成虫置于含0.05%戊巴比妥钠的RPMI 1640培养基中孵育8 h后洗净,匀浆,超声粉碎、低温高速离心,将含酚氧化酶的上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,嗣后分别在两侧切取胶宽约1 cm进行酶染色,解剖刀准确切下相应的未染色的凝胶.冻干后碾成粉末,高速电动匀浆成浆糊状,冷浸过夜.高速离心得上清即为日本血吸虫酚氧化酶粗抗原.设立3组进行免疫实验:实验组、佐剂对照组和空白对照组.初次免疫后第2、4周,各重复1次加强免疫,最后1次免疫10 d后用新鲜逸出尾蚴(40±1)条/鼠进行攻击感染.42 d剖杀动物,观察日本血吸虫感染小鼠肝脏的病理变化.结果与对照组相比,酚氧化酶免疫实验组小鼠肝脏表面较光滑,隐约可见少量灰白色小点,肝色泽略带灰色,质地较软;压片观察小鼠肝脏内虫卵集聚数量明显减少,且以未成熟虫卵为主.肝脏内伴少量肝细胞坏死,细胞浸润不明显,可见较多未成熟卵周围无肉芽肿反应.小鼠肝组织内虫卵肉芽肿的平均直径和面积比对照组小鼠肝组织内虫卵肉芽肿的平均直径和面积明显减小,两组间差异有非常显著性(P<0.01).结论日本血吸虫酚氧化酶蛋白具抗原性,能诱导宿主一定的抗血吸虫病的免疫保护性作用.     

经脾注射日本血吸虫虫卵诱发C57BL／6鼠肝脏细胞反应的初步探讨

为探讨日本血吸虫虫卵肉芽肿形成机理和病理作用，本实验改进Ｂｏｔｒｏｓ方法，设虫卵可溶性抗原（ＳＥＡ）致敏组和未致敏组，选用Ｃ５７ＢＬ／６鼠经脾注射虫卵诱发小鼠日本血吸虫肝肉芽肿，并对虫卵诱发的细胞反应进行了观察。结果显示：（１）经脾注射虫卵诱发小鼠肝肉芽肿方法简单、安全、有效；所建模型，特别是致敏组模型在肉芽肿形成机理研究中较有价值。（２）ＳＥＡ致敏可加强日本血吸虫肝肉芽肿形成．（３）抗体或抗原－抗体复合物作用参与日本血吸虫肝肉芽肿形成。（４）虫卵及虫卵肉芽肿均对肝细胞具有一定损伤作用。     

斑点免疫金银染色检测日本血吸虫抗体影响因素的探讨

本文对不同封闭液及其稀释液、不同显影时间、不同方法保存的金标记抗体对斑点免疫金银染色检测日本血吸虫抗体实验结果的影响进行了探讨。认为以适当浓度的羊血清/BSA作封闭液,小牛血清作稀释液较好;20℃显影20min为宜;金标抗体以不加NaN_3—20℃保存较佳,有效期可达2年以上。     

丙烯硫脲对日本血吸虫感染小鼠肝脏病变的影响

目的　观察丙烯硫脲对日本血吸虫感染小鼠肝脏病变的影响。方法　小鼠感染日本血吸虫尾蚴 2 2d后 ,隔日一次按 30 0mg/kg腹腔注射酚酶抑制剂丙烯硫脲 ,至感染后 4 2d剖杀动物 ,观察日本血吸虫感染小鼠肝脏的病理变化。结果　与感染对照组相比 ,实验组小鼠肝脏表现为散在分布的炎性细胞浸润灶 ,中心未见虫卵 ,仅见一些颗粒状物质。其平均直径和面积均较感染对照组的典型虫卵肉芽肿显著减小 (P <0 .0 1)。结论　感染小鼠腹腔注射丙烯硫脲后肝脏内未见虫卵肉芽肿的形成。     

