单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞中培养与增殖特性的研究

目的研究单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）在非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）中培养及增殖的合适条件。方法把HSV-2接种于Vero细胞中培养和传代,于不同时间收获病毒液并测毒力,进行不同培养条件的摸索。结果pH值、残留牛血清是HSV-2在Vero细胞培养的影响因素,最佳收毒时间为36-72h。在Vero细胞上培养病毒3-5代,病毒毒力较高。结论建立了单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞上培养增殖的初步方法,为下一步建立HSV-2的潜伏与激发细胞模型打下基础。     

传统草药与无环鸟苷联合应用对HSV-1感染的体内外作用

大量文献报道,联合用药能增强无环鸟苷(ACV)抗Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)的作用效果,尤其对 ACV 耐药株的 HSV-1感染。作者选择10种临床上常见的传统草药水提液与 ACV 联合用药,进行抗 HSV-1感染的体内外实验研究。体外实验利用细胞培养技术,将 HSV-1(感染滴度100PFU/0.2ml)接种于 Vero 单层细胞上,在含有不同药物的细胞维持液中培养2天。结果发现,10种     

人早孕蜕膜单层细胞与鼠胚共培养系统的建立

目的　获得鼠胚与人早孕蜕膜单层细胞的共培养系统。方法　经过细胞培养、传代获得蜕膜单层细胞 ;冻融后接种获得冻融蜕膜单层细胞 ;对单层细胞作免疫组织化学检查其雌、孕激素受体的表达。结果　人早孕蜕膜细胞有良好的体外培养活力 ,易于获得培养及传代。将获得的冻融蜕膜单层细胞进行雌、孕激素受体检查 ,见阳性表达。获得昆明白小鼠超促排卵后的单细胞受精卵 ,分别与传代及冻融的蜕膜细胞共培养获得囊胚孵出。结论　人早孕蜕膜单层细胞与鼠胚共培养系统的建立为人胚胎与其冻融的自体子宫内膜单层细胞共培养的研究提供了可行性分析。     

乌鲁木齐市手足口病病毒分离技术的研究

目的探索乌鲁木齐市手足口病病毒分离培养的最适细胞系和最优培养条件,为手足口病的防治提供技术支持。方法采集适当的临床标本,对标本进行核酸提取和鉴定,根据不同的手足口病病毒分离方法,随机选取相应的阳性标本接种于横纹肌肉瘤传代细胞(RD),观察结细胞病变效应(CPE),有4+病变的培养液进行RT-PCR鉴定其效果。结果 2013-2015年共检测手足口病病例标本2 267份,肠道病毒总阳性率为79.31%,在病原体进行病毒分离时最佳细胞系是RD细胞,最优培养温度条件是35℃,血清浓度为2%,接种量为300μl,接种方式为直接接种,样本采集以粪便标本最佳。结论合理的细胞系和培养条件可以明显提高病毒的分离培养效率。     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞的传代培养

目的：获得纯度较高的星形胶质细胞材料用于进一步实验。方法：采用大鼠神经胶质细胞的原代培养和传代培养方法。取生后24h以内Wistar大鼠脑皮层，用机械法和胰蛋白酶消化法分散细胞，制成细胞悬液，接种于无底物黏附培养瓶中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。培养液为DMEM/F12混合培养液。待细胞铺满瓶底后传代，并对传代细胞进行形态观察、吖啶橙荧光染色和星形胶质细胞的免疫细胞化学鉴定。结果：通过传代得到了形态典型含量较高的星形胶质细胞。结论：在无底物黏附培养的条件下，星形胶质细胞在体外能够得到良好的生长，并被纯化。     

