靶向热休克蛋白-27基因沉默对5-氟尿嘧啶诱导SW480细胞凋亡的影响及机制

目的：通过RNA干扰抑制热休克蛋白-27（HSP27）基因的表达,探讨沉默该基因对5-氟尿嘧啶（5-FU）诱导大肠癌SW480细胞凋亡的影响及机制。方法：将细胞分为正常对照组（Normal组）、阴性siRNA转染组（NC组）、HSP27-siRNA转染组（siRNA组）、单纯5-FU组（5-FU组）、5-FU+阴性siRNA转染组（NC+5-FU组）、5-FU+HSP27-siRNA转染组（siRNA+5-FU组）,通过脂质体LipofectamineTM 2000将HSP27-siRNA导入SW480细胞,CCK-8法检测靶向HSP27的siRNA和5-FU对SW480细胞增殖的抑制作用,流式细胞技术观察转染后细胞在5-FU作用下的早期凋亡情况,Western blot方法检测凋亡相关蛋白Active-casepase-3、Active-caspase-9及细胞色素C（Cytc）的表达。结果：CCK-8法检测结果显示siRNA+5-FU组细胞增殖抑制率明显高于同期siRNA组和5-FU组,表明联合应用抑制率明显升高（P＜0.05）。流式细胞仪检测结果表明siRNA组和5-FU组均可诱导SW480细胞凋亡,两者联合应用细胞早期凋亡率明显升高,与Normal组及NC组比较,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;Western blot检测结果显示siRNA+5-FU组Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白相对表达水平均高于siRNA组和5-FU组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论：靶向HSP27-siRNA能有效抑制大肠癌SW480细胞HSP27蛋白的表达,上调Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白的表达,增强5-FU诱导SW480细胞凋亡,逆转肿瘤细胞对5-FU的耐药。     

腺病毒重组人白细胞介素24对肾癌细胞株786-O 细胞生长和凋亡的影响

目的探讨腺病毒重组人白细胞介素24(IL-24)对肾癌细胞株786-O细胞的生长和凋亡的影响。方法将培养的肾癌细胞株786-O细胞随机分为空白对照组、阴性对照组(转染腺病毒重组人IL-24对照组)及实验组(转染腺病毒重组人IL-24组)。取对数生长期肾癌细胞株786-O,构建腺病毒重组人IL-24及对照并转染至肾癌细胞株786-O实验组细胞及阴性对照组细胞。使用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测肾癌细胞株786-O生长能力;采用流式细胞术检测肾癌细胞株786-O凋亡情况;应用Western Blot检测肾癌细胞株786-O中MMP-9蛋白的表达水平。结果实验组肾癌细胞株786-O细胞增殖能力低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组肾癌细胞株786-O细胞表面磷脂酰丝氨酸表达水平高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组肾癌细胞株786-O细胞中MMP-9蛋白表达水平低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与阴性对照组肾癌细胞株786-O细胞增殖能力、细胞膜表面磷脂酰丝氨酸表达水平、MMP-9蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论转染腺病毒重组人IL-24可抑制肾癌细胞株786-O细胞的生长并诱导细胞凋亡,腺病毒重组人IL-24可能通过下调MMP-9诱导肾癌细胞株786-O细胞的凋亡。     

沉默CML66基因对肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制研究

目的探讨应用siRNA(small interfering RNA)沉默慢性粒细胞白血病肿瘤抗原66基因(CML66)对人肾癌786-O细胞生物功能及对LIS1/Dynein信号通路的影响。方法将CML66-siRNA予以应用脂质体转染方法转染入人肾癌786-O细胞中,采用蛋白质印迹法检测转染CML66-siRNA后,检测786-O细胞CML66、LIS1和Dynein蛋白的表达。采用CCK8增殖法检测肾癌细胞的增殖水平;采用Transwell法及Matrigel法检测肾癌细胞的迁移、侵袭能力。结果与对照组比较,转染CML66-siRNA后,肾癌细胞中CML66、LIS1和Dynein蛋白表达下降(P0.01)。siRNA-CML66组转染2、3、4 d后细胞增殖能力较对照组显著降低(P0.05)。siRNA-CML66转染组中肾癌细胞侵袭及迁移能力较对照组亦明显减弱(P0.01)。结论 CML66在786-O细胞中高表达,沉默CML66能够降低肾癌细胞的迁移、侵袭及增殖能力,其机制可能与LIS1/Dynein信号通路有关。     