亮氨酸氨肽酶在日本血吸虫感染中的抗体应答特征

目的以亮氨酸氨肽酶（LAP）作为检测抗原,观察日本血吸虫感染后不同时期动物血清中相应抗体的动态变化特征。方法应用免疫印迹试验（Western blot）鉴定日本血吸虫LAP（SjLAP）重组蛋白的表达,并利用His镍柱纯化目的蛋白。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测感染前、后不同时期小鼠及猪血清中LAP诱导抗体产生的变化特征。结果重组蛋白SjLAP可与anti-His单克隆抗体反应,并可被日本血吸虫感染后小鼠血清所识别。获得高浓度重组蛋白SjLAP,以该蛋白为抗原,采用ELISA法检测发现感染后4周猪血清和感染后6周小鼠血清抗体水平达到高峰;且随着虫卵大量出现,抗体水平均显著下降（P均〈0.01）。结论 SjLAP在感染早期的高表达可能对日本血吸虫病早期诊断具有一定的参考价值。     

日本血吸虫虫卵破坏小鼠脾脏结构的作用

目的观察日本血吸虫虫卵对脾脏结构的病理影响。方法 C57BL/6小鼠分别经尾静脉注射日本血吸虫虫卵或虫卵可溶性抗原,经剖腹手术后向小鼠脾脏注射虫卵,4周后剖杀小鼠分离脾脏,石蜡切片苏木素伊红染色观察脾脏结构。以单性和双性尾蚴感染小鼠,9周后剖杀比较组间脾脏质量,石蜡切片观察各组小鼠脾脏结构。结果尾静脉注射虫卵小鼠脾脏淋巴滤泡数目减少,边缘区模糊难辨。手术将虫卵注射入小鼠脾脏4周后,虫卵注射部位淋巴滤泡萎缩甚至消失。单性尾蚴感染小鼠脾脏质量（0.15±0.01）g,显著低于双性尾蚴感染组（0.41±0.03）g（P〈0.01）。苏木素伊红染色脾脏切片显示单性尾蚴感染组小鼠脾脏淋巴滤泡未被破坏,而双性尾蚴感染组脾脏淋巴滤泡消失。结论日本血吸虫虫卵对C57BL/6小鼠脾脏结构有破坏作用。     

紫外线辐照致弱日本血吸虫尾蚴诱导C57BL/6 小鼠皮肤早期免疫应答动态变化的研究

目的观察紫外线辐照致弱日本血吸虫尾蚴经耳廓免疫C57BL/6小鼠后,小鼠皮肤组织早期免疫应答的动态变化.方法 98只小鼠测定双侧耳廓厚度后,14只作为0 d组不感染/免疫,其余平均分为2组.一组经双侧耳廓分别感染正常尾蚴150 条/耳, 另一组经双侧耳廓分别免疫紫外线辐照致弱尾蚴150条/耳.感染/免疫后第1、2、4、7、14、21天分别剖杀2组小鼠各7只,测定耳廓厚度.取感染处的耳廓组织,左侧进行培养,收集上清检测相应细胞因子.右侧纵切为二,一半进行HE染色观察炎症反应;另一半应用免疫组化技术观察皮肤组织中IL-12和CD11c分子的表达.结果正常尾蚴感染的小鼠皮肤炎症反应在第7天达到高峰后逐渐下降,第21天基本恢复;而辐照尾蚴免疫小鼠耳廓皮肤在第14天炎症反应才达高峰,第21天反应仍然十分强烈.尾蚴穿皮后第4天,组织中有较高水平的CD11c及IL-12分子表达.皮片培养细胞因子定量检测也显示：与Th1细胞应答相关的IL-12、IFN-γ及Th2型因子IL-10早期在正常、辐照尾蚴差异无显著性.结论和正常尾蚴相比,辐照致弱尾蚴诱导的皮肤免疫应答持续时间长、强度高,但两者诱导Th细胞向不同方向极化并不发生于免疫应答启动阶段.     

重组日本血吸虫铁蛋白的表达纯化及诱导小鼠保护性免疫研究

目的　表达、纯化重组日本血吸虫铁蛋白 ,观察其免疫小鼠后抗日本血吸虫的免疫保护作用。方法　用基因重组技术 ,将日本血吸虫铁蛋白基因亚克隆至表达载体 pGMC上 ;在IPTG诱导下 ,重组日本血吸虫铁蛋白得到高效表达 ;用电泳层析法分离纯化日本血吸虫铁蛋白 ;用SDS -PAGE和Western -blot鉴定表达纯化产物 ;用纯化的重组铁蛋白免疫小鼠三次 ,分别在 0、2、4周进行。第 6周每鼠经腹部感染 4 0± 1条日本血吸虫尾蚴。 4 2天后剖杀冲虫 ,计数虫数及肝卵数。结果　纯化的重组铁蛋白分子量为 4 0kD ,具有较好的免疫原性 ,能被日本血吸虫感染兔血清识别。与对照组相比 ,纯化重组铁蛋白免疫小鼠组的减虫率为 2 4 5 % ,减卵率为 4 5 8%。结论　重组日本血吸虫铁蛋白不仅在大肠杆菌中得到高效表达 ,而且纯化的铁蛋白分子能诱导抗日本血吸虫病的保护性免疫。     

