miR-140-5p靶向Nrf2对高糖诱导的视网膜色素上皮细胞氧化应激的调节作用

目的　探讨miR-140-5p靶向核因子-类胡萝卜素2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）对高糖诱导的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial,RPE）细胞氧化应激的调节作用及对应的分子生物学机制。方法　使用5 mmol·L^-1、10 mmol·L^-1、20 mmol·L^-1、30 mmol·L^-1、50 mmol·L^-1的葡萄糖分别处理ARPE-19细胞。利用CCK-8法及RT-qPCR检测各葡萄糖浓度下ARPE-19细胞的活力及miR-140-5p、Nrf2 mRNA表达情况。将miR-140-5p inhibitor、miR-140-5p-NC、miR-140-5p-mimic、si-Con或si-Nrf2转染入ARPE-19细胞,根据转染物和葡萄糖浓度不同分组,使用DCFH-DA荧光探针检测各组细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,使用超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性试剂盒检测SOD活性;使用RT-qPCR检测不同处理的ARPE-19细胞Nrf2 mRNA表达情况,并通过荧光素酶报告基因实验对靶点进行验证。结果　与葡萄糖浓度为5 mmol·L^-1 时相比,30 mmol·L^-1、50 mmol·L^-1葡萄糖作用下ARPE-19细胞存活率显著降低（P<0.05、P<0.001）,而miR-140-5p相对表达量则明显升高（P<0.05、P<0.001）。与50 mmol·L^-1葡萄糖+miR-140-5p-NC处理组相比,50 mmol·L^-1葡萄糖+miR-140-5p inhibitor处理组细胞存活率显著增加,ROS含量显著降低,SOD活性显著增加（均为P<0.01）。与葡萄糖浓度为5 mmol·L^-1 时相比,30 mmol·L^-1、50 mmol·L^-1葡萄糖作用下ARPE-19细胞Nrf2 mRNA相对表达量均显著降低（P<0.01、P<0.001）。荧光素酶报告基因实验结果显示,与转染miR-140-5p-NC组相比,转染miR-140-5p-mimic组Nrf2相对荧光素酶活性显著降低,转染miR-140-5p-inhibitor组Nrf2相对荧光素酶活性显著增多,差异均有统计学意义（均为P<0.001）。在50 mmol·L^-1葡萄糖浓度下,与转染miR-140-5p-inhibitor+si-Con的ARPE-19细胞比较,转染miR-140-5p inhibitor+si-Nrf2后ARPE-19细胞存活率降低,细胞内ROS含量增高,SOD活性下降（均为P<0.01）。结论　miR-140-5p可能通过靶向Nrf2调节高糖诱导的RPE细胞氧化应激作用。     

OTUD6B-AS1通过miR-21-5p对高糖诱导的ARPE-19细胞增殖、迁移的影响

目的　探讨高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19)中含有卵巢肿瘤结构域的6B反义RNA 1(OTUD6B-AS1)的功能及其作用机制。方法　取ARPE-19细胞,加入含30 mmol·L^-1葡萄糖的培养基培养,设为高糖组,另取ARPE-19细胞不做任何处理设为对照组。用Lipofectamine^TM 2000转染试剂分别将过表达空质粒（pcDNA-NC组）、OTUD6B-AS1过表达质粒（pcDNA-OTUD6B-AS1组）和OTUD6B-AS1过表达质粒＋miR-21-5p 模拟物（pcDNA-OTUD6B-AS1+miR-21-5p mimics组）转染进高糖诱导的ARPE-19细胞。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测细胞中OTUD6B-AS1和miR-21-5p的表达;用CCK-8法检测各组细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力;荧光素酶报告基因实验验证OTUD6B-AS1与miR-21-5p的靶向关系。结果　与对照组比较,高糖组ARPE-19细胞中OTUD6B-AS1表达量显著降低、miR-21-5p表达量显著升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与对照组比较,高糖组细胞凋亡率显著升高,细胞增殖率和迁移率均显著降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05）。与pcDNA-NC组比较,pcDNA-OTUD6B-AS1组中细胞增殖率和迁移率显著升高,细胞凋亡率显著降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验显示,OTUD6B-AS1可靶向miR-21-5p。与pcDNA-OTUD6B-AS1组比较,pcDNA-OTUD6B-AS1＋miR-21-5p mimics组细胞凋亡率显著升高,细胞增殖率和迁移率显著降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05）。结论　OTUD6B-AS1可抑制高糖诱导的ARPE-19细胞凋亡,并促进细胞增殖和迁移,其作用机制与miR-21-5p有关。     

