干扰素刺激反应元件Ⅰ/Ⅱ在维甲酸诱导基因G表达调控中的作用

目的 深入研究维甲酸诱导基因G(retinoic acid-induced gene G,RIG-G)启动子上所含的干扰素刺激反应元件(interferon-stimulated response elements,ISRE)对RIG-G基因表达的调控作用.方法 根据RIG-G基因启动子所包含的ISRE序列,利用定点突变技术分别构建野生型和位点突变型的报告基因质粒,然后采用报告基因转染实验检测RIG-G基因启动子中ISRE序列的功能活性.结果 研究发现单独突变RIG-G基因启动子上的ISRE Ⅱ元件不影响报告基因的表达,而单独突变ISRE Ⅰ则会对报告基因的表达产生明显的抑制作用;同时突变ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件则会使报告基因完全失去对转录因子的反应性.结论 RIG-G基因启动子所包含的ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件是诱导该基因表达的转录因子复合物的作用位点,是该基因表达的分子基础,且ISRE Ⅰ元件的作用要优先于ISRE Ⅱ.     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响1

目的探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原(COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响.方法构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的重组体pCOLH0.27与pCOLH2.5,它们分别含该启动子序列-268～+42bp(0.27kb)与-2483～+42bp(2.5kb)片段.将这2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞,加入IGF-1或胰岛素,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性.结果13nmol/LIGF-1使转染后的这2个重组体活性分别增高3.68倍与4.04倍.2.5μmol/L的胰岛素亦使之分别增高3.69倍与3.93倍.TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF-1与胰岛素诱导的pCOLH2.5活性.结论IGF-1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达,TNF-α、IFNγ、IFNα能抑制IGF-1和胰岛素的这一作用.     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响

目的 :探讨胰岛素样生长因子 1(IGF 1)和胰岛素对人α1(Ⅰ )前胶原 (COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响。方法 :构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)报告基因的重组体pCOLH0 2 7与pCOLH2 5 ,它们分别含该启动子序列 2 68～ 4 2bp( 0 2 7kb)与 2 4 83～ 4 2bp( 2 5kb)片段。将这 2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞 ,加入IGF 1或胰岛素 ,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性。结果 :13nmol/LIGF 1使转染后的这 2个重组体活性分别增高 3 68倍与 4 0 4倍。 2 5 μmol/L的胰岛素亦使之分别增高 3 69倍与 3 93倍。TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF 1与胰岛素诱导的pCOLH2 5活性。结论 :IGF 1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达 ,TNF α、IFNγ、IFNα能抑制IGF 1和胰岛素的这一作用。     

细胞因子对HLA-B27启动子的调节作用及其在强直性脊柱炎发病机制中的意义

目的： 构建含HLA-B27启动子的HeLa稳定转染细胞株，观察7种细胞因子对HLA-B27启动子及其上游NF-κB及ISRE顺式作用元件活性的调节作用，探讨强直性脊柱炎（AS）等B27相关疾病的发生机制。方法:转染HeLa细胞，抗生素筛选单克隆构建含HLA-B27启动子的稳定转染细胞株。构建HeLa-B27稳定细胞株和HeLa-NF-κB稳定细胞株，在瞬时转染pISRE-luc的HeLa细胞中加入白细胞介素1α（IL-1α）、 白细胞介素1β（IL-1β）、 肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素α（IFN-α）、干扰素β（IFN-β）、 干扰素γ（IFN-γ）和转化生长因子β（TGF-β），观察7种细胞因子对B27启动子及其上游NF-κB和ISRE作用元件的调节作用。另外在HeLa-B27 稳定细胞株培养液中同时加入3种细胞因子单克隆抗体和相应细胞因子，观察其对启动子活性的调节作用。结果:TNF-α、IFN-α、IFN-β 和 IFN-γ 均能明显增强HeLa细胞B27启动子活性。细胞培养96 h 后，IFN-β为最强的启动子诱导剂（5.4倍，P<0.05）；细胞培养8 h 内，TNF-α、IL1-α 和 IL1-β,可诱导NF-κB的活性增加30倍左右（P<0.05），IFN-α 和IFN-β 可诱导ISRE的活性增加12倍左右（P<0.05），抗TNF-α 抗体对于I类IFN 增加的B27 启动子活性没有明显的抑制作用。结论：TNF-α和IFN 可通过结合于B27 启动子中各种转录因子结合元件调控HLA-B27启动子的转录活性，IFN-β 可能在强直性脊柱炎等B27 相关的脊柱关节病的发病机制中起着重要作用。     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人a1（I）前胶原启动子活性的影响

