组蛋白去乙酰化酶SIRT1调控氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞凋亡的表达

目的 观察组蛋白H3赖氨酸残基9乙酰化(H3K9Ac)在氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的巨噬细胞凋亡模型中的表达,探讨组蛋白去乙酰化酶——炎症因子沉默信息调节蛋白1(SIRT1)对组蛋白乙酰化的影响,及其通过基因表观遗传学作用,经氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)通路调控巨噬细胞凋亡的机制。方法 培养BALB/c小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7),并加入oxLDL构建巨噬细胞模型。将细胞分为对照组(加入双蒸水)和实验组(加入50μg/mL oxLDL),分别检测两组细胞凋亡及白细胞介素(IL-6)、SIRT1、H3K9Ac和PPARγ的蛋白表达水平。另外,将实验组细胞分别给予SIRT1兴奋剂(白藜芦醇,终浓度50 nmoL/L)和SIRT1抑制剂(尼克酰胺,终浓度50 nmoL/L),观察SIRT1过表达或抑制对oxLDL诱导巨噬细胞模型中细胞凋亡及SIRT1、H3K9Ac、PPARγ和磷酸化过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Ser112位点)[pPPARγ(S112)]的蛋白表达水平的影响。采用Hoechst荧光凋亡染色法检测各组细胞凋亡;采用Western blotting...     

PHI对前列腺癌PC3细胞组蛋白甲基化及乙酰化的调控

目的 探讨异硫氰酸苯己酯(PHI)诱导前列腺癌PC3细胞凋亡的分子机制.方法 采用MTT方法观察PHI对PC3细胞的生长抑制情况;TUNEL方法检测PHI对PC3细胞凋亡的影响;用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、Mcl-1、Cyt-C、XIAP及组蛋白乙酰化H3、H4,组蛋白甲基化H3K9、H3K4水平的变化.结果 ①PHI能抑制PC3细胞增殖,IC50为20 μmol/L;②PHI通过下调PC3细胞Bcl-2,Caspase-9、Caspase-3、Mcl-1、Cyt-C、XIAP表达,诱导PC3细胞凋亡;③PHI使PC3细胞组蛋白乙酰化H3、H4表达增加,组蛋白甲基化H3K4水平增高,H3K9水平降低.结论 PHI可使组蛋白H3、H4高乙酰化,并调控组蛋白H3K4、H3K9甲基化水平,从而抑制PC3细胞的增殖,诱导其凋亡.PHI是一种潜在抗前列腺癌的新药.     

异硫氰苯已酯调控组蛋白乙酰化并诱导Molt-4细胞凋亡的研究

目的 研究异硫氰酸苯己酯(PHI)对淋巴母细胞性白血病Molt-4细胞组蛋白乙酰化调控及诱导细胞凋亡的影响.方法 采用MTT法观察PHI对Molt-4细胞增殖的影响;流式细胞术观察细胞凋亡;Western Blot观察PHI作用细胞后组蛋白H3(H3K9,H3K14)、H4(H4K5,H4K8,H4K12,H4K16)乙酰化状态变化及凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、凋亡底物PARP表达的变化.结果 PHI可抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡;PHI可使线粒体膜蛋白Bcl-2,Caspase-9及下游Caspase-3,凋亡底物PARP表达下降,呈时效及量效关系;而Caspase-8未见明显变化.PHI可增加组蛋白H3,H4乙酰化表达.结论 PHI是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,调控组蛋白乙酰化水平,影响其表观遗传学,可抑制肿瘤细胞增殖,通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡,是一种潜在的抗肿瘤新药.     

异硫氰酸苯己酯调控组蛋白乙酰化并诱导Molt-4细胞凋亡的研究

目的研究异硫氰酸苯己酯（PHI）对淋巴母细胞性白血病Molt-4细胞组蛋白乙酰化调控及诱导细胞凋亡的影响。方法采用MTT法观察PHI对Molt-4细胞增殖的影响;流式细胞术观察细胞凋亡;WesternBlot观察PHI作用细胞后组蛋白H3（H3K9,H3K14）、H4（H4K5,H4K8,H4K12,H4K16）乙酰化状态变化及凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、凋亡底物PARP表达的变化。结果PHI可抑制细胞增殖．诱导细胞凋亡;PHI可使线粒体膜蛋白Bcl-2,Caspase-9及下游Caspase-3,凋亡底物PARP表达下降。呈时效及量效关系;而Caspase-8未见明显变化。PHI可增加组蛋白H3,H4乙酰化表达。结论PHI是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,调控组蛋白乙酰化水平,影响其表观遗传学．可抑制肿瘤细胞增殖,通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。是一种潜在的抗肿瘤新药。     