经典方法与LaSRT法测定绿色荧光蛋白标记重组病毒滴度的研究

目的以带有绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的重组逆转录病毒为例,对经典方法与批量快速病毒滴度法(LaSRT)测定病毒滴度进行比较研究。方法(1)经典方法:于6孔培养板分别接种NIH3T3细胞2×105/孔,培养12 h 后分别以0.5 ml、50 μl和5 μl带有GFP 标记基因的病毒感染,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以流式细胞仪检测细胞eGFP 率。病毒滴度(TU/ml)=(2×105×细胞eGFP 率)/病毒原液体积。(2)LaSRT法:NIH3T3 细胞以5 000/孔接种于96 孔板,12 h后更换成完全培养液90 μl/孔,以8孔为一组,第1 孔中加入病毒液10 μl,此后每孔依次10∶1 倍比稀释,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以浓度自高到低的方向,在荧光倒置显微镜下确定计量孔(第n孔),计数孔中的阳性细胞数m。病毒滴度(TU/ml)=m×10n 1。(3)对7批病毒以LaSRT法研究,探讨冻存/复苏过程对重组病毒滴度的影响。结果经典方法测定的重组病毒滴度为(1.54±0.38)×106 TU/ml,LaSRT法测定的病毒滴度为(1.33±0.57)×106 TU/ml,两者无统计学差异(P>0.05)。LaSRT法可以大批量、快速地测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度。单次冻存/复苏后的病毒滴度为冻存前的(18.1±9.9)%(n=7)。结论LaSRT法和经典方法测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度,结果无统计学差异;LaSRT法获得结果简     

新复苏MDCK细胞培养甲型H3N2流感病毒方法的优化

目的优化甲型H3N2流感病毒在新复苏的犬肾细胞(MDCK)上的培养条件,提高该病毒在新复苏细胞上培养的分离效果。方法选取6例复核鉴定过的甲型H3N2病毒株,以吸附法分别接种于新复苏的MDCK细胞上培养,检测收获病毒液HA滴度,通过比较不同的细胞胞龄、细胞代次、病毒接种吸附时间对甲型H3N2流感病毒易感性的影响,确定最佳培养条件。结果不同胞龄MDCK细胞接种H3N2病毒后,胞龄为3 d、4 d的细胞所收获的病毒液HA滴度均明显高于其他组,差异有统计学意义(F=1. 279,P=0. 027);对复苏后第2代、第3代、第4代细胞进行接种后,H3N2病毒HA均明显高于第一代细胞,差异有统计学意义(F=0. 765,P=0. 008);病毒接种吸附时间(1～2 h)对甲型H3N2病毒HA滴度没有明显影响,差异无统计学意义(F=2. 743,P=0. 178)。结论甲型H3N2病毒接种于新复苏MDCK细胞最佳培养条件为:选用复苏后传代培养至第二代及以后、胞龄3～4 d的MDCK细胞进行接种,接种吸附时间1～2 h之内,可获得HA滴度较高的甲型H3N2流感病毒液。     

纳米雄黄对单纯疱疹病毒Ⅱ型的体外抗病毒活性

目的：探讨纳米雄黄对单纯疱疹病毒II型(herpes simplex virus Type II,HSV-2)的体外抗病毒活性。方法： 以阿昔洛韦作为阳性对照,采用噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]法观察 不同浓度(200.00,150.00,100.00,50.00,25.00,12.50,6.25,3.13,1.54,0.78,0.39和0 mg/L)纳米雄黄对正常非洲 绿源猴肾细胞(Vero细胞)作用48 h的细胞毒性;空斑法测定病毒滴度,建立病毒感染细胞模型,并采用细胞病变观 察和MTT结合的方法对不同浓度(20.00,10.00,5.00,2.50,1.25,0.63,0.31,0.15,0.08,0.04和0 mg/L)纳米雄黄在 预防、治疗及直接灭活病毒3种给药方式下的抗HSV-2活性进行评价。结果：纳米雄黄对正常Vero细胞的半数细胞毒 性浓度为37.15 mg/L,HSV-2病毒滴度为7.30 log PFUs/mL,纳米雄黄在预防、治疗和直接灭活病毒3种给药方式下对 HSV-2感染细胞的半数有效浓度分别为0.13,1.80和0.52 mg/L,对应的治疗指数分别为285.77,20.64和71.44,纳米雄 黄在预防给药下的治疗指数高于其治疗和直接灭活给药。结论：纳米雄黄在3种给药方式下均具有良好的抗HSV-2活 性,且预防给药的疗效较好。     