目的：探讨胰岛素样生长因子1（IGF-1）和胰岛素对人a1(I)前胶原（COL1A1）基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子a(TNFa）、干扰素γ（IFNγ）、干扰素a(INFa）对这一作用的影响。方法：构建含 COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因的重组体pCOLH0.27与pCOLH2.5,它们分别含该启动子序列-268～ 42bp(0.27kb)与-2483～ 42bp(2.5kb)片段。将这2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞,加入IGF-1或胰岛素,部分细胞还加入TNFa或IFNγ或IFNa,测定CAT活性。结果：13nmol/L IGF-1使转染后的这2个重组体活性分别增高3.68倍与4.04倍。2.5umol/L的胰岛素亦使之分别增高3.69倍与3.93倍。TNFa、IFNγ、IFNa能降低IGF-1与胰岛素诱导的pCOLH2.5活性。结论：IGF-1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达,TNF-a、INFγ、IFNa能抑制IGF-1和胰岛素的这一作用。     

α-干扰素刺激基因的信号转换和转录调控

α-干扰素(IFN-α)与高亲和膜受体结合后刺激基因表达。目前为止所有克隆出的IFN-α刺激基因的特点是都有一个DNA元件存在,该元件叫做IFN刺激应答元件(ISRE),常位于基因的5′上游区。紧随着IFN与受体结合启动的信号转换,一种或几种核因子结合到ISRE上,这为IFN-α信号的快速转换提供了一个方便的检测方法。其转换过程利用了PLA_2产生的能调节ISRE结合因子的第二信号分子。克隆表达确定了两个可能作为信号受体的特异ISRE结合蛋白。深入研究IFN作用的分子机理可以应用酵母遗传学方法,酵母中表达的人P68激酶具有生长抑制表型,从而提供了分析IFN刺激途径的成分的另一有用手段。     

干扰素gamma的信号转导通路

干扰素gamma(IFN-γ)是一个重要的多向细胞因子,它通过激活细胞膜表面的激酶(JAK)、磷酸化偶联信号转导系统(STAT),活化的STAT移至核内,并结合特异的DNA元件,进行相应的基因转录.JAK-STAT1信号的各个水平均受到严格的抑制性调控,指导基因转录.严格的弱化性抑制信号调控对于精确可控的细胞反应至关重要,其中该信号有三个抑制信号,磷酸酪氨酸磷酸酶(FTP)家族,细胞因子信号抑制因子(SCOS)家族以及活化STAT抑制蛋白(PIAS)家族,它们各自通过特异性的途径在信号转导的不同层面显示出核心调控作用.     