人类卵母细胞及体外受精发育阻滞胚胎中的组蛋白乙酰化水平的检测

目的 探讨人类不同成熟阶段的卵母细胞及体外受精发育阻滞胚胎中的组蛋白乙酰化水平的变化规律.方法 收集接受卵胞浆内单精子注射技术(ICsI)治疗的患者废弃的卵母细胞生发泡(GV)期、第一次减数分裂中期(MⅠ期)和经体外成熟培养发育至第二次减数分裂中期(MⅡ期)的卵母细胞,采用间接免疫荧光染色方法对人类不同成熟阶段的卵母细胞及体外受精阻滞胚胎中的组蛋白的(H4K12和H3K9)乙酰化水平进行检测.结果 人类GV期卵母细胞中组蛋白H4K12和H3K9均强表达.74.1%的MⅠ期卵母细胞中H4K12和H3K9的乙酰化水平显著降低.79.2%的MⅡ期卵母细胞中组蛋白H4K12乙酰化呈微弱表达或不表达,而来源于高龄妇女的MⅡ期卵母细胞仍维持较高的H4K12乙酰化水平.在MⅡ期卵母细胞中几乎检测不到H3K9的乙酰化表达.83.3%的发育阻滞胚胎中组蛋白H4K12和H3K9的乙酰化水平较高.结论 人类卵母细胞的成熟经历了一个组蛋白乙酰化到去乙酰化的动态修饰过程,体外受精后又重新建立新的组蛋白乙酰化修饰.     

异硫氰酸苯己酯诱导伊马替尼耐药K562/G01细胞株凋亡的组蛋白调控机制研究

目的体外观察异硫氰酸苯己酯(PHI)对人慢性粒细胞白血病伊马替尼耐药的K562/G01细胞株的凋亡的影响,初步探讨其可能的组蛋白调控机制。方法流式细胞仪检测PHI作用前后K562/G01细胞凋亡的变化;Western Blot检测PHI处理K562/G01细胞株后凋亡相关蛋白Bcl-2,procaspase-3,组蛋白H3、H4乙酰化状态,组蛋白H3K4、H3K9甲基化状态的变化。结果 PHI可以诱导K562/G01细胞凋亡,且呈浓度依赖性。PHI终浓度为0,10,20,40μmol/L时,K562/G01细胞凋亡率分别为(3.76±1.46)%,(8.89±2.31)%,(18.10±3.56)%,(35.35±3.70)%,差别有统计学意义(n=3,P<0.05);凋亡相关蛋白Bcl-2及procaspase-3的表达下降;组蛋白H3、H4乙酰化及组蛋白H3K4甲基化水平均上升,而H3K9甲基化水平下降,随着作用时间的延长变化趋势更加明显。结论 PHI能诱导K562/G01细胞凋亡,可能与PHI对组蛋白的乙酰化及甲基化调控有关。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂阻断ERK/MAPK信号通路抗急性T淋巴细胞白血病的机制研究

目的 探讨选择性组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺对急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞株A3和Molt-4增殖和凋亡的影响及其可能的分子机制。方法 通过Oncomine数据库挖掘分析组蛋白去乙酰化酶(HDAC)1-11在不同类型白血病中的mRNA表达情况。采用CCK-8法检测不同浓度的西达本胺对A3和Molt-4细胞增殖的影响并计算IC₅₀值;流式细胞术AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;Western blot法检测组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)乙酰化、凋亡信号通路和ERK/MAPK信号通路蛋白表达水平。结果 HDAC1、2、3、9、10在T-ALL中的表达水平高于正常对照组(P<0.05)。经不同浓度西达本胺处理后,A3和Molt-4细胞存活率显著低于对照组(P<0.05),且呈时间-浓度依赖性。随西达本胺药物浓度的增加,A3和Molt-4细胞的凋亡率与对照组相比均显著增加(P<0.05);与对照组比较,组蛋白H3K9乙酰化、BAX、cleaved caspase-9、cleaved PARP蛋白表达均显著增加(P<0.05);Bcl-2、Mcl-1以及MAPK通路关键蛋白p-ERK1/2表达则显著减少(P<0.05)。结论 T-ALL中高表达Ⅰ类HDAC1、2、3和Ⅱ类HDAC9、10。选择性组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺可有效抑制T-ALL细胞株A3和Molt-4的增殖,并通过线粒体凋亡途径诱导凋亡,其作用机制可能与抑制ERK/MAPK信号通路有关。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A对细胞周期素D1调控的影响?