维生素E对小鼠日本血吸虫性肝损害保护作用的实验研究

目的探讨维生素E（VitE）对小鼠日本血吸虫性肝损害的保护作用及其机制。方法日本血吸虫尾蚴皮肤敷贴法感染小鼠构建日本血吸虫病模型，随机分5组：正常对照组、模型组及VitE高、中、低剂量组，感染尾蚴同时分别给予高、中、低剂量（150、50、5mg／kg）VitE，灌胃给药，每日1次共8周，8周末处死动物，HE、VG染色及透射电镜对肝组织进行病理学检查，应用分光光度法检测肝组织丙二醛（MDA）、羟脯氨酸（Hyp）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用免疫组织化学SP法检测肝星状细胞（HSC）标记物α-平滑肌动蛋白（aSMA）表达情况，并检测血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。结果VitE抑制模型组肝脏虫卵肉芽肿反应，减小肉芽肿直径（P〈0．01），减轻炎性细胞浸润和肝细胞变性、坏死程度；降低ALT和AST水平（P〈0．01）；降低肝组织MDA含量（P〈O．01），提高SOD活性（P〈0．01）；减少α—SMA阳性细胞数（P〈0．01），均呈剂量效应关系。VitE对肝脏Hyp含量无明显影响（P〉0．05）。结论VitE对小鼠日本血吸虫性肝损害具有保护作用，其机制与VitE抑制肝脏虫卵肉芽肿和炎症反应、抗脂质过氧化作用、抑制HSC活化和增殖及保护肝脏细胞免受自由基损害有关。     

日本血吸虫多价DNA疫苗免疫保护作用的研究

目的研究日本血吸虫多价DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫保护作用.方法65只BALB/c雌性小鼠随机分为5组,各组小鼠分别肌肉注射纯化的质粒DNA pcDNA3.1(对照组)、pcDNA3.1-TPI(TPI)、pcDNA3.1-(CDR3)6[(CDR3)6]、pcDNA3.1-TPI-linker-(CDR3)6(TLC)和pcDNA3.1-(CDR3)6-linker-TPI(CLT),每鼠100μg.每隔2周加强免疫1次,共3次.末次免疫后4周每鼠经腹部皮肤攻击感染(45±1)条日本血吸虫尾蚴,45 d后剖杀,计数成虫及肝脏虫卵数.首次免疫前2天及感染前2天经尾静脉采血检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1、IgG2a.末次免疫后2周取小鼠脾脏制备单个脾细胞,检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平.结果TPI、TLC组和CLT组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体,抗体亚类IgG2a/IgG1的比值分别为1.71、2.71和4.70,而其他两组则未检测到特异性IgG抗体;TPI、TLC组和CLT组小鼠的IL-2、IFN-γ较对照组均有不同程度的升高,IL-4则无明显差异.多价DNA疫苗TLC组和CLT组减虫率分别达到37.30%、39.09%,减卵率分别为41.61%、49.54%,均显著高于TPI组和(CDR3)6组(P均＜0.05).结论多价DNA疫苗相对于单价DNA疫苗能诱导小鼠产生较高的免疫保护作用,且诱导宿主产生较高的以Th1为主的免疫应答.     

