siRNA-ILK慢病毒载体的构建

目的构建RNA干扰整合素连接激酶(ILK)基因的慢病毒载体并转染胰腺癌细胞(Panc-1),并验证其干扰有效性。方法对胰腺癌Panc-1细胞进行细胞培养,成功构建ILK-specific sh RNA慢病毒载体后对Panc-1细胞进行转染,荧光显微镜下观察,评估转染效率,然后通过Real time-PCR及Western Blot方法验证干扰基因片段的有效性。结果成功构建si RNA-ILK慢病毒载体并转染Panc-1细胞,荧光显微镜下观察可见转染效率达80%以上,RNAi靶点病毒转染的细胞组(KD)的ILK m RNA及蛋白表达明显低于空蛋白组(NC)及正常细胞组(CON,0.01)。结论成功构建RNA干扰ILK基因的慢病毒载体并转染胰腺癌细胞(Panc-1),验证了RNA干扰片段的有效性。     

PRIM1干扰慢病毒载体构建

目的构建PRIM1基因的干扰慢病毒载体,供后续深入研究PRIM1基因在肿瘤形成中的机制。方法以PRIM1基因为模板,按照RNA序列设计原则,完成RNA干扰靶点设计后,构建RPIM1基因RNA干扰慢病毒成含干扰序列的单链DNA oligo,退火配对产生双链DNA;随后通过其两端酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体;将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定阳性重组子,送测序验证,对测序结果比对正确的克隆进行质粒抽提。结果对RNA序列设计软件评估后选取的干扰靶点序列,经过退火配对得到具有带黏性末端的双链的DNA; Age I和EcoRI双酶切使GV115载体线性化;双链DNA oligo与线性化的载体连接的产物经PCR扩增后的序列与目标序列完全一致,获得测序结果正确的阳性克隆质粒。结论以PRIM1基因为模板,按照载体设计构建常规方法成功构建PRIM1干扰慢病毒载体。     

乙型肝炎病毒核心蛋白小干扰RNA载体的构建与验证

目的 构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,并验证其干扰效果.方法 设计针对HBV基因组（ayw亚型）HBc基因的小干扰RNA序列（位于2147 bp ～2165 bp序列）,目的片段与载体成功连接后转入大肠埃希菌DH5α,酶切及测序验证其正确性.最后以脂质体转入HepG2.2.15细胞中,检测其干扰效果.结果 成功构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,并命名为pshRNA-HBc..酶切及测序验证正确,pshRNA-HBc对HepG2.2.15细胞中HBc表达具有特异性干扰效果.结论 构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,为后续研究HBc的生物学功能奠定良好基础.     

小干扰RNA的设计及原理

RNA干扰技术在人类基因功能研究、药物靶点鉴定等方面备受青睐,并且具有潜在的临床应用价值。但只有设计合理的小干扰RNA (siRNA)才能高效、特异地抑制靶基因表达。本文总结了siRNA序列的一般特点以及设计siRNA的方法和相应原理,并介绍了如何利用实验手段,验证RNA干扰的有效性及特异性。从而促进RNA干扰技术的广泛开展。     

犬转铁蛋白受体基因的沉默及稳定感染细胞系的建立

目的通过构建沉默犬转铁蛋白受体(TfR)基因慢病毒载体并感染Walter Reed犬(WRD)细胞,建立稳定感染沉默犬TfR基因的细胞系。方法构建2条针对犬TfR基因的特异性短发夹RNA(shRNA),用慢病毒载体转染HEK293T细胞,包装、收集病毒并测定其滴度。用包装好的慢病毒感染WRD细胞,用实时荧光定量PCR和Western blot法检测TfR的mRNA和蛋白的表达水平以评价干扰效率,筛选沉默效果较好的靶点,并建立稳定沉默TfR基因的WRD/TfR-细胞系。结果成功构建出TfR小干涉RNA慢病毒载体,成功包装2种不同靶点的沉默TfR基因的RNA干扰慢病毒,测定其病毒滴度均达到1×108转导单位(TU)/m L。选用沉默效果较好的p GMLV-TfR A2载体,建立TfR小干涉RNA慢病毒载体稳定感染的WRD/TfR-细胞系。结论成功构建TfR小干涉RNA慢病毒载体并建立了稳定感染WRD/TfR-细胞系。     