目的：观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A( TSA)对细胞周期素D1表达的影响,探讨TSA抑制细胞周期素D1表达的分子机制。方法以不同浓度(20、100、400 nmol/L)的TSA处理A549细胞24 h,以RT-PCR、Western blot等方法检测细胞周期素D1 mRNA和蛋白的表达水平;以染色质免疫沉淀技术分析400 nmol/L的TSA处理A549细胞24 h后,细胞周期素 D1基因核心启动子组蛋白3第9位赖氨酸乙酰化( Ac -H3k9)水平。结果随着TSA处理浓度的增加细胞周期素D1 mRNA和蛋白表达水平下降。在400 nmol/L TSA作用下,细胞周期素D1启动子区组蛋白乙酰化程度下降。结论 TSA 造成细胞周期素D1表达下调可能与细胞周期素D1启动子乙酰化程度下降有关。     

miR-146a经TLR4/MyD88途径加速巨噬细胞迁移所致动脉硬化的作用机制

目的 探讨微小RNA-146a(miR-146a)经Toll样受体4(TLR4)/髓系分化因子88蛋白(MyD88)途径调控巨噬细胞迁移所致动脉硬化的具体机制。 方法 RAW264.7巨噬细胞分为空白组、ox-LDL组、miR-146a mimic组、miR-146a inhibitor组、shRNA-MyD88组、shRNA-NC组、shRNA-MyD88+miR-146a mimic组、shRNA-MyD88+miR-146a inhibitor组,除空白组,其他各组均用50 mg/L ox-LDL进行干预;采用Western blotting法检测TLR4、MyD88、核因子κB(NF-κB)、白细胞介素-6(IL-6)蛋白表达水平。采用qPCR法检测miR-146a、TLR4、MyD88、NF-κB、IL-6基因表达水平。采用Transwell法检测巨噬细胞迁移能力。 结果 (1)ox-LDL组细胞内TLR4、IL-6蛋白含量及巨噬细胞迁移率均高于空白组(P均<0.01),miR-146a低于空白组(P<0.01);(2)miR-146a mimic组细胞TLR4 mRNA相对表达量及蛋白含量、巨噬细胞迁移率低于ox-LDL组,miR-146a mRNA相对表达量高于ox-LDL组(P均<0.01);miR-146a inhibitor组细胞TLR4 mRNA相对表达量及蛋白含量、巨噬细胞迁移率高于ox-LDL组,miR-146a mRNA相对表达量低于ox-LDL组(P均<0.01);(3)shRNA-MyD88组MyD88、NF-κB、IL-6蛋白含量、巨噬细胞迁移率低于ox-LDL组(P<0.01),miR-146a、TLR4表达无明显差异(P>0.05);shRNA-MyD88+miR-146a mimic组miR-146a表达高于shRNA-MyD88组,TLR4蛋白含量低于shRNA-MyD88组(P<0.01),MyD88、NF-κB、IL-6蛋白含量表达、巨噬细胞迁移率与shRNA-MyD88组无明显差异(P>0.05);shRNA-MyD88+miR-146a inhibitor组miR-146a表达低于shRNA-MyD88组,TLR4蛋白含量表达高于shRNA-MyD88组(P<0.01),MyD88、NF-κB、IL-6蛋白含量表达、巨噬细胞迁移率与shRNA-MyD88组无明显差异(P>0.05)。 结论 miR-146a是动脉粥样硬化的保护性因子,通过拮抗TLR4/MyD88途径调控炎症因子分泌进而抑制巨噬细胞迁移所致动脉粥样硬化进程,为动脉粥样硬化的防治提供新的治疗靶点。     