shRNA 沉默YAP基因对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨慢病毒干扰载体沉默Yes-相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法：用细胞免疫荧光法检测肾癌786-O细胞中YAP蛋白表达情况;构建针对YAP基因的shRNA慢病毒干扰载体转染786-O细胞。RT-PCR和Western blot分别检测干扰786-O细胞前后 YAP mRNA及蛋白的表达情况;CCK-8（cell counting kit-8）法检测沉默YAP后细胞增殖的改变;流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡和周期的变化。结果：786-O细胞中YAP蛋白表达于细胞浆和细胞核;shRNA-YAP慢病毒干扰载体转染4 d后,可明显下调786-O细胞YAP mRNA及蛋白表达水平（P=0.000）,并且明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡（P=0.000）;细胞周期紊乱,G1 期细胞明显增加,S期细胞明显降低（P=0.000）。结论：YAP-shRNA慢病毒干扰载体能有效抑制YAP基因在786-O细胞中表达,进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。     

YY1基因在肾癌组织中的表达及对肾癌细胞功能的影响

目的探讨YY1基因在肾癌组织中表达及小干扰RNA(siRNA)对人肾癌786-O细胞增殖和侵袭的影响。方法以Real-Time PCR检测转录因子YY1在20对肾癌及癌旁组织中的表达;采用脂质体转染法将siRNA转染入人肾癌786-O细胞中,Real-Time PCR和Western印迹法检测YY1转染效率;MTT和平板克隆形成实验检测细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞周期;Transwell及Matrigel检测细胞侵袭能力,Real-Time PCR检测基质金属蛋白酶MMP9及钙黏附蛋白E-cadherin mRNA表达水平。结果与癌旁组织相比,20对癌组织中YY1 mRNA表达量显著增高(P<0.01)。转染人肾癌786-O后,siRNA-YY1组细胞YY1mRNA的表达抑制率达66%(P<0.01),蛋白表达水平也明显低于siRNA-NC组。与NC组相比,siRNA-YY1组细胞增殖能力显著降低(P<0.01),细胞生长被阻滞在G0/G1期,细胞侵袭能力明显减弱(P<0.01)。此外,与NC组相比,MMP9及E-cadherin mRNA水平有显著差异(P<0.01)。结论 YY1在肾癌组织中高表达,靶向沉默YY1可以在体外显著抑制肿瘤细胞的生长和侵袭能力。YY1特异性siRNA作为一种治疗肿瘤的新途径值得进一步研究。     

RNA干扰技术特异性抑制肾癌survivin表达的实验研究

目的:体外转录合成survlvin siRNA(Small interference RNA,siRNA),观察其在肾癌786-O细胞株中抑制survivin的表达情况.方法:体外转录合成3组survivin序列特异性双链RNA(Double-stranded RNA,dsRNA),转染786-O细胞株中,用RT-PCR和Western blot检测转染后survivin基因的mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞活性.结果:有2组转染特异性siRNA的786-O细胞表达survivin mRNA及蛋白均下调.活性受到抑制,另一组效果不明显.结论:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制肾癌786-O细胞中survivin的表达,抑制细胞的活性,RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术可能为肾癌的基因治疗提供一种新策略.     