Caspases在视黄酸诱导pRARE4-IFNα转染肿瘤细胞凋亡中的作用

目的探讨视黄酸(RA)及其诱导的外源性α-干扰素(IFNα)抗肿瘤作用与半胱氨酸蛋白酶(caspase)的关系。方法含视黄酸反应元件(RARE)的IFNα表达载体(pRARE4-IFNα)，转染肿瘤细胞并证实外源性IFNα基因的表达受RA的诱导后，分析了细胞增殖功能、细胞DNA梯形带，caspase-1、3基因表达，caspase-3活性以及caspase-3特异性抑制剂(DEVD-CHO)对RA和／或IFNα诱导细胞凋亡的抑制作用。结果对RA敏感的HL60细胞和caspase-3基因缺失的MCF-7细胞经RA处理后，增殖能力减弱，出现明显的DNA梯形带，caspase-1基因表达上调节，HL-60细胞caspase-3基因表达上调节，活性升高，DEVDCHO可拮抗RA引起的HL-60细胞caspase-3活性升高，并部分削弱RA引起的细胞增殖抑制和凋亡。结论Caspase-3在RA诱导的细胞凋亡中有重要作用，同时，RA可能通过其它途径诱导caspase-3基因缺失细胞的凋亡。     

三种α干扰素亚型单抗的特性鉴定

采用中和活性法、免疫印迹法 ,通过α1b、α2b、α2a干扰素与自制的 6株单抗反应的结果差异 ,对 3种干扰素加以鉴别。中和活性结果表明 ,AK1单抗只与IFN α1b有中和活性 ,AK2单抗只与IFN α2有中和活性 ,而AK4单抗与IFN α1b和IFN α2b皆有中和活性。免疫印迹结果表明 ,AK1单抗只与IFN α1b有印迹反应 ,AK2与IFN α2有印迹反应 ,而AK4单抗与IFN α1b和IFN α2b皆有印迹反应 ,与IFN 2a无印迹反应。AK1或AK2能够鉴别IFN α1b与IFN α2 ,AK4能够鉴别IFN α2a与IFN α2b。     

新型基因工程干扰素受体结合域的改造及其生物活性测定

目的 改造干扰素功能结合域，以提高干扰素的生物学活性。方法 在新型基因工程干扰素（IFNα1c/86D)AB环内通过点突变技术引入2个独立酶切位点EcoRV和EstEⅡ，用聚合酶链反应（PCR）技术在干扰素cDNA水平对母体干扰素LoopAB的31位甲硫氨酸换成天冬氨酸（M－D），32位天冬氨酸换成脯氨酸（D－P），将重组基因在大肠埃希菌中表达，用滤泡口炎病毒（VSV）－人羊膜传代细胞（WISH）系统检测抗病毒活性。用比色MTT实验检测抗增殖活性。结果 通过突变，31和32位氨基酸获得重组突变体3132IFNα1c/86D，经限制性内切酶图分析、DNA序列和抗病毒活性测定，初步表明3132IFNα1c/86D是母体干扰素IFNα1c/86D抗病毒活性的8倍，抗增殖作用与母体干扰素相比差异无显著性。结论 改造干扰素受体结合域，可提高干扰素的抗病毒活性。     

1141612823Effect of recombinant ovine intereferon tau (IFN) on the ovine Mx1 promoter/enhancer region

Ovine Mx1 (oMx1) is expressed in the uterus during the estrous cycle and is strongly up-regulated during early pregnancy in the uterus and peripheral blood leukocytes. Mx proteins are GTPases which are important elements in innate immunity. Our results showed that steroids are required for oMx1 protein induction by IFN in the uterus. To addresses the role of IFN in regulating oMx1 expression, a 2.1 kb fragment containing 1.7 kb of the promoter/enhancer, exon1 and partial intron A was cloned. Serial deletions were prepared along with a clone that contained the 2 promoter-ISREs (-101 & −145) but not the intronic-ISRE (+224). An ovine uterine cell line was transfected with reporter plasmids driven by the oMx1 promoter deletion constructs. The full-length promoter was induced by IFN in a dose- and time-dependent manner. Treatment with 10,000 AVU/mL IFN increased luciferase activity 5- and 10-fold at 3 and 12 hr, respectively. Promoter deletions showed the 2 proximal ISRE (−101 and −145), but not an intronic ISRE (+244), were required for maximal response. Deletion of a distal region (−920 to −715) resulted in decreased luciferase activity (~4-fold). However, subsequent deletion of the −715 to −437 region restored maximal promoter response (~10-fold). Results suggest that regions −920 to −715 and −715 to −437 have positive and negative regulatory element binding sites, respectively. The importance of the 2 proximal ISRE sites for oMx1 promoter activation is consistent with results for the human MxA promoter. An intronic ISRE is present in the human MxA gene, however, this site may not be required for oMx1 promoter activation by IFN. Identifying positive and negative regulatory regions in oMx1 promoter may help elucidate the unique regulation of Mx1 during early pregnancy.     