组蛋白修饰对COPD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞趋化因子表达的影响

目的探讨COPD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)炎症因子表达是否与组蛋白修饰有关。方法熏烟法建立大鼠COPD模型。取大鼠肺组织进行病理观察,提取AECⅡ进行碱性磷酸酶染色鉴定和电镜鉴定;实时定量PCR检测AECⅡ三种趋化因子:单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-8及巨噬细胞炎性蛋白2α(MIP-2α)的mRNA表达;Westernblot检测组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)蛋白表达;染色质免疫共沉淀(ChIP)检测趋化因子启动子区组蛋白H3、H4乙酰化和H4K9甲基化修饰情况。结果 COPD组IL-8、MCP-1、MIP-2αmRNA表达较正常对照组分别增加4.48倍、3.14倍、2.83倍;COPD组AECⅡ细胞HDAC2蛋白表达较正常对照组降低(0.25±0.15比0.66±0.15,P0.05),且HDAC2的下降程度与IL-8、MCP-1、MIP-2αmRNA表达增高程度呈负相关(r值分别为-0.960、-0.914、-0.928,P均0.05)。COPD组趋化因子基因启动子区H3、H4乙酰化水平较正常对照组均升高,H4K9甲基化水平则降低(P均0.05)。结论 COPD模型大鼠AECⅡ的IL-8、MCP-1、MIP-2α三种趋化因子基因表达增加,HDAC2介导的组蛋白修饰在COPD炎症反应中发挥重要作用。     

Toll样受体4抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ加重血脂蓄积的分子机制

目的 选取高脂饮食模型大鼠和氧化低密度脂蛋白(oxLDL)暴露下巨噬细胞模型,验证在血脂蓄积过程中Toll样受体4(TLR4)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的具体干预机制。 方法 健康雄性Wistar大鼠20只,随机分为对照组和高脂组,每组10只。测定各组大鼠总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平,采用苏木精-伊红染色检测颈动脉血管内膜中膜厚度比,采用Western blotting法检测TLR4、PPARγ蛋白表达水平。体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,以oxLDL(50 mg/L)刺激巨噬细胞制备模型,且应用siRNA-TLR4沉默巨噬细胞内的TLR4因子制备TLR4沉默模型,将细胞分为空白组(A组)、oxLDL组(B组)、oxLDL+siRNA组(C组)、oxLDL+siRNA-TLR4组(D组)、oxLDL+siRNA-TLR4+PPARγ激动剂组(E组)、oxLDL+siRNA-TLR4+PPARγ抑制剂组(F组)。采用油红O染色法观察巨噬细胞内血脂蓄积情况,定量检测巨噬细胞内胆固醇含量,采用Western blotting法检测 TLR4、PPARγ蛋白表达水平。 结果 在动物模型实验中,与对照组相比,高脂组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平、颈动脉内膜中膜厚度比、TLR4蛋白相对表达含量明显增高(P<0.01),血清高密度脂蛋白水平、PPARγ蛋白相对表达含量明显降低(P<0.01),且TLR4与PPARγ呈负相关性(r=-0.928 1,P<0.001)。在oxLDL暴露巨噬细胞实验中,与A组比较,B、C组巨噬细胞内胆固醇含量、油红O颗粒、光密度值及TLR4蛋白相对表达含量明显增多(P<0.01),PPARγ蛋白相对表达含量明显减少(P<0.05),且B组TLR4与PPARγ呈负相关性(r=-0.986 7,P<0.001)。与B组相比,C组巨噬细胞内胆固醇含量、油红O颗粒、光密度值及TLR4、PPARγ蛋白相对表达含量未见明显改变(P>0.05)。与B组相比,D组巨噬细胞内胆固醇含量、油红O颗粒及光密度值及TLR4蛋白相对表达含量明显减少(P<0.01),PPARγ蛋白相对表达含量明显增多(P<0.05)。与D组相比,E组巨噬细胞内胆固醇含量、油红O颗粒及光密度值明显减少(P<0.01),PPARγ蛋白相对表达含量明显增多(P<0.05),TLR4蛋白相对表达含量未见明显改变(P>0.05)。与D组相比,F组巨噬细胞内胆固醇含量、油红O颗粒及光密度值明显增多(P<0.01),PPARγ蛋白相对表达含量明显减少(P<0.05),TLR4蛋白相对表达含量未见明显改变(P>0.05)。 结论 细胞内的血脂蓄积是动脉粥样硬化形成的机制之一,PPARγ可以抑制巨噬细胞血脂蓄积进而参与动脉粥样硬化调节,是巨噬细胞血脂蓄积过程的保护性因子。而TLR4作为PPARγ上游调控位点,通过抑制PPARγ的表达,加重血脂蓄积的过程,进而干预动脉粥样硬化进程。     