附睾血管内皮生长因子基因慢病毒干扰载体的构建

目的：以血管内皮生长因子（VEGF）的mRNA 为靶点,设计、构建VEGF 的RNA干扰慢病毒载体,并 对其在大鼠附睾的沉默效果进行验证。 方法：构建3 种附睾VEGF-shRNA 慢病毒表达载体VEGF-shRNA-1、 VEGF-shRNA-2、VEGF-shRNA-3, 提取3 种阳性克隆质粒测序, 转染HEK293-T 细胞后产生慢病毒质粒。大鼠随 机分为空白对照组、NC-shRNA 阴性感染组、VEGF-shRNA-1 感染组、VEGF-shRNA-2 感染组、VEGF-shRNA-3 感染组,将病毒液分别注射到各组大鼠双侧附睾;实时荧光定量 PCR及蛋白免疫印迹检测各组大鼠附睾VEGF 的mRNA 及蛋白沉默效果。结果： 测序结果证明3 种慢病毒载体被包装成功。感染大鼠附睾后,VEGF 感染组 mRNA 及蛋白表达量均较阴性感染组和空白对照组明显降低,其中以VEGF-shRNA-3 感染组干扰效果更为有效。 结论：成功设计了VEGF 基因的RNA干扰靶点和制备了VEGF 基因的慢病毒载体,VEGF-shRNA-3 能有效抑制 附睾VEGF 的表达。     

慢病毒介导的RNA干扰技术应用于抑制黑色素瘤细胞转移的特异性研究

目的 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,对该技术能特异性的抑制黑色素瘤细胞转移进行研究.方法 以人巢蛋白(Human nestin)的信使RNA编码序列作为干扰靶点,把慢病毒基因PLL3.7作为质粒载体,人巢蛋白的“短发夹”RNA(shRNA)表达质粒和阴性对照shRNA表达质粒(不包含所有已知信使RNA),分别感染黑色素瘤细胞株UACC903细胞并流式分选获得高纯度的巢蛋白干扰或对照组细胞.用划痕法检测评估各组黑色素瘤细胞迁移能力.结果 巢蛋白下调的UACC903细胞侵袭能力和迁移能力均下降(P＜0.05).结论 慢病毒介导的RNA能有效地沉默巢蛋白基因的表达,从而能特异性的抑制黑色素瘤细胞迁移.     

小鼠水通道蛋白1基因shRNA慢病毒载体构建与鉴定

目的 应用RNA干扰技术,构建小鼠水通道蛋白1(AQP1)基因重组慢病毒载体并鉴定.方法 对小鼠AQP1 mRNA分析,设计合成的单链引物经退火形成双链寡核苷酸序列,连接入经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切线性化的pLKO.1-TRC慢病毒质粒载体中,菌液PCR鉴定并经测序验证.测序正确后与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞,收集病毒上清经高速离心浓缩后感染小鼠小胶质细胞BV-2,Western blot法分析筛选有效shRNA序列.结果 成功退火合成3对发夹shRNA序列并将其克隆到pLKO.1-TRC载体中,构建重组质粒pLKO-AQP1-SH1、2、3,经菌液PCR鉴定和测序验证载体构建成功.Real-time PCR检测发现重组质粒pLKO-AQP1-SH2感染BV-2细胞后AQP1 mRNA表达最低,Western blot结果进一步验证结果的准确性.结论 成功构建出AQP1基因shRNA慢病毒载体.     

小RNA干扰骨桥蛋白抑制人U251细胞的体外生长与侵袭

目的:研究慢病毒载体介导的骨桥蛋白(OPN) RNA干扰对人U251神经胶质瘤细胞体外生长和侵袭的影响,并探讨其对神经胶质瘤生长、侵袭的可能机制.方法:应用本实验室已构建并鉴定的OPN特异性短发卡RNA慢病毒表达载体(LV-OPN shRNA)感染U251神经胶质瘤细胞.RT-PCR检测干扰前、后U251细胞OPN mRNA的表达;免疫印迹法检测干扰前、后U251细胞OPN、MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达;MTT法检测细胞增殖能力的变化;Transwell体外侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化;细胞划痕实验观察细胞迁移能力的变化.结果:与未感染组、空载体感染组相比,LV-OPN shRNA感染组OPN mRNA、OPN蛋白及MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达均明显下降;LV-OPN shRNA感染组细胞增殖、侵袭能力及迁移能力也明显下降.结论:慢病毒载体介导的骨桥蛋白RNA干扰在体外能抑制U251细胞OPN mRNA和蛋白表达, 进而抑制U251细胞在体外的生长及侵袭,因此可以推测OPN是促进胶质瘤增殖和侵袭的基因之一,为胶质瘤的治疗提供新的靶点.     