蚀斑法定量测定HSV-2病毒颗粒的优化实验条件

目的 建立稳定易操作的HSV-2蚀斑技术,为纯化和定量测定HSV-2毒株的感染性研究提供依据。方法HSV-2病毒悬液接种至Hela细胞单层,分别经37℃吸附和室温吸附60min,用含0．75％琼脂糖或0．75％羧甲基纤维素RPMI 1640液覆盖,3d后用1％结晶紫染色5min,记数蚀斑数量,在挑取蚀斑接种扩增及保祓的同时,应用PCR法对蚀斑培养物进行鉴定。结果 蚀斑经1％结晶紫染色在Hela细胞单层上呈紫色,多为圆形,着色深,散在分布,与周围区域界限明显。用琼脂糖和羧甲基纤维素覆盖下所形成的蚀斑大小及形状不同,但病毒滴度差异无显著性（P〉0.05）。经室温和37℃吸附的病毒滴度差异亦无显著性（P〉0．05）。结论 建立了简便易行的蚀斑形成测定方法,可准确滴定HSV-2病毒感染数量和感染力。     

鸡胚成纤维细胞培养抗肿瘤NDV疫苗的实验研究

目的用细胞培养法研制高效价人用抗肿瘤NDV。方法采用鸡胚成纤维细胞低血清培养法,在接种NDV之前的细胞培养中,少量使用优质小牛血清（2%）,让单层细胞基本铺满培养瓶底时,用无血清培养液多次洗涤单层细胞,以尽量降低残余牛血清含量。接种NDV之后,以人白蛋白代替小牛血清继续滋养细胞,培养病毒。结果NDV收获液LogPFU≥5.5,血凝效价1：640,经反向间接血凝试验检测,残余牛血清蛋白含量≤50ng/ml。结论NDV效价和活性符合人用疫苗要求。     

紫外线照射的HSV-2在人胚肺传代细胞上的持续感染

紫外线照射的HSV-2,感染人胚肺传代细胞株后,建立了持续感染,但未能获得转化细胞。将1976年自武汉地区宫颈癌患者宫颈脱落细胞中分离的HSV-2吴株,分23批,用不同剂量紫外线照射不同时间后,31次感染HEL传代细胞。结果有两例分别传至430天和385天,连续传代都在一年以上,传代过程的特征,基本符合HSV在细胞培养中持续感染的体外模型;表现为培养初期有周期性地出现细胞感染和细胞再生长情况。培养中期细胞增殖速度略慢,可形成细胞灶和融合的多核巨细胞,这时细胞和病毒似乎都在变异,细胞变得略有抵抗力,病毒变得毒力较弱。但最后细胞全部产生病变,自瓶壁脱落,停止分裂增殖。     

shRNA表达载体对HSV-2 ICP4基因的干扰效应

目的构建针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2) ICP4基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达载体,探究该载体表达的shRNA对HSV-2的抑制作用。方法重组表达载体通过脂质体转染法转染HEK293细胞,并接种HSV-2,48h后,实时荧光定量RT-PCR检测mRNA转录情况,Western blot检测ICP4蛋白的表达情况,终点滴定法测定病毒的滴度。结果与对照组相比,干扰组对mRNA抑制率为71%,使蛋白表达减少71.81%,并且病毒滴度也明显降低(P<0.05)。结论构建的pGPU6/Neo-shRNA ICP4重组质粒表达载体能在体外细胞水平上干扰HSV-2 ICP4的基因表达,抑制HSV-2在细胞中复制。     