陈皮、半夏对动脉粥样硬化小鼠PI3K-Akt通路、SOD、MDA、SA-β-gal水平的影响

目的 探讨陈皮、半夏治疗动脉粥样硬化的机制。方法 将40只Klotho 敲除小鼠采用数字表法随机分为模型组、治疗组（高、中、低剂量组,每组10只）。对照组C57BL/6小鼠10只。通过HE染色观察小鼠颈动脉病理改变;通过血浆分光光度法检测丙二醛（malonaldehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、β-半乳糖苷酶（senescence-associated beta-galactosidase,SA-β-gal）;通过免疫组化法观察PI3K与p-Akt表达。结果 与模型组比较,陈皮、半夏组动脉内膜呈轻度增生改变;SOD浓度与对照组比较上升,差异有统计学意义（P<0.01）,MDA和SA-β-gal则显著降低（P<0.01）;大剂量和中剂量治疗组中PI3K下降水平与模型组比较,差异有统计学意义（P<0.01）;陈皮、半夏各治疗组p-Akt表达均显著低于模型组,差异有统计学意义（P<0.01）。结论 陈皮、半夏可能通过PI3K和p-Akt通路而调控SOD、MDA及SA-β-gal水平,达到延缓衰老、治疗动脉粥样硬化的作用。     

糖化白蛋白调控肾损伤相关分子与Toll样受体信号通路及齐墩果酸对其干预作用的研究

目的 探讨人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞系）在糖化白蛋白（glycated albumin,GA）与齐墩果酸（oleanolic acid,OA）作用下,肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1,KIM-1）、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）及Toll样受体信号通路相关分子的表达情况。方法 采用GA及OA处理HK-2细胞24 h,real-time PCR检测KIM-1、NGAL以及p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）、白细胞介素-1受体相关激酶4（interleukin-1 receptor-associated kinase 4,IRAK4）、Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）1、TLR2、TLR7和TLR9的mRNA表达,ELISA法检测细胞上清液KIM-1与NGAL水平,Western blotting法检测细胞内p38 MAPK、IRAK4、TLR1、TLR2、TLR7和TLR9蛋白表达。结果 与对照组比较,GA能显著上调KIM-1、NGAL mRNA与蛋白的含量（P<0.05）,并促进p38 MAPK、IRAK4、TLR1、TLR2 mRNA及蛋白的表达（P<0.05）;加入OA能显著抑制上述作用（P<0.05）。结论 GA能够上调KIM-1和NGAL的表达与释放,激活Toll样受体信号通路,对人近端肾小管上皮细胞造成损伤;而加入OA能够有效干预GA调控的损伤。     

发酵红参总皂苷对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞间充质转化的抑制作用及其机制

目的：探讨发酵红参总皂苷(FRGTS)对高糖诱导下肾小管上皮细胞发生上皮细胞-间充质转化(EMT)的抑制作用,并阐明其作用机制。方法：将大鼠肾小管上皮NRK-52E细胞分为正常对照组(5.5 mmol·L^-1D-葡萄糖)、高糖组(30.0 mmol·L^-1D-葡萄糖)、沉默信息调节因子1(SIRT1)抑制剂EX527组(30.0 mmol·L^-1D-葡萄糖+10.0μmol·L^-1.EX527)、 FRGTS组(30.0 mmol·L^-1D-葡萄糖+25 mg·L^-1FRGTS)和EX527+FRGTS组(30.0 mmol·L^-1D-葡萄糖+10μmol·L^-1EX527+25 mg·L^-1FRGTS)。采用免疫荧光法检测各组细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组细胞中E-cadherin、...     