基于miR-224-5P调控的IL6ST/JAK/STAT信号通路在糖尿病视网膜病变发生发展中的作用

目的 探讨miR-224-5P在糖尿病视网膜病变(DR)患者中的表达变化及其在高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)中的作用和机制。方法 抽取DR患者及健康人群各6名的外周血,RT-qPCR检测miR-224-5P相对表达量。将正常培养的ARPE-19细胞随机分成高糖组(给予30 mmol·L^-1高糖)、高糖+miR-224-5P mimics组(转染100 nmol·L^-1miR-224-5P mimics后给予30 mmol·L^-1高糖)、高糖+miR-224-5P inhibitor组(转染100 nmol·L^-1miR-224-5P inhibitor后给予30 mmol·L^-1高糖)、高糖+OE-IL6ST组(转染100 nmol·L^-1OE-IL6ST后给予30 mmol·L^-1高糖)和高糖+miR-224-5P mimics+OE-IL6ST组(转染100 nmol·L^-1miR-224-...     

lncRNA KCNQ1OT1通过miR-19a-3p/TSHZ3影响高糖诱导的人视网膜上皮细胞增殖与凋亡

目的：观察长链非编码RNA(lncRNA)KCNQ1OT1通过miR-19a-3p/TSHZ3影响高糖(HG)诱导的人视网膜上皮细胞(ARPE-19)增殖、凋亡与氧化应激情况。

方法：运用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测5、15、45、135mmol/L HG刺激的ARPE-19的细胞存活率。将ARPE-19细胞分为NC组、45mmol/L HG组、si-NC+45mmol/L HG组、si-lncRNA KCNQ1OT1+45mmol/L HG组、miR-NC+45mmol/L HG组、miR-19a-3p mimics+45mmol/L HG组、si-con+45mmol/L HG组、si-TSHZ3+45mmol/LHG组、pcDNA+si-lncRNA KCNQ1OT1+45mmol/L HG组、pcDNA-TSHZ3+si-lncRNA KCNQ1OT1+45mmol/L HG组。运用CCK-8检测细胞存活率,qRT-PCR检测lncRNA KCNQ1OT1、miR-19a-3p和TSHZ3 mRNA表达,Western Blot检测TSHZ3、活化-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)蛋白质的表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测氧化应激指标活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平。双荧光素酶活性检测lncRNA KCNQ1OT1和miR-19a-3p、miR-19a-3p和TSHZ3之间的靶向结合。

结果：15、45、135mmol/L HG抑制ARPE-19细胞的存活率,后续选择细胞存活率约50%的HG浓度45mmol/L。45mmol/L HG提高ARPE-19细胞中lncRNA KCNQ1OT1、TSHZ3 mRNA、TSHZ3蛋白表达水平、凋亡率、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达、ROS和MDA水平,降低miR-19a-3p表达水平、细胞存活率(P<0.05)。lncRNA KCNQ1OT1、TSHZ3低表达或miR-19a-3p高表达提高HG诱导的ARPE-19细胞的存活率,降低凋亡率、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达、ROS和MDA水平(P<0.05)。lncRNA KCNQ1OT1靶向miR-19a-3p,miR-19a-3p靶向TSHZ3,lncRNA KCNQ1OT13通过miR-19a-3p调控TSHZ3的表达。lncRNA KCNQ1OT1低表达对HG诱导的ARPE-19细胞存活率、凋亡以及氧化应激的影响被TSHZ3过表达所逆转。

