首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到20条相似文献,搜索用时 15 毫秒
1.
目的:获得重组FAS抗原,用于抗体制备及进一步的功能分析。方法:用PCR技术从完整的FAScDNA克隆上扩增其编码胞外区的部分,将PCR产物直接克隆到pGEM-T载体系统,DNA序列分析证实序列完全正确;用EcoRⅠ和SalⅠ将FAS胞外区片段切出,定向克隆到经同样酶切处理的pGEX-KG表达载体,转化大肠杆菌,经优化IPTG的诱导条件,获得了FAS胞外区与谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白高效表达;用亲合层析法从细菌粗提物中纯化了GST-FAS融合蛋白,免疫家兔制备了抗FAS抗体。结果:用重组FAS为免疫原制备的抗体能诱导U937细胞产生细胞凋亡。结论:重组FAS抗原和制备的抗体能用于对FAS系统的功能研究  相似文献   

2.
未知cDNA扩增与亚克隆的方法学研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
新型蛋白质的分子克隆基本依靠cDNA文库的筛选,而文库构建的载体多为λgtll。由于λgtllDNA分子量较大(49kb),提取过程中多用PEG,因此λgtllcDNA克隆及其直接序列测定极为困难。为克服此困难,作者自行设计了不含克隆位点的一对公用λgtllPCR引物。试用表明,此引物通过改变PCR反应条件,可特异性地扩增多种彼此独立的cDNA。经亚克隆后的序列测定表明,用此方法扩增克隆的多种cDNA保留了原有阅读框架和polyA特有序列,因而基本解决了新型蛋白质分子克隆中cDNA亚克隆与序列测定的困难.  相似文献   

3.
HLA—DR基因的克隆及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
获得表达HLA-DR基因的小鼠墨色素瘤细胞,方法应用RT-PCR技术从人B淋巴瘤细胞Raji中克隆了HLA-DR3α和β链cDNA,并经测序证实。将其分别插入至真核表达载体pLXSN和pCEP4中,用脂质体转上鼠黑色素瘤细胞B16,然后用G418和Hyg双重筛选。  相似文献   

4.
李贤慧  石育原 《武警医学》1996,7(4):187-189
用T4-DNA连接酶在限制性内切酶SmaI存在下,将神经生长因子cDNA片断克隆到具有双向转录启动子的载体质粒pGEM3Zf(+)中。Sanger双脱氧链终止法测定其核苷酸顺序表明,所克隆的NGFcDNA片断,长363bp,包含了成熟神经生长因子的全部编码。该重组质粒可分别用于制备NGFcDNA探针和RNA探针,是研究NGF基因结构及表达调控等方面的重要工具。  相似文献   

5.
目的:人血小板生成素(TPO)在大肠杆菌中的高效表达。方法:利用PCR技术,扩增出了(1-174个氨基酸的)人血小板生成素cDNA,并将其克隆到pGEX-1λT载体中,构建了融合蛋白表达质粒。重组子用限制性内切酶酶切鉴定。表达产物SDS-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果:限制性内切酶酶切鉴定表明重组子含有正确的(1-174氨基酸)TPOcDNA片段;表达产物经SDS-PAGE相对分子质量  相似文献   

6.
目的:分离编码人hIL-15的cDNA并大肠杆菌中克隆与表达,方法:采用PHA刺激人外周血白细胞提取mRNA,并利用RT-PCR方法获得hIL-15的cDNA将其定向插入PUC19载体中,DNA序列分析表明分离的hIL-15的序列与文献报道一致,以pBV220为表达载体构建并筛选出重组于pBVhIL-15;重组子转化E.coliDH5α菌株,经42℃诱导表达。结果:相对分子质量为14000的hIL  相似文献   

7.
rG-CSF受体CRH的基因克隆及在原核中的高效表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:研究受体与配体作用机制以及粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)结合肽类似物的筛选,表达rG-CSFR胞外CRH区。方法:利用逆转录-聚合酶锭反应(RT-PCR)技术从小鼠白血病细胞(NFS-60)扩增出rG-CSFR胞外CRH区的cDNA片段,通过基因重组将该片段克隆于谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达载体pGEX-1λT中。结果与结论:克隆片段与文献报道的rG-CSFR序列完全一致,连续产物转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导可获得大量稳定表达的CRH-GST融合蛋白。  相似文献   

8.
采用异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法从孵育至12天的鸡胚视叶顶盖中提取RNA。choepfer报道的序列设计引物,引物的5端添加EcoRI和XbaI酶切位点。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)得到1.48kb长的CDNA片段,用EcoRI和XbaI酶切CDNA后插入质粒PUC19。测序采用Sanger双氧终止法,结果与文献报道一致。将β基因克隆入PBV220原核表达载体中,宿主菌经42℃诱导,经SD  相似文献   

9.
利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的人源单链可变区抗体(ScFv)的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109中表达可溶性的HCV-core-ScFv。以重组的HCV核心蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选到含有HCV-core-ScFv基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经NcoⅠ/Not Ⅰ酶切鉴定,该ScFv基因由750bp组成。将其亚克隆到pCANTAB5E表达载体中,转化大肠杆菌JM109,提取质粒进行DNA序列测定,符合ScFv的重链可变区和轻链可变区基因结构特点。IPTG诱导转化的大肠杆菌JM109,在其培养上清中获得了可溶性HCV-core-ScFv的表达。酶联免疫吸附法(ELISA)证实表达的HCV-core-ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PA  相似文献   

10.
利用T-载体克隆法完成了含信号肽及前导肽的人脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)全长基因PCR产物的克隆。序列测定结果表明,所克隆的人BDNF基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG的774bp中,除下游端PCR引物因为采用猪的PCR引物而有一个碱基改变外,其它序列与国外文献报道序列完全一致。该碱基改变不影响氨基酸序列  相似文献   