结直肠癌组织中CISD2的表达及其对5-氟尿嘧啶化疗敏感性的影响

目的 探讨CDGSH铁硫结构域2 (CISD2)在结直肠癌组织中的表达、临床意义及其对5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗敏感性的影响。方法 采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、免疫组化检测结直肠癌和癌旁组织中CISD2的表达,采用χ2检验分析结直肠癌组织中CISD2的表达与临床指标之间的关系;MTT评估CISD2对结直肠癌细胞5-FU敏感性的影响;Western blotting检测HCT116和HCT8人结直肠癌细胞自噬蛋白ATG5、Beclin 1和LC3-Ⅱ/Ⅰ,凋亡蛋白caspase-3表达情况。结果 qRT-PCR和免疫组化结果显示,与癌旁组织比较,结直肠癌组织CISD2的表达水平明显降低（P <0.001）,且与患者肿瘤M分期相关（P <0.05）。MTT结果显示,与单纯5-FU处理组比较,过表达CISD2联合5-FU处理组细胞活力下降更显著（P <0.05）。Western blotting结果显示,与单纯5-FU处理组比较,过表达CISD2联合5-FU处理组细胞中ATG5、Beclin 1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平降低,而活化的caspase-3和p-...     

HIF-2琢对自噬介导的肝癌细胞顺铂耐药的影响及机制

目的探究低氧诱导因子-2琢（HIF-2琢）对自噬介导的人肝癌阿霉素耐药细胞株（HepG2/ADM）顺铂（cisplatin）耐药的影响及机制,以期为疾病的临床治疗提供新思路。方法将人肝癌细胞HepG2和HepG2/ADM分为7组并加入相应试剂：（1）HIF-2琢-siRNA＋cisplatin组;（2）HIF-2琢-siRNA组;（3）NC-siRNA组;（4）3-甲基腺嘌呤（3-MA）＋cisplatin组;（5）cisplatin组;（6）3-MA组;（7）对照组。采用Westernblot法检测微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、Beclin1、HIF-2琢蛋白表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡率,CCK-8试剂盒检测细胞增殖抑制率。结果cisplatin组HepG2、HepG2/ADM细胞中LC3-Ⅱ、Beclin1、HIF-2α蛋白表达水平及细胞凋亡率较对照组均显著升高（均P＜0.05）。3-MA组HepG2/ADM细胞中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达水平较对照组均显著下降（均P＜0.05）。3-MA＋cisplatin组HepG2/ADM细胞凋亡率较cisplatin组、3-MA组和对照组均显著升高（均P＜0.05）;cisplatin组HepG2/ADM细胞凋亡率较3-MA组和对照组均显著升高（均P＜0.05）。HIF-2琢-siRNA组HepG2/ADM细胞中HIF-2琢、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达水平较NC-siRNA组均显著下降（均P＜0.05）。HIF-2琢-siRNA＋cisplatin组HepG2/ADM细胞凋亡率较HIF-2琢-siRNA组、NC-siRNA组和cisplatin组均显著升高（均P＜0.05）;HIF-2琢-siRNA组和NC-siRNA组HepG2/ADM细胞凋亡率较cisplatin组均显著降低（均P＜0.05）。沉默HIF-2琢表达后,随cisplatin处理浓度增加,HepG2/ADM细胞增殖抑制率升高。结论HIF-2琢可能通过调节自噬影响肝癌细胞HepG2/ADM的cisplatin耐药性,因此临床上可通过降低HIF-2α表达水平,提高cisplatin对肝癌细胞HepG2/ADM的杀伤作用,为晚期肝癌治疗提供新思路。     

