前列腺癌肿瘤微环境树突状细胞与T细胞免疫的关系

【目的】了解前列腺癌组织树突状细胞与肿瘤微环境T细胞免疫的关系。【方法】对 2 2例前列腺癌组织和周围正常前列腺组织用S10 0、CD3、CD2 1和CD14mAb分别作SP免疫组化染色 ,光镜下对阳性细胞计数并计算细胞指数 ,对癌组织S10 0 和CD3 细胞指数行相关性分析。【结果】前列腺癌组织和正常组织可观察到S10 0 DCs和CD3 T细胞分布 ,而CD2 1 B细胞和CD14 单核 /巨噬细胞均少见。癌组织中S10 0 DCs指数和CD3 T细胞指数均明显少于周围正常组织 (P<0 0 5 ) ,癌组织S10 0 DCs指数与CD3 T细胞指数呈正相关 (r =0 86 ,P <0 0 5 )。【结论】DCs是前列腺癌肿瘤微环境中的主要抗原提呈细胞 ,癌组织DCs数量减少可能与前列腺癌肿瘤微环境T细胞免疫功能低下有关。     

正常人PBMC中T细胞的PD-1表达及其表型分析

目的观察正常人外周血单个核细胞(PBMC)T细胞的PD-1表达,并对其表型进行分析。方法分离正常成年人PBMCs,利用流式细胞术检测CD4、CD8、CD45RA、CD27和PD-1等表面分子的表达;通过对比分析,了解PD-1+T细胞表型与记忆T细胞的关系。结果正常成年人周围血中CD4+PD-1+T细胞和CD8+PD-1+T细胞的平均表达水平为(8.71±3.97)%,CD8+PD-1+T细胞的频率为(2.44±0.76)%。正常人外周血CD4+PD-1+T细胞可分成3个亚群,即初始T细胞(CD45RA+CD27+T细胞)、中央记忆型(CD45RA-CD27+)T细胞和效应记忆型(CD45RA-CD27-)T细胞,其比例分别为(18.5±8.79)%、(65.0±13.84)%和(15.5±5.12)%,而在CD4+PD-1-T细胞中3种T细胞的比例分别为(68.25±10.33)%、(27.75±9.04)%和(3.0±1.22)%。结论正常人周围血中存在CD4+PD-1+T细胞,并且多为中央记忆T细胞,而CD4+PD-1-T细胞则多为初始T细胞。     

PD-1在器官移植患者T细胞上的表达及其意义

目的:检测共刺激分子PD-1在应用免疫抑制剂的器官移植患者外周血单个核细胞(PBMCs)和T细胞上PD-1的表达,并对其表达的意义以及抗PD-1单克隆抗体与免疫抑制剂的协同作用进行探讨。方法:采用流式细胞分析技术,应用单标记和双标记的方法,对应用免疫抑制剂的肝移植和肾移植患者的外周血单个核细胞和T细胞上PD-1的表达进行检测。以混合淋巴试验在体外模拟移植模型,应用MTT法,观察PD-1单抗与免疫抑制剂的协同作用。结果:PD-1在应用免疫抑制剂的器官移植患者PBMCs和T细胞上有特异性高表达,环孢素A(CsA)能诱导PD-1在PBMCs上的表达,且抗PD-1单克隆抗体与CsA联用具有协同作用。结论:PD-1可作为抗移植排斥作用的免疫干预新靶点。     

HIV-1感染者CD8~+T细胞表面PD-1表达水平的研究

目的探索我国HIV感染者CD8+T细胞表面PD-1表达水平及其与疾病进展的关系。方法运用流式细胞术测定72例HIV-1感染者和29例健康对照外周血CD8+T细胞表面PD-1表达水平,分析PD-1表达水平与HIV感染者CD4+T细胞计数和血浆病毒载量的相关性。结果 HIV感染者外周血CD8+T细胞表面PD-1表达水平显著高于健康对照(30.395%vs 18.450%,P=0.001),且与CD4+T细胞计数负相关(r=-0.401,P0.001),与病毒载量正相关(r=0.247,P=0.0368);CD4+T细胞计数小于200细胞/μl的感染者CD8+T细胞表面PD-1表达水平显著高于CD4+T细胞计数大于500细胞/μl的感染者(P=0.002);PD-1的表达在新发感染期和艾滋病期出现两个高峰;长期不进展者PD-1的表达水平与正常对照组差别无统计学意义。结论 HIV感染可显著上调CD8+T细胞表面PD-1的表达水平,PD-1表达水平的变化与HIV疾病进展密切相关。     