结论：lncRNA KCNQ1OT13低表达通过miR-19a-3p/TSHZ3,促进HG诱导的ARPE-19,并抑制其凋亡和氧化应激。     

miR-29b通过靶向调节特异性蛋白1调控糖尿病性白内障晶状体上皮细胞间质转化的作用

目的　探究miR-29b通过靶向调节特异性蛋白1（SP-1）调控糖尿病性白内障晶状体上皮细胞间质转化（EMT）的作用机制。方法　体外培养人晶状体上皮细胞（HLE-B3）,分为正常组、高糖组、阴性组、miR-29b mimics组和miR-29b mimics+SP-1组。除正常组细胞外,其余各组细胞于35.5 mmol·L^-1 D-葡萄糖环境中培养。阴性组、miR-29b mimics组和miR-29b mimics+SP-1组分别共转染miRNA模拟物scramble和阴性siRNA序列、转染miR-29b模拟物、共转染miR-29b模拟物和SP-1基因序列。采用实时荧光定量PCR检测各组细胞miR-29b和SP-1 mRNA表达,采用Transwell法和细胞划痕实验检测各组细胞迁移活性。采用免疫荧光染色和Western blot检测和各组细胞钙黏蛋白（E-Cadherin、N-Cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、SP-1蛋白表达情况。根据生物信息学数据库和双荧光素酶报告基因验证miR-29b和SP-1基因的靶向关系。结果　35.5 mmol·L^-1 D-葡萄糖组处理HLE-B3 24 h,细胞中miR-29b mRNA相对表达量较正常组降低,SP-1 mRNA和蛋白相对表达量均升高（均为P＜0.05）。与正常组相比,高糖组细胞Transwell小室迁移数量和划痕愈合率增加,E-Cadherin蛋白表达降低,N-Cadherin和Vimentin蛋白表达升高（均为P＜0.05）。而与高糖组和阴性组相比,miR-29b mimics组细胞miR-29b mRNA相对表达量和E-Cadherin蛋白表达增加,SP-1、N-Cadherin 和Vimentin蛋白表达降低,细胞Transwell小室迁移数量和划痕愈合率均减少（均为P＜0.05）。miR-29b mimics+SP-1组较miR-29b mimics组细胞中E-Cadherin蛋白表达降低,N-Cadherin和Vimentin蛋白表达增加,细胞Transwell小室迁移数量和划痕愈合率增加（均为P＜0.05）。经双荧光素酶报告基因验证,转染miR-29b mimics质粒可降低SP1-3’UTR-WT荧光素酶活性（P＜0.05）,但不降低SP1-3’UTR-MUT荧光素酶活性（P＞0.05）。结论　miR-29b在糖尿病性白内障体外细胞模型中表达下调。上调miR-29b表达可通过靶向SP-1基因参与抑制高糖诱导晶状体上皮细胞EMT的进程。     