RNA干扰p38基因对肾癌786-O细胞生物学特性的影响及对舒尼替尼的增敏作用

目的 探讨RNA干扰p38基因对人肾癌细胞株786 0增殖、侵袭、细胞周期和细胞对舒尼替尼敏感性的影响.方法 构建针对p38的siRNA531和siRNA659两条siRNA,分别将其转染至肾癌786-O细胞株,即为siRNA531组和siRNA659组,同时设置转染无义siRNA的阴性对照组和仅加转染试剂的空白对照组.应用RT-PCR技术检测786-0细胞p38 mRNA的表达,蛋白质印迹法检测p38蛋白的表达.CCK-8法检测细胞的增殖情况和对舒尼替尼的敏感性,流式细胞术检测细胞的周期改变情况,Transwell实验检测细胞的侵袭能力.结果 RT-PCR及蛋白质印迹法检测发现siRNA转染后786-0细胞p38mRNA及蛋白的表达均降低.与空白对照组和阴性对照组相比,siRNA531组和siRNA659组786-O细胞在转染后3～5 d时的增殖率均降低(P＜0.05,P＜0.01),细胞对舒尼替尼的敏感性增加,两组对舒尼替尼的IC50值均低于阴性对照组[(3.2±0.3)、(1.4±0.1) μmol/mL vs (5.4±0.2)μmol/mL,P＜0.05].siRNA531组、siRNA659组G1期细胞数量明显多于对照组,且两组786-O细胞出现G0/G1阻滞.转染24 h后,两组的穿膜细胞数分别为56.43±6.02、34.00±8.12,与阴性对照组(76.27±5.08)相比,两组细胞的侵袭能力均下降(P＜0.01).结论 通过转染p38特异性siRNA可以成功沉默肾癌细胞株786-O的p38基因的表达,抑制肾癌细胞株786-O的增殖、侵袭能力,增加其对舒尼替尼的敏感性,为后续研究肾癌治疗及靶向耐药奠定基础.     

CXC趋化因子受体3对甲状腺细胞自噬与炎症的影响及机制

目的 探讨CXC趋化因子受体3(CXCR3)对干扰素-γ(IFN-γ)诱导的甲状腺滤泡上皮细胞（Nthy-ori3-1）自噬及炎症的影响及相关机制。方法 Nthy-ori3-1细胞分为正常组（不做任何处理）、IFN-γ组（500 U/mLIFN-γ处理24 h）、si-NC组[转染小干扰RNA(siRNA)]、si-CXCR3组（转染CXCR3 siRNA）、si-CXCR3+si-NC组（转染CXCR3 siRNA+转染siRNA）、si-CXCR3+si-Beclin1组（转染CXCR3 siRNA+转染Beclin1 siRNA）和si-CXCR3+3MA组（转染CXCR3 siRNA+3-MA自噬抑制剂）。实时荧光定量PCR检测各组CXCR3、CXC趋化因子配体9(CXCL9)的mRNA表达情况,免疫印迹法检测各组CXCR3、CXCL9、微管相关蛋白1轻链3-I(LC3I)、LC3II、囊泡转运蛋白34(Vps34)及Beclin1蛋白表达情况,免疫荧光染色观察各组细胞内自噬标志物LC3斑点数;酶联免疫吸附法试剂盒检测各组白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)...     

自噬在脂多糖诱导成牙本质细胞凋亡中的作用

目的 探讨自噬在脂多糖（LPS）诱导成牙本质细胞（mDPC-23）凋亡中的作用。方法 将5 μg/mL脂多糖作用于成牙本质细胞0、6、12、24 h后,CCK8检测细胞活力,TUNEL染色检测细胞凋亡。5 μg/mL脂多糖作用细胞24 h后,用Western blot检测自噬标志蛋白LC3、Beclin1和Atg5以及自噬相关通路AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR的表达水平。以脂多糖（5 μg/mL）和脂多糖（5 μg/mL）+3-甲基腺嘌呤（3-MA,5 mmol/L）为实验组,不加脂多糖或3-MA为空白对照组,作用细胞24 h后,Western blot检测凋亡蛋白Caspase 3和Bax的表达水平。结果 脂多糖作用mDPC-23细胞6、12 h,细胞增殖能力和凋亡无明显变化;作用24 h后,其增殖能力较对照组显著降低（P<0.05）,凋亡水平较作用0 h明显增加（P<0.05）。且脂多糖作用mDPC-23细胞24 h后,自噬标志蛋白LC3、Beclin1和Atg5表达较对照组均明显增加（P<0.05）,通路相关蛋白p-AKT和p-mTOR较对照组表达下降（P<0.05）。脂多糖组凋亡蛋白Caspase 3和Bax显著高于对照组（P<0.05）;脂多糖+3-MA组中凋亡蛋白明显低于脂多糖组（P<0.05）。结论 脂多糖可通过诱导mDPC-23自噬发生以促进细胞凋亡;而抑制自噬,可减弱脂多糖的促凋亡作用,提示在炎性牙髓组织损伤中,自噬发挥重要作用。     