SHH信号通路对子痫前期患者滋养细胞凋亡和侵袭的影响及其机制

目的：探讨激活SHH信号通路对子痫前期（PE）患者滋养细胞凋亡和侵袭的影响,并阐明其作用机制。方法：将HTR8/SVneo细胞分为正常对照组、缺氧/复氧（H/R）处理组和purmorphamine+H/R处理组。Western blotting法检测PE胎盘组织和正常妊娠晚期胎盘组织及各组HTR8/SVneo细胞中SHH信号通路相关蛋白SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达水平,流式细胞术（FCM）检测各组HTR8/SVneo细胞的凋亡率,Transwell小室法检测各组HTR8/SVneo细胞的穿膜细胞数,Western blotting法检测各组HTR8/SVneo细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白表达水平。结果：PE胎盘组织HTR8/SVneo细胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达水平均明显低于正常妊娠晚期胎盘组织（P<0.05）;H/R处理组HTR8/SVneo细胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1、Gli3、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平及穿膜细胞数均明显低于正常对照组,细胞凋亡率明显高于正常对照组（P<0.05）;purmorphamine+H/R处理组HTR8/SVneo细胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1、Gli3、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平及穿膜细胞数均明显高于H/R处理组（P<0.05）,细胞凋亡率明显低于H/R处理组（P<0.05）。结论：激活SHH信号通路可减少PE患者胎盘组织中HTR8/SVneo细胞凋亡,并通过上调MMP-2和MMP-9表达提高细胞的侵袭能力。     

过表达TLR4基因对胃癌细胞自噬的抑制作用及其机制

目的 采用慢病毒过表达胃癌细胞中Toll样受体4（TLR4）基因,探讨其对胃癌细胞自噬的作用,并阐明其作用机制。 方法 处于对数生长期的胃癌BGC-823细胞和SGC-7901细胞分为未感染组、阴性对照病毒组和基因过表达组,分别给予无慢病毒感染、空载体慢病毒和过表达TLR4慢病毒稳定感染。采用Western blotting法检测正常胃黏膜上皮GES-1细胞及胃癌BGC-823细胞、SGC-7901细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法分别检测各组细胞中TLR4、Beclin1和微管相关蛋白轻链3（LC3）mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中磷脂酰肌醇-3激酶／蛋白激酶B（PI3K／Akt）、磷酸化PI3K／磷酸化Akt（p-PI3K／p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）信号通路相关蛋白及细胞自噬相关蛋白（LC3、Beclin1和p62）蛋白表达水平。 结果 BGC-823细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平高于胃黏膜上皮GES-1细胞。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞增殖活性明显升高（P<0.05或P<0.01）。与阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）,BGC-823细胞中Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05）,SGC-7901细胞中LC3和Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中LC3和Beclin1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,p62、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。 结论 过表达TLR4基因可以通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路明显抑制胃癌细胞的自噬活性。     

敲减TLR2基因对结直肠癌细胞增殖的抑制作用及其机制

目的：应用慢病毒RNA干扰技术敲减结直肠癌细胞中Toll样受体2（TLR2）基因,探讨其对结直肠癌细胞增殖的作用,并阐明其作用机制。方法：将处于对数生长期的结直肠癌HCT116细胞和HT29细胞分为未感染对照组、阴性对照组及基因敲减组（TLR2-RNAi组）,分别给予无慢病毒感染、慢病毒RNAi及慢病毒TLR2-RNAi稳定转染。感染后采用蛋白印迹法检测各组细胞中TLR2蛋白表达水平,采用CCK-8法和流式细胞术检测各组细胞增殖活性及不同细胞周期细胞百分率,蛋白印迹法检测各组细胞中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（PI3K/Akt）和核因子κB（NF-κB）细胞信号通路相关蛋白及细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin D3蛋白表达水平。结果：与未感染对照组和阴性对照组比较,TLR2-RNAi组HCT116细胞和HT29细胞中TLR2蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。与未感染对照组和阴性对照组比较,TLR2-RNAi组HCT116细胞和HT29细胞增殖活性明显降低（P<0.05）,S期和G₂期细胞百分率明显降低（P<0.05）,G₁期细胞百分率明显升高（P<0.05）。与未感染对照组和阴性对照组比较,TLR2-RNAi组HCT116细胞和HT29细胞中PI3K、p-Akt、p-NF-κβ、cyclin D1和cyclin D3蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。结论：敲减TLR2基因可以通过调控PI3K/Akt和NF-κB细胞信号通路及细胞周期相关蛋白cyclin D1和cyclin D3的表达而抑制结直肠癌细胞的增殖。     