狂犬病毒CTN-1株在Vero细胞中持续感染的特性研究

目的 观察以Veto细胞大规模生产狂犬病毒时的细胞生长和病毒感染特性。方法 以分种和混种方法，经过不同培养时间，测定Vem细胞的生长状况和胞内外病毒含量。结果 细胞形态随接种病毒时间的长短有所变化，不同接种方法在病毒滴度也无显著性差异。培养上清夜病毒含量以第4～9d滴度最高，细胞病毒感染率在第4d达80％以上，第10d后开始下降，第15d降入低谷。结论 以0．01～0．10MOI的加毒比例，培养第4，9d收获效果最佳。     

单纯疱疹病毒2型DNA提取及ICP10启动子基因获得和纯化

目的用单纯疱疹病毒2型DNA,扩增并纯化得到ICP10启动子基因。方法培养vero细胞并接种HSV-2,获得大量HSV-2。用酚:氯仿提取病毒DNA,用PCR方法获得病毒ICP10启动子基因,并用UNIQ-10柱试剂盒纯化PCR产物。结果接种病毒的vero细胞出现病变,病变为“”,收集细胞,反复冻融3次,使细胞裂解,获得大量HSV-2。经PCR扩增获得641bp大小的目的基因片段。电泳显示片断大小符合。结论获得的ICP10启动子基因,经过测序正确后,可以和其他基因连接,用于进一步研究。     

流行性出血热病毒在原代地鼠肾单层细胞上的增殖

流行性出血热病毒(EHFV)通常采用非洲绿猴肾传代细胞(Vero-E_6细胞系)或人肺癌的Ⅱ型肺泡上皮细胞的传代细胞(A_(549)细胞系)增殖,但二者均为传代细胞。且A_(549)细胞乃来源于人的肿瘤组织,不宜用来制备疫苗。我们试将EHFV培养于原代地鼠肾单层细胞,获得了成功。 将EHFV76-118株的10％乳鼠脑悬液,按营养液1/10量接种于已长成单层的地鼠肾细胞,37℃吸附2h后,奔去接种浓,加含2％小牛血清的含糖Hank's液为维持液,置37℃温箱中孵育。从第3d开始,每天用直接荧光染色法观察细胞片,持续至接种后第13d,每次检查均能在细胞浆中观察到特异性EHFV抗原。     

HSV-1载体对体外培养神经元感染作用的研究

目的利用重组有lacZ基因的HSV-1假型病毒载体感染体外培养的人胚神经元,(以β-gal组织化学染色来检测报告基因lacZ在神经元中的表达),并观察该载体的细胞毒性及病毒的水平传播情况。方法用重组有lacZ基因的HSV-1扩增子质粒pHSVlac包装成复制缺陷的假型病毒载体,并在Vero细胞中传代增殖,产生高滴度的病毒载体,用其感染体外原代培养的神经元,以β-gal染色观察报告基因lacZ在神经元中的表达及该载体的细胞毒性。结果pHSVlac质粒与HSV-1 17 ts K可在Vero细胞中包装成复制缺陷的HSV-1假型病毒载体,经传代其滴度可达1×108PFU/mL。该载体在37℃时能感染体外原代培养的人胚神经元,并在其中表达LacZ基因,未发现细胞毒性改变。结论HSV-1载体能够高效靶向地将外源基因导入非分裂的神经元,HSV-1载体介导的基因转移系统的建立为进一步开展神经机能及神经系统疾病的基因治疗的研究奠定了基础。     

槲寄生、桂枝对急性出血性结膜炎病毒的抑制试验

由肠道病毒第70型引起急性出血性结膜炎的治疗药物问题,以往在临床观察和实验室药物筛选中均未获得满意结果。木文报道取100TCTD50/0.1毫升病毒与不同浓度的各种药物等量混和,置37℃1小时,然后接种于传代的人胚肺细胞,观察药物对细胞病变的抑制情况。用此方法对50多种抗病毒的化合物及中草药进行了筛选。实验结果,槲寄生的提取物(由上海医药工业研究院提供)和桂枝(由本所提供)两种中药分别对本病毒有一定的抑制作用。提取物的最小抑制浓度为0.156～0.313毫克(相当于槲寄生生药31.2～62.5毫克):桂枝的最小抑制浓度以生药含量计50毫克。另外,我们进一步用不同浓度的槲寄生提取物药液,将之先加入细胞管,2小时或24小时后再接种病毒,或先接种病毒于细胞管2小时后再加入含不同浓度药液的维持液等实验方法,三者均取得相同的抑制效果。但是如将经1小时处理的病毒药物混合液接种细胞管后2小时     