PDE5基因沉默对肾透明细胞癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨PDE5基因对肾透明细胞癌细胞株786-O细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计、合成PDE5 siRNA序列,按照HiPerFect转染试剂盒操作手册转染786-O细胞.采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)和Western blot法检测转染后PDE5 基因的表达,通过WST-1法检测细胞增殖情况,caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性.结果 与空白对照组和阴性对照组相比较,PDE5 siRNA转染组的mRNA及蛋白表达水平显著降低,786-O细胞增殖能力明显受到抑制,caspase-3活性明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论 siRNA干扰PDE5基因表达可抑制肾透明细胞癌细胞株786-O细胞的增殖并促进凋亡.     

Beclin1基因在SW620细胞自噬和凋亡中作用

目的 探讨Beclinl基因在SW620细胞自噬和凋亡中作用.方法 采用RNA干扰技术抑制Beclinl表达,Beclinl被抑制后细胞的存活能力通过MTT实验评估;结直肠癌细胞SW620在血清剥夺状态下自噬活性通过LC3蛋白水平评估;分别经血清剥夺、星孢菌素及依托泊苷处理的SW620凋亡率通过流式细胞仪检测;Beclinl表达情况经Western blot评估.结果 pSUPER-Becl组细胞血清剥夺后存活能力显著降低(P＜0.05),在血清剥夺24 h后,空白对照组和pSUPER-non组抗凋亡能力比pSUPER-Becl组更强(P＜0.05),星孢菌素处理后,pSUPER-Becl组细胞凋亡最为显著(P＜0.05),用依托泊苷处理后得到相似的结果(P＜0.05);pSUPER-non组与空白对照组细胞中Beclinl的表达随血清剥夺时间的延长呈现上调趋势(P＜0.05),这与LC3的表达变化相一致;而pSUPER-Becl组LC3的表达显著减少(P＜0.05).结论 Beclin1是结直肠癌细胞中自噬和凋亡的关键调节因素,并且维持凋亡和自噬的平衡;Beclinl通过调节细胞自噬活性,在结直肠癌发展与演进中作为一种保护机制,使肿瘤细胞免受到低营养和化疗所致的损伤而持续生存.     