miR-101表达上调对视网膜母细胞瘤细胞的增殖及侵袭能力的抑制作用

目的　探究miR-101对视网膜母细胞瘤增殖及侵袭能力的影响。方法　收集31例视网膜母细胞瘤组织及7例正常视网膜组织。培养人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181及视网膜母细胞瘤系HXO-Rb44。Lipofectamine 2000转染HXO-Rb44细胞并分组:阴性对照（normal control,NC）1组［转染microRNA（miR）-101阴性对照物］、miR-101表达组（转染miRNA-101类似物）;NC 2组［转染组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶（EZH2）阴性对照序列］、siRNA-EZH2组（转染EZH2siRNA）、siRNA-EZH2+mimics组（转染EZH2siRNA和miRNA-101类似物）和EZH2+mimics组（转染EZH2表达载体和miRNA-101类似物）。正常HOX-Rb44细胞作为空白组。采用qRT-PCR检测miR-101、EZH2 mRNA表达,Western blot检测EZH2蛋白表达。MTT及Transwell实验分别测定细胞增殖及侵袭能力。荧光素酶报告基因实验确定miR-101和EZH2的靶向关系。裸鼠体内移植实验测定细胞体内增殖能力。结果　与正常视网膜组织和ACBRI-181细胞相比,视网膜母细胞瘤组织及HXO-Rb44细胞中miR-101的相对表达量均明显下调（均为P<0.05）。EZH2 mRNA及蛋白在miR-101表达组中的相对表达量均显著低于空白组和NC1组（均为P<0.05）。72~96 h,miR-101表达组的吸光度（A）值均显著低于空白组及NC1组（均为P<0.01）。miR-101表达组侵袭细胞数量（51±6）均显著低于空白组（97±11）及NC1组（92±8）（均为P<0.01）。EZH2是miR-101的靶基因。48~96 h,siRNA-EZH2组和siRNA-EZH2+mimics组的A值均显著低于空白组和NC2组（均为P<0.01）;72~96 h,siRNA-EZH2+mimics组的A值明显低于siRNA-EZH2组（P<0.05）;24～96 h,EZH2+mimics组的A值与空白组和NC2组之间的差异均无统计学意义（均为P>0.05）。siRNA-EZH2组侵袭细胞数量（48±4）和siRNA-EZH2+mimics组（38±3）均显著低于空白组（95±10）和NC2组（90±6）（均为P<0.01）,siRNA-EZH2+mimics组侵袭细胞数量明显低于siRNA-EZH2组（P<0.05）,EZH2+mimics组侵袭细胞数量与空白组和NC2组之间的差异均无统计学意义（均为P>0.05）。裸鼠体内移植5～7周,siRNA-EZH2组和siRNA-EZH2+mimics组的瘤体体积均显著低于空白组和NC2组（均为P<0.01）,siRNA-EZH2+mimics组的瘤体体积明显低于siRNA-EZH2组（P<0.05）,EZH2+mimics组的肿瘤体积与空白组和NC2组之间的差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　miR-101上调后可抑制HXO-Rb44细胞的增殖及侵袭能力,这可能是通过抑制EZH2表达实现的。     

视网膜色素上皮细胞 LncRNA MEG3在不同葡萄糖浓度下的表达情况及对VEGF和 TGF-β1表达的影响

目的　探讨长链非编码RNA母系表达基因3（LncRNA MEG3）在不同浓度葡萄糖下表达情况及对血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。 方法　按照不同浓度d-葡萄糖培养ARPE-19细胞,随机分为5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、30 mmol·L^-1d-葡萄糖组。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测各组ARPE-19细胞LncRNA MEG3、VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平。ARPE-19细胞转染PCDNA-MEG3及PCDNA-NC质粒,建立LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞及转染空质粒的ARPE-19细胞。以含30 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM分别培养以下各组ARPE-19细胞:LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞(O组);转染空质粒的ARPE-19细胞（NC组）;加入PBS的正常ARPE-19细胞(G组);同时以含5 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM培养正常ARPE-19细胞（C组）;以上各组细胞培养24 h后,采用RT-qPCR法及Western blot法检测各组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白的相对表达水平。 结果　与5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组和30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与G组和NC组比较,O组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白相对表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论　高糖下调ARPE-19细胞LncRNA MEG3的表达,上调VEGF和 TGF-β1的表达。LncRNA MEG3过表达降低高糖诱导的VEGF和 TGF-β1表达的升高。LncRNA MEG3可能通过抑制VEGF和 TGF-β1的表达调节糖尿病视网膜病变的发展。     