Polyinosinic-polycytidylic acid attenuates hepatic fibrosis in C57BL/6 mice with Schistosoma japonicum infection

The development of hepatic fibrosis is the principal cause of morbidity and mortality in human beings infected with schistosoma. In this study, we investigated the effect of polyinosinic-polycytidylic acid (poly I:C) on Schistosoma japonicum (S. japonicum) egg-induced liver fibrosis. S. japonicum cercariae infected mice were injected with poly I:C at the onset of egg granuloma formation (early phase poly I:C treatment) or after the formation of liver fibrosis (late phase poly I:C treatment). Our results showed that both early and late phase poly I:C treatment significantly reduced collagen deposition and hepatic stellate cell activation in the liver. Poly I:C is one of the most effective adjuvants for Th1 type responses, and its protective effect on liver fibrosis was accompanied by increased IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-12, TNF-α, and IL-10 mRNA expression, and decreased IL-4 and IL-5 mRNA expression. Moreover, poly I:C injection also enhanced the mRNA expression of natural killer group 2 member D (NKG2D) and tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). Therefore, it is indicated that poly I:C can significantly attenuate S. japonicum egg-induced hepatic fibrosis, which may be partly dependent on the increased Th1 response and decreased Th2 response.     

衰老下调小鼠对日本血吸虫感染的免疫应答

目的研究衰老对小鼠感染日本血吸虫后免疫应答的影响。方法幼龄(2月龄)和老龄(18月龄)雌性BALB/c小鼠各8只,每鼠感染日本血吸虫尾蚴(40±1)条。感染后6周剖杀小鼠,经门静脉灌注收集成虫,计数虫荷;KOH消化法收集肝脏中的虫卵,并计数。制作肝脏连续病理切片,测量两组小鼠肝脏增生期平均单卵肉芽肿的大小,计算单卵肉芽肿体积。常规法制备脾淋巴细胞悬液进行T淋巴细胞增殖实验,计算刺激指数(SI)。ELISA法检测脾淋巴细胞中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)的表达水平。结果幼龄组小鼠体内的虫荷和每克肝组织虫卵数分别为26.00±2.42和(2.08±0.87)×104,老龄组虫荷和每克肝脏虫卵数分别为19.75±1.95和(1.59±1.05)×104,两组间的差异有统计学意义(P<0.05)。幼龄组肝脏单卵肉芽肿平均体积[(47.02±24.13)×10-3 mm3]明显大于老龄组[(30.13±10.97)×10-3 mm3](P<0.05)。T淋巴细胞增殖实验结果显示,老龄组脾淋巴细胞对ConA的增殖反应(SI:1.08±0.12)低于幼龄组(SI:1.31±0.14),其脾细胞培养上清中I...     

日本血吸虫重组32×103蛋白诱导小鼠保护力的研究

目的用重组日本血吸虫32×103蛋白(rSj32×103)免疫Balb/c鼠,检测特异性IgG抗体水平,并观察抗日本血吸虫的保护效果。方法用rSj32×103加佐剂免疫小鼠3次,分别在0、2、4周进行,第6周每鼠经腹部感染(40±1)条日本血吸虫尾蚴,感染后42d剖杀,计算减虫率。并用ELISA方法检测免疫后的抗体反应。结果间接ELISA测得免疫鼠特异性IgG抗体滴度达1∶12800。与对照组相比,减虫率为21.9%。结论用rSj32×103免疫小鼠后可诱导特异性IgG抗体,并能发挥一定的免疫保护作用。     

Neutropenia augments experimentally induced Schistosoma japonicum egg granuloma formation in CBA mice,but not in C57BL/6 mice

The present study was designed to investigate the role of neutrophils during the development of Schistosoma japonicum egg granulomas, in C57BL/6 and CBA mice. Laid eggs were implanted into the liver and monoclonal antibody, RB6-8C5, was used to eliminate neutrophils. After daily antibody treatment between days 9 and 13 of egg implantation, both strains of mice showed a marked decrease in neutrophil infiltration and coagulative hepatocyte necrosis at 2 weeks. At 4 weeks, after antibody administration every other day between days 16 and 26, granuloma formation in C57BL/6 mice was not affected by the treatment, whereas CBA mice exhibited a significant increase of reactions. Neutropenia augmented the Th2 cytokine response (IL-4, IL-13 and IL-5), but not for IFN-gamma at any time point examined and in either strain of mice. Higher levels of IL-4 and IL-13 were noted in CBA mice at early and late stages of granuloma formation, compared to C57BL/6 mice. There was also a striking difference in IL-13 production between the two strains. Our results indicate that neutropenia is associated with a significant augmentation of S. japonicum egg-induced granuloma formation in CBA mice, probably through increase in Th2 cytokines, however, the effects differ between early and late stages and between high and low responders.