慢性乙肝患者血中细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1/PD-L1的表达与病情的相关性

目的  研究慢性乙型肝炎患者外周血中细胞毒性T淋巴细胞表面程序性死亡分子-1（PD-1）/程序性死亡分子-1配体（PD-L1）的表达及其与病情的相关性。方法  选择慢性乙型肝炎患者90例和健康体检者82例进行研究。分别纳入慢性乙肝组和健康对照组,检测外周血细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1、PD-L1的表达量以及血清生化指标。结果  慢性乙肝组患者外周血中细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1和PD-L1的表达量显著高于健康对照组,乙型肝炎病毒载量越高、外周血中细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1和PD-L1的表达量越高;慢性乙肝组患者血清中ALT、AST、IL-6、IL-8的含量均显著高于健康对照组且与外周血中细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1和PD-L1的表达量呈正相关。结论  慢性乙型肝炎患者外周血中细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1和PD-L1的表达量显著升高且与肝损伤程度、炎症反应程度相关。

     

HCV感染者外周血T细胞PD-1的表达水平研究

目的 探讨HCV感染者外周血T细胞程序性死亡受体1 (programmed cell death1, PD-1)表达情况及与血清学指标的相关性.方法 应用流式细胞术检测43例HCV感染者外周血T淋巴细胞PD-1及其配体B7-H1水平,与29例正常健康人作比较;COBAS AMPLICOR自动载量仪检测HCV感染者血清病毒载量,同时进行肝功能检测. 结果 HCV感染组T细胞PD-1/ B7-H1表达水平明显高于对照组(P<0.01);HCV RNA阳性组外周血T细胞PD-1表达水平与病毒载量存在统计学正相关关系(r=0.442,P<0.01);HCV感染组PD-1分子的表达水平与血清转氨酶成正相关(r=0.626,P<0.01).结论 HCV感染后外周血T细胞PD-1表达水平明显升高,从而抑制T细胞的免疫功能,导致病毒持续感染并造成肝细胞进一步损伤.     

氩氦刀治疗恶性黑色素瘤对小鼠T细胞免疫的影响

目的 研究氩氦刀治疗小鼠恶性黑色素瘤后激活特异性T淋巴细胞的免疫效应。方法12只C57／BL小鼠分3组,A组4只接种B16恶性黑色素瘤细胞,并行氩氦刀治疗;B组4只建立荷瘤模型;C组4只为对照。利用混合淋巴细胞反应检测特异性细胞毒性T淋巴细胞的增殖。结果氩氦刀治疗后可显著刺激特异性T淋巴细胞增殖,与对照组比较具有显著性差异（P〈O．01）。结论氩氦刀治疗可有效激活小鼠肿瘤抗原特异性的T细胞。     

类风湿关节炎患者外周血CD4+T细胞表面PD-1的表达及意义

目的观测类风湿关节炎（RA）患者外周血CD4+T细胞表面程序性死亡因子1（PD-1,CD279）表达的变化、探讨PD-1在RA发生、发展中的作用。方法应用流式细胞术检测40例RA患者和20例健康体检者外周血CD4+T细胞表面PD-1的阳性率,对比分析RA患者病情活动组与稳定组间PD-1表达的差异,分析PD-1阳性率与C反应蛋白（CRP）,红细胞沉降率（ESR）,类风湿因子（RF）等临床指标的相关关系。结果病情活动期RA患者外周血CD4+T细胞PD-1阳性率为（32.90±12.15）%,明显高于健康体检者（22.32±6.04）%,差异有统计学意义（P＜0.01）;稳定期RA患者的PD-1阳性率为（27.49±6.79）%,与健康体检者的差异无统计学意义（P＞0.05）。RA患者中,CD4+T细胞表面PD-1阳性率与RF呈正相关（r=0.525,P＜0.01）,与ESR呈正相关（r=0.328,P＜0.05）,与CRP无明显相关性（r=0.232,P＞0.05）。结论病情活动期RA患者外周血CD4+T细胞表面PD-1表达增加,可能对疾病的发生、发展具有重要意义。     

白细胞介素12基因转染抑制B16细胞成瘤性及转移性的研究

目的探讨白细胞介素１２（ＩＬ１２）基因转移对弱免疫原性的小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞生长与转移的影响。方法构建小鼠ＩＬ１２两个亚单位ｐ４０、ｐ３５ｃＤＮＡ表达载体;经脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮ介导,将两真核表达载体同时导入Ｂ１６细胞;应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）检测ｐ４０、ｐ３５ｍＲＮＡ表达;用生物学活性检测法（致分裂激活的活化的小鼠脾细胞增殖）检测ＩＬ１２分泌;经皮下或静脉接种肿瘤细胞,检测其体内成瘤性及转移性。结果ＩＬ１２基因转染的Ｂ１６细胞（Ｂ１６ＴＩＬ１２）能够表达ｐ４０及ｐ３５ｍＲＮＡ,分泌有生物活性的ＩＬ１２;Ｂ１６ＴＩＬ１２细胞体内成瘤性降低,成瘤延迟,肿瘤生长慢,荷瘤小鼠存活期延长（Ｐ＜００１）;肺转移率降低,肺内转移灶明显减少（Ｐ＜００１）。结论ＩＬ１２基因转染可明显抑制肿瘤生长与转移     