circZNF292靶向miR-23b-3p/SIRT1轴调节人晶状体上皮细胞氧化应激损伤的机制分析

目的　探究circZNF292在调节人晶状体上皮细胞（LECs）氧化应激损伤中的作用及可能的分子机制。方法　收集单纯年龄相关性白内障（ARC）患眼的晶状体前囊膜组织（ARC组）和排除眼部疾病眼球捐献者的晶状体前囊膜组织（对照组）各3例,进行RNA提取及转录组学测序。应用qRT-PCR检测两组样本中circZNF292、miR-23b-3p和SIRT1 mRNA表达水平。利用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性来验证circZNF292、miR-23b-3p、SIRT1之间的靶向关系。体外培养人永生化LECs细胞系HLE-B3,分为空白对照组、NC siRNA组、circZNF292 siRNA组、NC inhibitor组、miR-23b inhibitor组、NC mimics组、miR-23b mimics组、circZNF292 siRNA+miR-23b inhibitor组。使用Lipo2000试剂转染,48 h后收获细胞。分别用MTT法、流式细胞术和荧光探针示踪法检测细胞活力、凋亡率及丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、活性氧（ROS）含量。结果　ARC组和对照组晶状体前囊膜组织样本之间鉴定得到469个下调circRNA和1231个上调circRNA,对前10位变化最明显的circRNA进行qRT-PCR验证,最终确定circZNF292在ARC组样本中下调最明显;且circZNF292与miR-23b-3p表达、miR-23b-3p与SIRT1 mRNA表达均呈负相关（r=-0.935,-0.951,均为P<0.05）。NC siRNA组和空白对照组细胞活力、细胞凋亡率及ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量比较,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。应用H₂O₂刺激后,与NC siRNA组相比,NC siRNA组+H₂O₂ HLE-B3细胞凋亡率及ROS、MDA含量均明显升高（均为P<0.05）,细胞活力及SOD、GSH-Px含量均明显降低（均为P<0.05）;而circZNF292 siRNA组+H₂O₂细胞凋亡率及ROS、MDA含量则较NC siRNA组+H₂O₂均进一步升高（均为P<0.05）,细胞活力及SOD、GSH-Px含量均进一步降低（均为P<0.05）。此外,circZNF292 siRNA+miR-23b inhibitor组上述指标较circZNF292 siRNA组则被逆转（均为P<0.05）。结论　circZNF292可通过miR-23b-3p/SIRT1轴调节人LECs氧化应激损伤,从而有望为ARC提供新的治疗靶标。     

miR-17-5p对小梁网细胞外基质蛋白表达的调控作用及其机制

目的　探讨miR-17-5p对小梁网细胞外基质（ECM）蛋白表达的调控作用及其机制。方法　收集原发性开角型青光眼（POAG）患者和正常小梁网组织,利用RT-PCR和Western blot分别检测miR-17-5p和Smad3表达;将人小梁网细胞（HTMCs）分为miR-17-5p mimics和miR-17-5p NC组,分别转染载有miR-17-5p mimics组和miR-17-5p NC的载体,Western blot检测HTMCs中ECM蛋白纤连蛋白（FN）、胶原蛋白I（CoL-I）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达;靶基因预测库预测miR-17-5p靶基因,荧光素酶报告载体联合Western blot鉴定靶基因。HTMCs中共转染miR-17-5p mimics和Smad3过表达载体,Western blot检测各转染组细胞中Smad3、FN、CoL-I、α-SMA的蛋白表达。结果　正常小梁网组织中miR-17-5p表达量为1.16±0.11,高于POAG小梁网组织的0.19±0.04,差异有统计学意义（t=10.641,P<0.001）;正常小梁网组织中Smad3蛋白表达量为0.31±0.06,低于POAG小梁网组织的0.86±0.07,差异有统计学意义（t=8.105,P<0.001）。miR-17-5p mimics组HTMCs中FN、CoL-I和α-SMA蛋白表达均低于miR-17-5p NC组,差异均有统计学意义（均为P<0.001）;靶基因预测库预测及荧光素酶报告载体联合Western blot鉴定证实Smad3为miR-17-5p下游靶基因;miR-17-5p+Smad3转染组HTMCs中Smad3、FN、CoL-I和α-SMA蛋白表达均高于miR-17-5p+vector转染组,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。结论　miR-17-5p 能抑制HTMCs的ECM蛋白表达,这一过程可能是通过靶向抑制Smad3表达而实现的。     