实验性2型糖尿病小鼠肝脏组蛋白H3表观修饰的变化及其意义

目的: 研究肝脏组蛋白H3表观修饰的变化在2型糖尿病小鼠发病过程中的作用,探讨其临床意义。方法: 30只C57BL/6J小鼠分为正常组、高脂高糖组和糖尿病组,正常组和高脂高糖组小鼠分别给予正常饲料和高脂高糖饲料,糖尿病模型采用高脂高糖饲料联合注射链脲佐菌素(STZ)方法构建。采用HE染色、免疫印迹法、实时定量PCR和ChIP技术分别检测小鼠肝脏病理学变化、肝脏中总组蛋白H3的修饰状况及与糖代谢相关基因丙酮酸激酶(Pklr)、葡萄糖转运蛋白2(Glut2)、葡糖糖激酶(Gck)、过氧化物酶体增生物激活受体γ辅助活化因子 1(Ppargc1a)和胰岛素受体(Insr)的表达水平和基因启动子区组蛋白的修饰变化。结果: 糖尿病组小鼠肝脏病理学(HE染色)和组蛋白修饰模式均发生了明显变化。与正常组比较,高脂高糖组小鼠H3K23的乙酰化下降(P<0.01),H3K9Ac和H3K9Me2修饰水平上调(P<0.01),H3K4Me保持不变(P>0.05),糖代谢相关基因Pklr、Glut2和Gck的表达水平升高(P<0.01);糖尿病组小鼠H3K23Ac和H3K9Ac修饰水平下降(P<0.05或P<0.01),H3K9Me2和H3K4Me的修饰水平升高(P<0.01),糖代谢相关基因Pklr、Glut2、Gck、Ppargc1a和Insr表达水平明显下调(P<0.05或P<0.01)。Pklr、Glut2启动子区H3K23Ac、H3K9Ac、H3K9Me2和H3K4Me修饰水平变化与基因的表达水平变化相吻合。结论: 肝脏组蛋白表观修饰变化可能参与了2型糖尿病的发生发展。     

高糖对H9C2心肌细胞系和乳大鼠心室肌细胞钙库操纵性钙内流及相关蛋白的影响

目的 探究高糖环境对大鼠胚胎心肌细胞系（H9C2）和乳大鼠心室肌细胞（neonatal rat ventricular myocytes,NRVMs）钙库操纵性钙内流（store operated calcium entry,SOCE）功能的影响,对基质相互作用分子1（stromal interaction molecule 1,STIM1）蛋白表达及其激活结构的作用,完善SOCE在糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy,DCM）中的潜在致病机制。方法 将H9C2和NRVMs细胞分为2组,对照组（5.5 mmol/L葡萄糖）和高糖组（25 mmol/L葡萄糖）,分别培养48 h后用激光共聚焦显微镜实时观察各组心肌细胞在毒胡萝卜素（thapsigargin,TG）刺激后Ca²⁺荧光强度值的变化;采用Western blotting技术检测各组细胞STIM1和钙释放激活钙通道调节分子1（calcium release-activated calcium channel modulator 1,Orai1）蛋白表达的变化;借助化学交联技术和免疫荧光法检测NRVMs的STIM1蛋白的聚集变化;免疫共沉淀技术观察NRVMs心肌细胞内源性STIM1和Orai1蛋白的直接相互作用。结果 与对照组相比,高糖组H9C2和NRVMs心肌细胞钙内流（Ca²⁺ influx）显著增加（P<0.05）;高糖组H9C2和NRVMs心肌细胞STIM1以及Orai1蛋白表达上调（P<0.01）;钙库排空后,高糖组NRVMs心肌细胞STIM1蛋白聚集体显著增多（P<0.01）。结论 体外高糖能诱导大鼠胚胎心肌细胞系H9C2及乳大鼠原代培养心室肌细胞NRVMs的STIM1和Orai1蛋白表达上调,促进STIM1蛋白激活形成聚集体和SOCE激活,Ca²⁺内流增多。该作用提示高糖增加的心肌细胞SOCE可能与糖尿病心肌肥大有关。