miR-424通过调控ATG14的表达抑制肝癌细胞的自噬和增殖

目的 研究miR-424通过调控ATG14表达影响自噬和肝癌细胞增殖。方法 收集肝癌患者因手术切除的肝癌组织及其癌旁组织,采用 qRT-PCR 法检测肝癌组织中 miR-424-5p,ATG14 的表达。培养人肝癌细胞系 HepG2、SMMC-7721、Huh-7、MHCC97H、HCCLM3和人正常肝细胞LO2,qRT-PCR法检测上述各细胞系的miR-424-5p表达,选取表达量较高的Huh-7和表达量较低的HCCLM3肝癌细胞为研究对象,Huh-7细胞实验分组（n=3）：干扰miR-424-5p表达阴性对照组（in-NC组）,干扰miR-424-5p表达组（in-miR-424-5p组）;HCCLM3细胞实验分组（n=3）：过表达miR-424-5p组（mi-miR-424-5p组）,另设过表达miR-424-5p阴性对照组（mi-NC组）;过表达miR-424-5p阴性对照+过表达ATG14阴性对照组（mi-NC+NC组）;过表达miR-424-5p阴性对照+过表达ATG14组（mi-NC+ ATG14组）;过表达miR-424-5p +过表达ATG14阴性对照组（mi-miR-424-5p+NC组）;过表达miR-424-5p +过表达ATG14组（mi-miR-424-5p +ATG14组）。qRT-PCR法及Western blot法验证各组miR-424-5p和ATG14的转染情况。采用MTT法检测各组细胞的细胞增殖,流式细胞术检测各组细胞的细胞凋亡水平,Western blot检测各组细胞的ATG14和自噬相关蛋白LC3、Beclin1和P62的表达水平,双荧光素酶报告基因实验检测miR-424-5p和ATG14之间的相互作用。结果 在肝癌组织和细胞中ATG14高表达,miR-424-5p低表达。与相应对照组相比,过表达miR-424-5p抑制肝癌细胞增殖和促进凋亡（P<0.05）;干扰miR-424-5p表达及过表达ATG14促进肝癌细胞增殖和抑制凋亡（P<0.05）;miR-424可能通过靶向ATG14发挥抑癌的作用。干扰miR-424-5p表达及过表达ATG14均能提高肝癌细胞自噬体标志蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1的表达水平（P<0.05）,降低自噬受体蛋白P62的表达水平（P<0.05）;过表达miR-424-5p则降低肝癌细胞自噬体标志蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1的表达水平（P<0.05）,提高自噬受体蛋白P62的表达水平（P<0.05）。结论 miR-424调控ATG14表达影响自噬,从而抑制肝癌细胞增殖。     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,检测clusterin(CLU)基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖?迁移和凋亡的影响?【方法】 构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,感染人肾癌786-O细胞株?实验分5组:CLU-RNAi-LV1(KD1)?CLU-RNAi-LV2(KD2)?CLU-RNAi-LV3(KD3)为加入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组,未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组(NC组),肾癌786-O细胞为空白对照组(CON组)?应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别干扰前后CLU mRNA及蛋白表达的变化?用细胞划痕实验?MST-1?流式细胞仪等方法检测CLU沉默后肾癌786-O细胞在增殖?迁移?凋亡等生物学行为的改变?【结果】 成功构建CLU shRNA慢病毒载体clu-RNAi-LV并获得相应慢病毒?Real time-PCR显示不同感染复数CLU-RNAi-LV处理的KD1?KD2?KD3组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调69.4%~96.5%和0?Western blot结果显示KD1?KD2?KD3组CLU蛋白表达水平与CON组相比分别下降35.24%?46.26%和58.91%,KD3能显著抑制786-O细胞中CLU基因的表达?划痕实验显示24 h时 KD3(si-CLU)组细胞迁移相对距离(408.43 ± 25.92)小于NC组(101.35 ± 6.05)和CON组(68.13 ± 6.64,P < 0.05)?WST-1法检测转染后72 h KD3(si-CLU)组细胞生长速度较NC组及CON组明显下降(P < 0.05),各组间差异(P < 0.05),均有统计学意义?流式细胞仪检测KD3(si-CLU)组与NC组?CON组细胞凋亡率分别为(6.23 ± 2.51)%?(1.05 ± 0.30)%和(1.17 ± 0.29)%,KD3(si-CLU)组与NC组?CON组相比凋亡率增加(P < 0.05),差异有统计学意义?肾癌786-O细胞的增殖?迁移受到抑制,而凋亡率增加?【结论】 筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株?CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性CLU基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖?迁移并促进细胞凋亡?     