针对HO-2基因的四种RNA干扰序列构建和效应观察

目的:构建和筛选出血红素氧合酶-2(HO-2)基因的RNA干扰载体,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况。方法:根据小鼠HO-2基因的c DNA序列设计了4个HO-2基因干扰序列,克隆到干扰载体p GPU6-GFP-Neo上,利用电穿孔法将干扰载体对小鼠脑血管内皮细胞进行转染。Real-time PCR和Western Blot检测小鼠脑血管内皮细胞中HO-2的表达。结果:干扰载体显著抑制小鼠脑血管内皮细胞中HO-2的表达,其中干扰载体p GPU6-GFP-Neo-HO-2-mus-768对HO-2 mRNA的表达抑制达显著水平(P0.01),蛋白的表达抑制达显著水平(P0.05)。结论:成功构建并筛选了HO-2表达干扰载体,为下一步的HO-2基因的功能鉴定奠定了基础。     

靶向TPX2基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建靶向TPX2基因的RNA干扰慢病毒载体,获得稳定感染的人宫颈癌He La细胞株,为宫颈癌细胞TPX2基因的相关研究奠定基础。方法以TPX2基因为靶点,设计并合成四组对应于目标shRNA的双链DNA发卡结构,分别与慢病毒载体Pglv2-U6-Puro连接经转化感受态细胞,阳性克隆经测序、病毒包装、滴度测定、感染细胞、嘌呤霉素筛选得到TPX2基因沉默稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot检测TPX2 mRNA和蛋白的沉默效果。流式细胞计量术检测其对细胞周期分布及凋亡的影响。结果测序结果证实5种慢病毒载体均包装成功,采用0.4μg/m L嘌呤霉素成功筛选出TPX2沉默细胞株。He La细胞感染4种载有TPX2-shRNA的重组慢病毒后,均发挥了沉默效应,尤以TPX2-shRNA-1沉默效果最佳,TPX2 mRNA相对表达量为0.21±0.07,低于对照组的1.08±0.07(P0.01);TPX2蛋白质相对表达量为0.19±0.28,低于对照组的0.64±0.03(P0.01);G2及S期细胞高于对照组(P0.05);细胞凋亡率明显多于对照组(P0.05)。结论获得了一种有效TPX2基因的干扰序列,成功构建了TPX2 shRNA慢病毒干扰载体,并筛选出TPX2基因沉默的He La细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

大鼠VGLUT2基因shRNA慢病毒载体转染原代培养脊髓神经元对VGLUT2表达的影响

目的:探讨新构建的可以表达针对2型囊泡膜谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporter 2,VGLUT2)短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)的慢病毒载体能否有效地感染大鼠脊髓原代培养神经元,并鉴定其对培养神经元内VGLUT2基因的特异性干扰效果,从而为进一步在整体动物脊髓水平研究VGLUT2的功能提供有力的工具。方法:首先分别将已筛选到的两对互补并靶向作用于编码大鼠VGLUT2序列两个位点的特异性shRNA序列和一个阴性对照的寡核苷酸,克隆到pGCSIL-GFP质粒(经Age I和EcoRI双酶切)载体内,经酶切、测序鉴定及转染293T细胞,包装得到病毒颗粒。然后将筛选出的慢病毒感染体外分离、培养的胚胎大鼠脊髓神经元,将培养的原代神经元分为正常组、阴性对照组、VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组,在荧光显微镜下分别观察GFP的表达情况;同时运用Westernt blot检测各组VGLUT2蛋白的表达水平。结果:免疫荧光检测显示,阴性对照组、VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组脊髓原代培养神经元均能观察到明显的GFP荧光,表明这些神经元已被慢病毒载体高效转染;但VGLUT2 shRNA-1组和VGLUT2 shRNA-2组神经元VGLUT2的表达量明显低于正常组和阴性对照组。Western blot结果显示,VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组的VGLUT2蛋白的表达量与正常组和阴性对照组相比明显有所下降,分别占正常组的62.42±1.12%和66.07±1.33%(P<0.05),但VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组之间无显著性差异(P>0.05);阴性对照组与正常组相比亦无明显差异(P>0.05)。结论:VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组重组慢病毒载体均能有效地感染原代培养脊髓神经元,并高效下调其神经元内目的基因VGLUT2的表达。     