11.
目的:克隆编码人CD40分子基因的全长cDNA,在COS-7细胞中获得高表达。方法:提取人B淋巴细胞看Daudi总RNA,以RT-PCR技术克隆了编码人CD40基因全长cDNA,序列测定证实其正确性。将测序正确的CD40基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1构建重组表达载体。采用脂质体转染试剂脂染胺(Lipofectamine)杂COS-7细胞,用流式细胞仪,免疫细胞化学和免疫荧光法检测CD40基  相似文献   

12.
作者在建立检测庚型肝炎病毒酶免疫和PCR技术的基础上,将抗-HCV上阳性病人血清经逆转录-巢式PCR分离部分HGVcDNA片段,用与HGV基因互补的特异寡核苷酸引物进行双脱氧核苷酸链末端终止法-PCR直接测序。结果表明,中国大陆HG-302Ⅰ株部分cDNA序列与Linnen等报道的HGB美国株cDNA序列有极高的同源性。  相似文献   

13.
采用热酚法从登革2 型病毒43 株(D2 43) 感染的C6/36 细胞中提取了病毒RNA,以病毒RNA 为模板,进行D2 43 株NS3 基因cDNA 片段的反转录 PCR 扩增,片段长度为1176 bp。将扩增的cDNA 片段克隆到T 载体pBluescript ksⅡ( + ) 中。通过双脱氧法测定了cDNA片段序列,与国际标准株NGC株序列一致。  相似文献   

14.
为观察PCNA基因反义RNA表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制效应,用DNA重组法将人PCNA基因反向克隆到真核细胞表达质粒pDOR-neo中,构建成PCNA基因真核表达质粒pDR-PCNA,用Lipofect AMIN^TM介导转梁人胃癌细胞系SGC-7901,并接种于裸鼠背部皮下。经G418筛选获得的转染细胞系SGC/PCNA与亲本细胞相比,其生长速度减慢,RNA、蛋白质生物合成受到抑制,S期、  相似文献   

15.
抗结肠癌抗体重链可变区和k轻链基因的克隆   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的:从一株抗结肠癌细胞系LS174T的单抗细胞株CL-4中克隆出抗结肠癌抗体重链可变区和k轻链基因,方法:用一步法提取总RNA,逆转录形成cDNA,设计并合成一套扩增小鼠抗体重链可变区和完整k轻链的通用引物,通过PCR扩增基因,分别克隆入pUC19,作核苷酸序列分析,结果:用重链引物扩增获得长的360bp的片段,用轻链引物扩增获约640bp的片段,序列测定获得它们的DNA序列,结论:克隆的重链可  相似文献   

16.
本研究通过反转录PCR得到人GM-CSF基因片段后,通过重组插入pBV220载体质粒的EcoRⅠ、BamHⅠ之间,构建了重组表达质粒phGM91。借助计算机分析,优化了构建质粒的转译起始区,采取定点诱变以消除SD序列和ATG区的强二级结构,提高了表达水平。将GM-CSF基因进行序列测定,与文献报导完全一致,所对应的氨基酸序列与天然氨基酸序列一致。将带有表达质粒phGM91的DH5α菌在42℃诱导,表达了预期的15KD的蛋白,约占菌体总蛋白的20%,并探讨了不同菌株对表达水平的影响。用MTT法测定所表达的GM-CSF生物活性,比活性可达到1×10~7IU/mg,表明所表达的GM-CSF具有生物学作用。  相似文献   

17.
葡激酶基因的分离及其在大肠杆菌中的高效表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
分离葡激酶基因并使其在E.coli中高效表达。方法:利用PCR技术自溶源性金黄色葡萄球菌FR610株的染色体DNA中分离葡激酶编码序,DNA序列分析后,组入高效表害载体pBV220中,转化至大肠杆菌。  相似文献   

18.
为观察PCNA基因反义RNA表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制效应,用DNA重组法将人PC-NA基因反向克隆到真核细胞表达质粒pDOR-neo中,构建成PCNA基因真核表达质粒pDR-PCNA,用LipofectAMINTM介导转染人胃癌细胞系SGC-7901,并接种于裸鼠背部皮下。经G418筛选获得的转染细胞系SGC/PCNA与亲本细胞相比,其生长速度减慢,RNA、蛋白质生物合成受到抑制,S期、G2/M期DNA含量降低,移植瘤生长速度减慢,瘤体平均直径(0.54±0.13)cm,明显小于对照组(1.51±0.11)cm。结果表明,PCNA基因反义RNA表达质粒对胃癌裸鼠移植瘤生长具有明显的抑制作用。  相似文献   

19.
应用改进的锚定反转录PCR(anchoredRT-PCR)法,在总RNA的3′端“加尾”,Oligotex提纯poly(A)+mRNA,Oligod(T)-anchor引物合成第1链cDNA,anchor引物及特异引物进行“半巢式”PCR,从献血员血清中扩增出HGV3′末端基因片段。序列分析结果表明:此中国株HGV3′末端基因序列与美国株存在较大差异,但阅读框架相似。用此方法克隆单链RNA病毒基因组的3′末端。由于许多动物病毒和90%以上的植物病毒均为单链RNA基因组,故该技术也可应用于其它病毒基因组未知末端的基因克隆。  相似文献   

20.
从pUC18/E-选择素重组质粒经PCR扩增得到可溶性E-选择素cDNA基因,将此基础插入到痘苗病毒表达载体pJSA1175的Sma I位点,构建了正向表达质粒pJSA1175.可溶性E-选择素,采用脂质供共转染的方法,将上述质粒转染TK^-143细胞。  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号