SPOP上调c-Jun蛋白表达并促进肾癌细胞的增殖和侵袭

目的 探讨SPOP对肾癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等的影响及潜在的作用机制。方法 体外培养肾癌细胞株786-O、 A704、Caki-2,对照组（EV）和过表达组（SPOP）质粒采用脂质体法转染至上述肾癌细胞株;分别利用克隆形成实验及MTT法检测SPOP基因对肾癌细胞株增殖的影响;采用TUNEL法检测SPOP基因对肾癌细胞株凋亡的影响;利用创伤愈合实验和Transwell实验检测SPOP基因对肾癌细胞株迁移和侵袭能力的作用;运用Real-time PCR和Western blotting技术检测转染后肾癌细胞株SPOP和c-Jun的 mRNA水平以及相关蛋白的表达情况。结果 在786-O、A704、Caki-2细胞上调 SPOP的表达能促进肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭（P<0.05）;与对照组相比,SPOP组的肾癌细胞株786-O、Caki-2的凋亡率较对照组相对减少（P< 0.05）;Real-time PCR结果显示,c-Jun mRNA的表达水平未发生改变,但Western blotting结果显示,SPOP组肾癌细胞株786-O、Caki-2的SPOP蛋白表达明显高于对照组（P<0.05）,c-Jun蛋白的表达也明显高于对照组（P<0.05）。结论 SPOP能促进肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制肾癌细胞的凋亡,潜在的机制可能为促进c-Jun的表达。     

BTG1在HK-2和786-O细胞株中的表达及其对细胞周期和细胞凋亡的影响

目的：探讨B细胞易位基因1（ BTG1）在人肾小管上皮细胞株（ HK-2）和肾透明细胞腺癌细胞株（786-O）中的表达及BTG1基因对HK-2和786-O细胞周期、细胞凋亡的影响。方法：采用Western blotting方法检测BTG1蛋白在HK-2、786-O细胞株中的表达,构建BTG1表达质粒转染786-O细胞,合成BTG1干扰RNA转染HK-2细胞,通过流式细胞仪（ FACS）观察BTG1对HK-2、786-O细胞周期和细胞凋亡的影响。结果：Western blotting检测显示,BTG1蛋白在HK-2中的表达高于786-O。786-O中高表达BTG1蛋白能够促进其凋亡,增加其G0/G1期比率;HK-2中低表达BTG1蛋白能够抑制其凋亡,减少其G0/G1期比率。结论：BTG1可能通过对细胞凋亡及细胞周期的调控抑制肾细胞癌的生长。     

褪黑素通过激活自噬抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的生长和转移

目的 探讨褪黑素对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长和转移的作用及其机制。方法 将MDA-MB-231细胞设置对照组以及1、3、5 mmol/L褪黑素处理组,Western blot检测自噬对细胞生长、转移的影响时,添加3-甲基腺嘌呤（3-MA）组、3-MA联合褪黑素组。使用不同浓度褪黑素处理MDA-MB-231乳腺癌细胞24、48 h,并加入0.1%无水乙醇的细胞作为对照,CCK-8法检测细胞增殖活性确定最佳处理浓度和时间,筛选出3 mmol/L褪黑素用于后续实验。集落形成实验及划痕实验检测不同浓度褪黑素对乳腺癌细胞集落形成能力和迁移能力的影响;流式细胞术、免疫荧光检测3 mmol/L褪黑素对MDA-MB-231细胞凋亡率和自噬蛋白阳性着色情况;Western blot检测自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin1,凋亡相关蛋白Bcl2、Bax,上皮-间质转化（EMT）相关蛋白E-cadherin、Snai1的水平。结果 CCK-8结果显示,与对照组相比,褪黑素呈浓度及时间依赖性抑制乳腺癌细胞的增殖（P<0.05）;集落形成实验显示,3个浓度褪黑素处理组的集落数低于对照组;褪黑素作用24 h后明显抑制乳腺癌细胞划痕愈合速度（P<0.01）,并诱导细胞凋亡率增加（P<0.01）;且与对照组相比,褪黑素组的促凋亡蛋白Bax表达增加（P<0.05）,抗凋亡蛋白Bcl2表达下调（P<0.05）,Bcl2/Bax的比值逐渐减低（P<0.01）;转录因子Snail减少,上皮细胞标志蛋白E-cadherin增加;单独使用褪黑素能够诱导细胞内自噬标记蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1表达增加,P62表达减少（P<0.05）以及Beclin1蛋白阳性着色增强,P62蛋白阳性着色减弱;3-MA+褪黑素组中自噬相关蛋白Beclin1（P<0.001）、LC3-ΙΙ/LC3-（Ι P<0.05）以及凋亡蛋白Bax（P<0.01）、上皮细胞标志蛋白E-cadherin（P<0.001）明显低于褪黑素组,抗凋亡蛋白Bcl2（P<0.05）、转录因子Snail以及Bcl2/Bax的比值（P<0.01）高于褪黑素组。 结论 褪黑素可通过诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞发生自噬,抑制乳腺癌细胞增殖、转移并促进其凋亡,而减少自噬,可减弱褪黑素对乳腺癌细胞生长和转移的抑制作用。     