Optimized protocol for high-titer lentivirus production and transduction of primary fibroblasts

The lentivirus–short hairpin RNA (shRNA) system is a widely used tool for RNA interference. Multiple factors may affect the RNA interference efficiency during lentivirus production and transduction procedures. Thus, an optimized protocol is required to achieve high-titer lentivirus and efficient gene delivery. In the present study, lentivirus was produced by transfecting lentiviral transfer and packaging plasmids into HEK 293T cells. The factors affecting lentiviral titer were assessed, including lentiviral plasmid ratio, lentiviral transfer plasmid type, serum type for cell culture, transfection reagent–plasmid mixture incubation time, and the inoculation density of 293T cells for transfection. The high-titer lentivirus was achieved when plasmids were transfected at a molar ratio of 1:1:1:2, and the transfection reagent–plasmid mixture was replaced 6–8 h after transfection. The pLVX-shRNA2 lentiviral transfer plasmid was associated with the highest lentiviral titer, while both pLVX-shRNA2 and psi-LVRU6GP plasmids were associated with efficient RNA interference in target cells. The serum type for 293T cell culture affected the lentiviral titer significantly, while the inoculation density of 293T cells showed no influence on transfection efficiency or lentiviral titer. Moreover, the human primary fibroblasts infected with lentivirus, using the centrifugation method, achieved higher transduction efficiency than those infected with the non-centrifugation method. In conclusion, this study helped optimize lentiviral production and transduction procedures for more efficient gene delivery.     

沉默附睾P34H基因对小鼠精子P34H表达和精子透明质酸酶活性的影响

目的:通过慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)敲低P34H表达,分析其对小鼠精子P34H表达和精子透明质酸酶(HYD)活性的影响。方法:构建3种附睾精子P34H shRNA慢病毒表达载体GV-P34H-sh RNA-1、GVP34H-sh RNA-2和GV-P34H-sh RNA-3,提取阳性克隆质粒测序,转染HEK293T细胞,生产慢病毒颗粒。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别注入小鼠附睾中,用real-time PCR和Western blot法分别检测其对P34H m RNA和蛋白的沉默效果。采用免疫荧光法观察P34H蛋白在小鼠精子上的定位,改良透明质酸钠-明胶底物膜法检测小鼠精子HYD活性(HYD阳性反应率和HYD活性强度)。结果:测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功。感染小鼠附睾后,P34H的mRNA及蛋白表达量均较阴性感染组和正常对照组明显降低(P0.05);其中以GV-P34H-sh RNA-1作用最为显著,精子P34H阳性表达率和HYD活性均较阴性感染组和正常对照组明显降低(P0.05),而阴性感染组和正常对照组相比差异无统计学显著性。结论:附睾P34H基因沉默可抑制小鼠附睾中精子P34H阳性表达率和HYD活性。     

大鼠ZnT1基因siRNA慢病毒载体构建及筛选

目的:构建并筛选针对SD大鼠锌离子转运体1(ZnT1)的siRNA慢病毒载体。并检测其在大鼠神经元中的作用。方法:设计并合成针对ZnT1基因的3条(A,B,C)siRNA序列与1条阴性对照序列,将以上序列退火与pFU-GW-iRNA质粒相连接,通过测序鉴定后,分别与慢病毒包装质粒共感染293T细胞,检测收获病毒滴度后感染体外培养的SD大鼠脑皮层神经细胞,设置感染复数(MOI)分别为1,3,6,8,于转染后72 h计算转染效率。在最佳MOI值下,设置未经病毒感染组(CON组)、阴性对照病毒感染组(NC组)和慢病毒阳性干扰组(ZnT1-siR-NA-A组,ZnT1-siRNA-B组,ZnT1-siRNA-C组),72 h后利用Western blot技术检测ZnT1的表达情况,确定对ZnT1蛋白的最有效的干扰序列与抑制效率。结果:测序证实目的干扰序列已被准确克隆到pFU-GW-iRNA质粒,收获的慢病毒颗粒滴度为8×108TU/ml,其在MOI=6时对神经细胞的转染效率最高(93%),并保持神经细胞良好的生存状态。转染后ZnT1的表达被不同程度的抑制,A,B,C三种干扰序列对ZnT1的抑制率分别为47.74%±1.40%,81.19%±1.36%,94.10%±2.41%。结论:成功构建了ZnT1-siRNA慢病毒载体,其在MOI=6时对神经细胞具有最佳的转染效率,并有效沉默神经细胞中ZnT1蛋白的表达。     

慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达

目的研究慢病毒介导的RNA干扰对PC12细胞的转染效率和对MyD88基因的抑制效率。方法构建针对大鼠MyD88基因3个靶点的ShRNA慢病毒载体,PC12细胞按照不同的转染条件分为正常组(DMEM完全培养液)、DMEM加入polybrene组、EN.iS(Enhance infection solution)组、EN.iS加入polybrene组。荧光显微镜下观察不同组的转染效率,采用Real-timePCR和Western blot检测不同的靶点对MyD88的不同沉默效率。结果病8毒滴度为1×10TU/ml,MOI为100时,PC12细胞在EN.iS组的转染效率最高,转染试剂polybrene对转染效率无明显影响,沉默效率最高的靶点是5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'。结论慢病毒介导的RNA干扰是一种高效的基因沉默手段,可以对PC12细胞中MyD88的功能进行长期的研究。     

携带甲胎蛋白基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对靶基因的沉默效率

目的构建携带甲胎蛋白（AFP）基因小干扰RNA（siRNA）的慢病毒载体并转染肝癌细胞,评价其对AFP基因的沉默效率。方法设计和构建针对AFP基因的阳性siRNA及不针对任何已知基因的阴性siRNA,将其分别插入携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组慢病毒载体,然后转染到表达AFP基因的人肝癌细胞HepG2并筛选阳性表达细胞株,分别为慢病毒转染阳性siRNA组和慢病毒转染阴性siRNA组。同时设立脂质体转染阳性siRNA组、脂质体转染阴性siRNA组以及加AFPsiRNA而未用转染试剂的siRNA组、空白对照组。荧光显微镜观察评估转染效率,荧光定量PCR和免疫印迹法检测各组HepG2细胞APFmRNA及蛋白的相对表达量,比较不同转染方法对AFP基因表达的抑制率。结果慢病毒能够有效地转染siRNA到HepG2细胞内。荧光定量PCR显示慢病毒转染siRNA对AFPmRNA表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（92．1％比74．3％,P〈0．05）。免疫印迹亦显示慢病毒转染siRNA对AFP蛋白表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（88．2％比63．7％,P〈0．05）。结论慢病毒转染AFPsiRNA能够更有效地抑制HepG2细胞内AFP基因表达。     

沉默膜联蛋白A1基因影响兔骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化能力*☆

背景：膜联蛋白A1蛋白参与细胞的增殖和分化的调控。激素性股骨头坏死与骨髓间充质干细胞增殖和分化能力的改变相关。 目的：观察沉默膜联蛋白A1基因对兔骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力的影响。 方法：将新西兰大白兔的骨髓间充质干细胞分离培养后分为RNA干扰组,用携带针对膜联蛋白A1基因的短发夹RNA慢病毒载体LV-shANXA1感染骨髓间充质干细胞下调膜联蛋白A1基因的表达;阴性对照组,用携带无义基因序列的慢病毒载体LV-shANXA1-NC感染骨髓间充质干细胞;空白对照组,不加任何干预措施。 结果与结论：纯化后的骨髓间充质干细胞CD44和CD105表达阳性率分别为97.2%和95.8%,而CD45阳性率为2.5%。经嘌呤霉素筛选后,感染复数为50时,LV-shANXA1对骨髓间充质干细胞感染效率为80%;感染复数为100时,感染效率为95%。实时 PCR 和Western blot检测显示感染复数为50时,LV-shANXA1对膜联蛋白A1基因的沉默效率效率可达72.4%以上。膜联蛋白A1表达下调后,骨髓间充质干细胞出现明显生长抑制,在随后成骨分化诱导后,细胞的碱性磷酸酶染色阳性率和碱性磷酸酶活性明显降低,且茜素红染色呈阴性反应。表明沉默膜联蛋白A1基因降低骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力,这可能是激素性股骨头坏死发病机制之一。关键词：膜联蛋白A1;基因沉默;骨髓间充质干细胞;成骨分化;细胞增殖;激素性股骨头缺血性坏死 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.19.001