田基黄水煎剂对Ⅱ型单纯疱疹病毒复制的抑制作用

作者在细胞培养中发现田基黄对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)的复制有明显的抑制作用。它对 Vero-E6细胞的无毒浓度为7.5mg/ml(即相当于每毫升7.5mg 生药),最小有效抑制 HSV-2复制的浓度为2.5mg/ml。抑制指数[即病毒时照的滴度(对数)减去药物处理过的病毒滴度(对数)]为3.25,抑制明显。有效浓度的田基黄(2.5mg/ml)在细胞外对 HSV-2无直接灭活作用。HSV-2在复制周期中的早期即病毒的吸附或穿入阶段对田基黄敏感。此药在2.5mg/ml 的浓度下,抗 HSV-2的作用不亚于环胞苷(5ug/ml)或疱疹净(100ug/ml).因此,提出了用此药预防宫颈癌或与无环乌苷合用治疗HSV-2感染的可能性。     

真菌提取物JN219抗病毒谱的初步研究

目的：探讨真菌提取物JN219的体外抗病毒谱。方法：采用体外细胞病变法，研究JN219对疱疹病毒科病毒（HCMV、HSV-1、HSV-2）、腺病毒科病毒（Ad3）、副粘病毒科病毒（RSV）、呼肠病毒科病毒（RV SA11）、正粘病毒科病毒（流感甲地方株、流感乙地方株）、小RNA病毒科病毒（COX B1-6）、弹状病毒科病毒（VSV）共15株病毒的抗病毒活性。将JN219与以上病毒作用1h后接种于相应宿主细胞（同时设有病毒对照和细胞对照），当病毒对照病变达到90％以上时终止培养，宿主细胞用1％中性红染色，在450nm处读取吸光度A值，计算细胞存活率、半数中毒浓度（TD₅₀）、半数有效浓度（IC₅₀）和抑毒指数（TI）。并根据TI判断JN219的抗病毒活性，确定其抗病毒谱。结果：JN219对HCMV、RV（SA11）、VSV有抑制作用，其IC50分别为1.42、0.96和1.22μg/ml，TI分别为35.26、52.30、40.82；对HSV-1、HSV-2、RSV、流感病毒甲、流感病毒乙有部分抑制作用；对COX B1-6、腺病毒（Ad3）无作用。结论：JN219抗病毒谱比较广泛。     

仙台病毒高滴度病毒制备方法的建立

目的：建立使用传代细胞稳定大量地制备高滴度的仙台病毒（SeV）的方法,取代成本高、周期长、操作繁琐、易污染的鸡胚制备仙台病毒的方法,用于实验研究。方法：首先观测不同细胞感染仙台病毒后发生病变的时间、程度以及产毒量,确定仙台病毒敏感细胞株并确定病毒产量高峰期,连续在细胞中传3代测量上述指标。其次观测染毒时病毒吸附时间不同对病毒滴度的影响。综合分析后建立制备高滴度仙台病毒的方法。结果：大鼠脑胶质瘤细胞C6株对仙台病毒高度敏感,细胞出现病变所需时间短且明显,病毒产量最高。仙台病毒滴度与染毒时的吸附时间呈正相关,病毒最佳吸附时间为90min。接种病毒后72h收获的病毒滴度最高,平均为11 TCID50,并且病毒可以在细胞内连续稳定传代。结论：确认大鼠脑胶质瘤细胞C6株为仙台病毒的敏感细胞。且病变快、明显,病毒产量高。为在体外深入研究仙台病毒和大量繁殖高滴度仙台病毒提供了实验方法。