IL-12联合B7-1基因放射治疗对小鼠B16移植肿瘤生长的影响

目的：探讨基因联合放疗对小鼠B16移植肿瘤的抑制作用。方法：碱裂解法提取纯化质粒DNA，微量注射法直接将质粒DNA导入体内肿瘤；建立荷瘤小鼠模型, 于小鼠右后肢皮下接种5×10⁵个B16黑色素瘤细胞，待肿瘤直径达0.3~0.5 cm时开始治疗；肿瘤局部注射pNE-mIL-12和pcDNA-B7-1质粒3次，并给予3次X线照射，观察小鼠移植肿瘤的生长情况。结果：pNE-mIL-12重组质粒与pcDNA-B7-1质粒联合2 Gy放射治疗组肿瘤生长速率最低，小鼠生存时间明显延长（P<0.01~P<0.001），末次照射后31 d小鼠死亡率仅为22.2%，而且其中有1只小鼠肿瘤消退。结论：多基因联合放疗可有效抑制小鼠B16移植肿瘤的生长，其效果好于单基因治疗和单纯放疗。     

Effector cells derived from naive T cells used in tumor immunotherapy of mice bearing B16 melanoma

Background Adoptive cell transfer （ACT） immunotherapy has been used clinically for years to treat malignancies.Improving the killing efficiency of effector cells,such as tumor-specific cytotoxic T lymphocytes （CTLs）,is an important component for enhancing the clinical response of cancer immunotherapy.Hence,we explored a novel method for preparing cancer-specific CTLs using naive T lymphocytes.Methods C57BL/6 mice bearing B16 melanoma tumors were pretreated with cyclophosphamide （CTX） by peritoneal injection.The immunosuppressive influence of CTX on tumor regression and the tumor microenvironment was assessed.Naive T cells and T cell pools were isolated via negative selection using immunomagnetic beads.The proliferative potential and cytokine production of different T cell subpopulations were evaluated in vitro.Tumor-specific CTLs derived from naive T cells （naive CD4＋ T cells：naive CD8＋ T cells=2：1） and pooled T cells were generated in vitro,respectively.B16 melanoma-bearing C57BL/6 mice were pretreated with CTX,followed by ACT immunotherapy using dendritic cell-induced CTLs.The homing abilities of the effector cells and interleukin-2 （IL-2）,interferon-y,granzyme B,and perforin mRNA levels in tumor tissues were evaluated,and the change in tumor volume was measured.Results Mice receiving CTX peritoneal pretreatment injections did not display tumor regression compared with control mice.However,a significant downregulation of splenic Tregs and tumor growth factor-β1 （TGF-β1） and interleukin-10 （IL-10） serum levels was observed （P ＜0.05）.Naive T cells showed a stronger proliferative capacity and elevated cytokine production than did pooled T cells （P ＜0.05）.In addition,effector cells generated from naive T cells displayed more potent antitumor activity in vivo than those derived from pooled T cells （P ＜0.05）.Conclusion Effector cells derived from the naive T cells possess a stronger proliferative potential,homing capacity,and enhanced cytokine production,which leads to a superior antitumor response.     

pNEgr-mIL-12真核表达重组质粒的构建及在COS-7细胞和黑色素瘤B16细胞中的表达

目的:构建含辐射敏感启动子的pNEgr-mIL-12真核表达载体,转染哺乳动物细胞后经不同剂量X射线照射,检测mIL-12的表达.方法:限制性内切酶酶切构建pNEgr-mIL-12表达载体;脂质体转染法转染COS-7细胞和B16细胞;ELISA法检测mIL-12p70表达.结果:①pNEgrmIL-12重组质粒转染瞬时表达细胞COS-7细胞,经不同剂量X射线照射后,照射组mIL-12表达量比未照射组明显增高(P＜0.05,P＜0.001),约为未照组的1.5～2.5倍;在2.0 Gy照后表达增高最为明显,表达于照后4 h达峰值,在观察的72h内保持于较高水平;②转染pNEgr-mIL-12的B16细胞于2.0 Gy照后增高明显,为未照射组的1.5倍;并且经2.0 Gy X射线照射后随时间延长表达水平逐渐增高;低至0.05 Gy的剂量对两种细胞亦均有激活作用.结论:pNEgr-mIL-12重组质粒具有辐射激活下游基因表达的功能,且经不同剂量X射线照射后表达均有增强,尤以2.0 Gy照射组作用明显,但在低剂量50、75、100 mGy照后表达水平增高与对照组差异均有显著性.     