NAMPT基因对肾癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:探讨烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT) 在肾癌中的表达情况及对肾癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:通过TCGA在线数据库ualcan分析NAMPT在肾癌组织和正常肾组织中的表达,通过Kaplan-Meier plotter数据库分析NAMPT对肾癌预后的影响。qPCR检测NAMPT基因在肾癌细胞769P、A704、786-O及正常化肾小管上皮细胞HK2中的表达。分别设计NAMPT特异性shRNA（shNAMPT组）和对照序列（scramble组）转染肾癌细胞786-O,用NAMPT抑制剂FK866及对照试剂DMSO处理肾癌细胞786-O,分别采用CCK-8法、平板克隆实验及流式细胞术检测NAMPT对肾癌细胞786-O增殖、克隆形成及凋亡的影响,NAD+/NADH检测试剂盒检测细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的含量,Western印迹检测NAMPT的表达及干扰NAMPT对磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路的影响。结果:生物信息学分析显示NAMPT在肾癌中的表达高于正常肾组织（P＜0.05）,NAMPT高表达组总生存率较低表达组明显降低（P<0.01）;肾癌细胞769P、A704、786-ONAMPT的表达均高于肾小管上皮细胞HK2（t=6.680,P=0.0026,t=14.12,P=0.001,t=13.43,P=0.002）;细胞学实验结果显示,与DMSO组相比,FK866组肾癌细胞786-O的增殖能力减弱（t=2.625,P<0.05）,克隆形成能力明显受抑制（t=5.687,P<0.01）,凋亡细胞比例增高（t=6.325,P＜0.01）,NAD+生成明显下降（t=17.62,P<0.001）。与scramble组相比,shNAMPT组肾癌细胞786-O的增殖能力减弱（t=3.959,P<0.05）,克隆形成能力明显受抑制（t=8.684,P<0.05）,凋亡细胞比例增高（t=14.05,P＜0.01）,NAD+生成明显下降（t=10.93,P<0.001）,Akt通路关键蛋白p-PI3K及p-Akt的表达明显下调（t=7.721,P＜0.01,t=14.78,P＜0.001）。结论:NAMPT在肾癌中高表达,且与患者预后差相关,干扰NAMPT的表达,可以通过减少NAD+的生成,抑制PI3K/Akt通路的激活,从而降低肾癌细胞的增殖,促进其凋亡。     

自噬在电离辐射诱导的小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用

目的 探讨自噬在电离辐射诱导小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用.方法 将小鼠精母细胞GC-2分为空白对照组和不同剂量(2、4和8 Gy)60Co辐射处理组.采用原位末端转移酶标记法(TUNEL法)和流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过蛋白质印迹实验观察自噬相关蛋白LC3(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)和Beclin1表达水平的改变,使用荧光显微镜观察C,C-2细胞内自噬小体的变化.用5mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,观察自噬抑制剂联合电离辐射对细胞凋亡率的影响以及自噬相关蛋白表达水平的改变.结果 与空白对照组相比,GC-2细胞经60Co辐射处理后细胞凋亡率升高(P＜0.05),荧光显微镜下可见细胞自噬体明显增多,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平增加(P＜0.05).预先用5mmol/L 3-MA处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平与未经3-MA处理组相比降低(P＜0.05),细胞凋亡率升高(P＜0.05).结论 电离辐射可以诱导精母细胞发生自噬,抑制细胞自噬后可增强电离辐射对精母细胞的杀伤作用.