Characterisation of gamma-interferon responsive promoters in fish

Reporter constructs of three interferon (IFN)-gamma-induced rainbow trout genes were generated to examine specificity to type I or type II IFN. Constructs included gammaIP-10, LMP2 and TAP2 and were used to transfect trout fibroblast cells (RTG-2) which were then exposed to rainbow trout rIFNs. The gammaIP-10 construct showed high reporter activity even in the absence of rIFNs. The LMP2 promoter contained one GAS element and two double ISRE elements, of four constructs made, only those with ISRE elements showed significant reporter activity following rIFN-gamma stimulation. The TAP2 regulatory region contained two GAS, two ISRE and one C/EBP element from which four constructs were made. Reporter expression for the construct containing all five elements showed an 11- and 2-fold increase in response to rIFN-gamma and type I rIFN, respectively. Constructs containing only the GAS elements did not respond to rIFNs. The TAP2 construct with two ISRE and the C/EBP gave the greatest dose-dependent reporter response to rIFN-gamma, with no significant response to type I rIFN. These data suggest that the ISRE elements, or elements nearby, are essential for the induction of type II IFN responsive genes in trout. The TAP2 construct is a candidate to develop a IFN-gamma reporter stable cell line.     

Cloning and characterizing of the ovine MX1 gene promoter/enhancer region

Ovine MX1 (MX1) is expressed in the uterus during the estrous cycle and is strongly up-regulated during early pregnancy in the uterus and peripheral blood leukocytes. In this study we cloned the MX1 gene promoter/enhancer, and tested its response to interferon tau (IFN-tau). To address the role of IFN tau in regulating MX1 expression, serial deletion mutants were prepared along with a clone that contained a full-length promoter including the two proximal ISREs but lacking an intronic ISRE site. Promoter deletions showed the two proximal ISRE sites, but not the intronic ISRE site, were required for maximal response to IFN tau. Interestingly, MX1 promoter deletion mutants revealed the presence of distal positive (-920 to -715) and negative (-715 to -437) regulatory regions. Identifying positive and negative regulatory regions in MX1 promoter will help define the complex regulation of MX1 during early pregnancy in ruminants.     

SLC2A4基因启动子区rs5418位点变异对基因表达的影响

目的: 研究葡萄糖转运蛋白4(SLC2A4)基因启动子区rs5418多态位点G→A变异对基因表达的影响。方法: PCR法扩增SLC2A4基因核心启动子区序列。采用基因重组、定点突变等技术,构建rs5418位点含有不同等位基因的SLC2A4基因启动子重组表达载体。脂质体转染法将重组质粒转入HEK293T细胞,采用双萤光素酶报告系统,观察携带不同等位基因的重组质粒中下游报告基因的表达活性。结果: PCR扩增获得长度为716 bp的SLC2A4基因核心启动子序列,成功构建pGL3-SLC2A4-prom(A)和pGL3-SLC2A4-prom(G)重组表达载体。双萤光素酶报告基因活性检测结果显示,携带A等位基因的载体启动下游报告基因表达的相对活性(19.49±4.41)比携带G等位基因的载体(13.04±4.45)强,两者存在显著差异(P<0.05)。结论: SLC2A4基因启动子区rs5418位点的G→A突变能显著增强启动子活性,从而影响SLC2A4基因表达活性。