microRNAs在恶性黑色素瘤B16F0和B16F10细胞中差异表达的研究

目的: 探讨及分析黑色素瘤细胞B16F0和B16F10中microRNAs（miRNAs）表达差异性,筛选与恶性黑色素瘤增殖、迁移和侵袭相关的miRNAs。方法: 通过体内和体外实验分别验证B16F0和B16F10细胞的差异,并通过RiboArrayTMmiDETECTTMMouse Array分析小鼠黑色素瘤B16F0和B16F10细胞中miRNAs表达的差异性,筛选出与恶性黑色素瘤相关的miRNAs,并应用Real-time PCR验证筛选结果的可信性。结果: B16F10细胞比B16F0具有更强的迁移和增殖能力,芯片结果显示,与黑色素瘤B16F0细胞相比,在B16F10细胞中有38个miRNAs存在表达差异,其中15个miRNAs表达上调,23个miRNAs表达下调,均具有统计学意义。Real time PCR对部分miRNAs进行验证,发现与芯片分析结果一致,其中miR-26a-1-3p、miR-28b、miR-29b-3p、miR-24-2-5p表达显著上调,而miR-763、miR-431-5p、miR-205-5p、let-7c-2-3p表达显著下调。结论: 差异表达的miRNAs与恶性黑色素瘤的发生、发展可能存在密切相关性,可能为恶性黑色素瘤的早期诊断及治疗提供有力的靶向依据。     

microRNAs在恶性黑色素瘤B16F0和B16F10细胞中的差异表达

目的：探讨及分析黑色素瘤细胞B16F0和B16F10中microRNAs(miRNAs)表达差异性,筛选与恶性黑色素瘤增殖、迁移和侵袭相关的miRNAs。方法：通过体内和体外实验分别验证B16F0和B16F10细胞的差异,并通过RiboArrayTMmiDETECTTMMouse Array分析小鼠黑色素瘤B16F0和B16F10细胞中miRNAs表达的差异性,筛选出与恶性黑色素瘤相关的miRNAs,并应用real-time PCR验证筛选结果的可信性。结果：B16F10细胞比B16F0具有更强的迁移和增殖能力,芯片结果显示,与黑色素瘤B16F0细胞相比,在B16F10细胞中有38个miRNAs存在表达差异,其中15个miRNAs表达上调,23个miRNAs表达下调,差异均具有统计学意义。Real-time PCR对部分miRNAs进行验证,结果与芯片分析一致,其中miR-26a-1-3p、miR-28b、miR-29b-3p、miR-24-2-5p表达显著上调,而miR-763、miR-431-5p、miR-205-5p、let-7c-2-3p表达显著下调。结论：差异表达的miRNAs与恶性黑色素瘤的发生、发展可能存在密切相关,可能为恶性黑色素瘤的早期诊断及治疗提供有力的靶向依据。     

三氧化二砷对黑色素瘤B16细胞端粒酶活性影响

目的:研究三氧化二砷(As2O3)对黑色素瘤B16细胞端粒酶活性的作用,探讨砷及其化合物治疗黑色素瘤的作用机制,为其治疗黑色素瘤提供新的理论和实验依据.方法:用TRAP-ELISA和TRAP-PAGE银染法检测黑色素瘤B16细胞(简称B16)端粒酶活性.结果:As2O3对黑色素瘤B16细胞端粒酶活性的抑制有明显的浓度和时间依赖关系.结论:As2O3对黑色素瘤B16细胞端粒酶活性表达的抑制作用随药物浓度的增加或作用时间的延长而增强.     

含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体对荷B16黑色素瘤小鼠免疫功能的影响

目的：研究含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体（AdCMVGM-CSF）直接注射荷B16黑色素瘤小鼠瘤体内对小鼠免疫功能的影响。 方法：将B16黑色素瘤细胞（5×10⁶/只）接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,将荷瘤小 鼠随机分为2组,每组12只,待瘤体直径达5 mm时分别注射AdCMVGM-CSF、AdCMVLacZ （5×10⁸ PFU/只）,检测每组小鼠的免疫功能及其对B16黑色素瘤的抑制作用。 结果：AdCMVGM-CSF实验组小鼠注射后第10天,荷瘤鼠血清中GM-CSF水平［(1 563.72±136.58)ng·L^-1］高于对照组（P<0.01）,肿瘤组织周围的CD8＋ T细胞表达明显增强。 结论：AdCMVGM-CSF可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,具有抑制肿瘤生长的作用。