地塞米松对脂多糖诱导人视网膜色素上皮细胞炎症损伤及NLRP3/Caspase-1通路的影响

目的　探究地塞米松（Dex）对脂多糖（LPS）诱导人视网膜色素上皮（HRPE）细胞炎症损伤及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）通路的影响。方法　体外培养ARPE-19细胞株,MMT法检测不同浓度Dex处理细胞24 h、48 h、74 h对LPS诱导ARPE-19细胞存活率的影响,确定Dex最佳处理浓度和时间。ARPE细胞随机分为:正常对照组（NC组）、LPS组（5 mg·L^-1 LPS）、Dex组（0.20 mol·L^-1 Dex）、Dex+LPS组（0.20 mol·L^-1 Dex+5 mg·L^-1 LPS）,RT-qPCR检测各组细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达量,ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达水平,Western blot检测NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平。结果　同一时间点,与NC组比较,LPS组ARPE-19细胞存活率均显著降低（均为P<0.05）,且随着Dex浓度增加,细胞存活率呈先升高后下降的趋势;0.20 mol·L^-1 Dex作用LPS诱导的ARPE-19细胞24 h时细胞存活率为(90.77±5.73)%,接近NC组,因此选用0.20 mol·L^-1Dex作用24 h用于后续实验。NC组与Dex组间TNF-α、IL-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达量差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。与NC组、Dex组比较,LPS组、Dex+LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6、 NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著升高,且Dex+LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6 、NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著低于LPS组（均为P<0.05）。结论　Dex可能通过抑制NLRP3/Caspase-1通路减轻LPS诱导的HRPE炎症损伤。     

纳豆激酶对高糖缺氧诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的 探讨纳豆激酶(NK)对高糖缺氧导致的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)损伤的保护作用。方法 不同浓度的葡萄糖和氯化钴(CoCl₂)诱导培养ARPE-19细胞24 h后,观察细胞形态变化,采用CCK-8法检测ARPE-19细胞活性。Western blot和RT-qPCR检测紧密连接蛋白-1(ZO-1)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、白细胞介素(IL)-1β、IL-18的表达情况,筛选最佳葡萄糖和CoCl₂浓度构建体外高糖缺氧的细胞模型。CCK-8法筛选合适的NK浓度,将ARPE-19细胞分为正常糖组(5.5 mmol·L^-1葡萄糖,NC组)、高糖+CoCl₂组(25.0 mmol·L^-1葡萄糖+200μmol·L^-1 CoCl₂,HG+CoCl₂组)和NK处理组(1.0μmol·L^-1 NK+25.0 mmol·L^-1葡...     

miR-21对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡及PTEN/AKT通路的影响

目的　探讨miR-21对H₂O₂诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡以及PTEN/AKT通路的影响。方法　体外培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19,实验分为四组:空白对照组、阴性对照组、H₂O₂组、H₂O₂+miR-21mimics组,使用q-RT-PCR法检测各组ARPE-19细胞中miR-21表达,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3以及人第10号染色体缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN）、磷酸化AKT蛋白表达。结果　与空白对照组和阴性对照组相比,H₂O₂组和H₂O₂+miR-21 mimics组miR-21表达量（1.14±0.23、2.18±0.44）、SOD水平［（5.49±1.10） U·L^-1、（14.28±2.86） U·L^-1］、Bcl-2蛋白含量（0.34±0.07、0.62±0.12）、p-PI3K表达水平（0.46±0.09、0.68±0.13）、p-AKT水平（0.53±0.11、1.16±0.13）均显著降低,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）,而活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）水平（30.58±7.96、23.25±5.67）、MDA水平［（3.95±0.79）mol·L^-1、（2.13±0.43）mol·L^-1］、凋亡率［（25.48±5.10）%、（17.63±3.52）%］、PTEN蛋白表达（0.59±0.12、0.43±0.11）、Bax表达（0.73±0.15、0.49±0.10）、Caspase-3蛋白表达（0.85±0.17、0.42±0.08）均显著升高,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。与H₂O₂组相比,H₂O₂+miR-21 mimics组miR-21表达量、SOD水平、Bcl-2蛋白表达、p-PI3K及p-AKT蛋白表达均显著升高（均为P＜0.05）,ROS水平、MDA水平、细胞凋亡率、PTEN蛋白表达、Bax及Caspase-3蛋白表达均显著降低（均为P＜0.05）。结论　上调miR-21可能通过激活PTEN/AKT信号通路抑制H₂O₂诱导的视网膜色素上皮细胞细胞凋亡。     

miR-34a-5p对ARPE-19细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达及细胞增殖、迁移和上皮-间质转化的影响

目的 探讨miR-34a-5p对ARPE-19细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达及细胞增殖、迁移和上皮-间质转化(EMT)的影响。方法 将ARPE-19细胞分为4组：对照组、转化生长因子(TGF)-β1组、miR-34a-5p过表达组与复合干预组,对照组与TGF-β1组采用Lipofectamine 2000转染试剂转染对照模拟物,miR-34a-5p过表达组与复合干预组转染miR-34a-5p模拟物,培养24 h后采用无血清培养基饥饿培养12 h, TGF-β1组与miR-34a-5p过表达组均添加10 mg·L^-1的TGF-β1,复合干预组添加10 mg·L^-1的TGF-β1与10μmol·L^-1的TGF-β通路激活剂SRI-011381,各组细胞继续培养24 h,测定细胞增殖、迁移与EMT。采用Western blot检测细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白的表达水平,Ki67荧光染色检测细胞增殖情况,免疫荧光染色测定细胞EMT相关蛋白表达情况,划痕实验和Transwell实验测定细胞的迁移和侵袭能力。结果 ...     

miRNA-19对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其机制研究

目的 探讨miR-19在葡萄膜黑色素瘤(UM)细胞中的表达及其对UM细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其作用机制.方法 qRT-PCR检测正常视网膜上皮细胞系ARPE-19和UM细胞系 SP6.5、M23中 miR-19的表达.将 M23细胞分为 miR-19 inhibitor 组(转染 miR-19-inhibit...     

视网膜色素上皮细胞通过分泌含有miR-4488的外泌体抑制糖尿病视网膜病变进展的机制研究

目的　探讨视网膜色素上皮细胞通过分泌含有miR-4488的外泌体抑制糖尿病视网膜病变进展的分子机制。方法　将人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞分为空白组、高糖组。将人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）分为NG组、HG组、NG+外泌体组和HG+外泌体组。空白组、NG组和NG+外泌体组细胞用含5.5 mmol·L^-1正常浓度葡萄糖的培养基培养24 h;高糖组、HG组和HG+外泌体组细胞用含30 mmol·L^-1高浓度葡萄糖的培养基培养24 h;NG+外泌体组和HG+外泌体组细胞在培养基中分别加入空白组或高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体40 μg·L^-1。PKH67绿色荧光标记外泌体;利用CCK-8法、Transwell小室法检测HRMECs增殖、迁移和血管生成。取空白组和高糖组ARPE-19细胞外泌体进行miRNA微阵列分析。采用双荧光素酶报告分析检测miR-4488和转化生长因子β受体Ⅱ（TGFβR2）基因序列的靶向关系。采用Western blot或免疫荧光染色检测各组HRMECs中TGFβR2、Smad2、p-Smad2ser467或Desmin、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。结果　空白组和高糖组ARPE-19细胞分泌的被PKH67标记的外泌体加入培养基后都可被HRMECs吸收。与NG组相比,HG组HRMECs细胞增殖率、迁移率、血管结点数和血管总长度、TGFβR2和p-Smad2ser467蛋白表达量、Desmin和α-SMA蛋白荧光强度均增加（均为P<0.05）;与HG组相比,HG+外泌体组上述指标均被逆转（均为P<0.05）;NG+外泌体组与NG组上述指标相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。与空白组相比,高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体中miR-4488相对表达量增加,且miR-4488模拟物和TGFβR2wt共转染可增加双荧光素酶活性（均为P<0.05）。结论　在高糖条件下,ARPE-19细胞释放的外泌体可通过miR-4488/TGFβR2/Smad信号通路抑制HRMECs间充质转化。