超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死的在体磁敏感加权成像研究

目的 超顺磁性氧化铁(SPIO)体外标记骨髓间充质干细胞(BMSC)移植治疗大鼠脑梗死,使用磁敏感加权成像(SWI)监测BMSC在脑内的分布与迁移.方法 原代培养大鼠BMSC,SPIO体外标记第3代BMSC,倒置显微镜及普鲁士蓝染色观察.改良Longa法制作大鼠左侧脑梗死模型,缺血对侧顶叶脑皮层移植SPIO标记的BMSC.分别在移植后1d、1周、2周和4周进行SWI序列MRI动态观察,移植后4周脑组织普鲁士蓝染色观察.结果 移植后1d、1周、2周和4周SWI序列MRI检测均可显示缺血对侧半球移植的SPIO标记BMSC所致的低信号;移植后2周可见沿胼胝体腹侧走行的线状低信号影;移植后4周移植细胞所致的“彗星状”改变更为明显,彗星尾向缺血侧延伸.移植后4周脑组织切片普鲁士蓝染色显示胼胝体内迁移的蓝染细胞呈条带状排列.结论 SWI序列可显示移植部位SPIO标记BMSC所致的低信号,且可以明确显示其在大鼠脑组织内的迁移.     

SPIO标记骨髓间充质干细胞移植入心肌梗死大鼠的示踪研究

目的探讨超顺磁性氧化铁微粒（SPIO）体外标记骨髓间充质干细胞（BMSCs）及体内示踪移植入大鼠心肌梗死心脏的BMSCs的能力。方法使用左旋多聚赖氨酸-SPIO共培养方式标记BMSCs。采用普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒,流式细胞术检测细胞活力,将经过SPIO标记的干细胞移植入心肌梗死大鼠心脏,应用1.5TMRI系统行磁标记干细胞成像。超声心动图检测各组心脏的左室射血分数（EF）,左室舒张末期内径（LVIDd）,左室收缩末期内径（LVIDs）及短轴缩短率（FS）。结果普鲁士蓝染色显示,SPIO标记的BMSCs细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒,标记效率为（99.81±1.57）%;与正常未标记细胞相比较,细胞的活力差异无统计学意义（P〉0.05）。标记了SPIO的BMSCs体内MRI成像时显示,细胞移植区域信号缺失,对应区域病理切片普鲁士蓝染色可见胞浆内染色阳性的细胞。超声心动图显示,PBS组FS移植前后没有明显变化,BMSC组FS从移植前的（23.1±1.88）%上升到第1周的（31.28±4.15）%。BMSC组EF在移植前是（51.13±5.07）%,第1周时上升到（60.12±8.40）%。结论 SPIO能成功地标记BMSCs,且对BMSCs的活力无明显影响。BMSCs移植后能改善心梗大鼠的心功能。SPIO标记的BMSCs移植后在大鼠体内的分布、迁移过程可用MRI进行检测评价。     

绿色荧光蛋白、菲立磁体外双标记神经干细胞及其活性的研究

目的探索用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)重组逆转录病毒和菲立磁(超顺磁性氧化铁,,Superparamagnetic Iron Oxide,SPIO)体外双标记神经干细胞的可行性及其对细胞活力的影响。方法用病毒介导的GFP基因转导大鼠胚胎神经干细胞。用SPIO和Lipofectamine体外磁化标记经GFP标记的胚胎神经干细胞。用荧光显微镜观察双标记神经干细胞,并行普鲁士蓝染色,了解转染成功率。MTT(四甲基偶氮唑蓝)法检测标记神经干细胞的细胞增殖活力。结果双标记神经干细胞分化的细胞荧光显微镜下观察见发出绿色荧光,普鲁士蓝染色呈阳性。而未标记神经干细胞荧光显微镜下观察未见发出绿色荧光,普鲁士蓝染色呈阴性。MTT法检测发现GFP和SPIO双标记神经干细胞的增殖活力与未标记神经干细胞相比无改变。结论绿色荧光蛋白重组逆转录病毒和菲立磁可以有效地标记体外分离培养的大鼠胚胎神经干细胞。双标记神经干细胞的增殖、分化活力与未标记神经干细胞相比无改变。     

超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞

背景:一些研究者利用超顺磁性氧化铁对骨髓间充质干细胞进行标记,并利用MRI技术对标记细胞肝内、肾内移植后进行初步的活体示踪,但是,对于超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞后,对其存活、增殖以及分化是否有影响研究较少。目的:观察超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞后,对其存活、增殖以及向神经细胞的分化是否有影响。方法:使用超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓间充质干细胞,采用普鲁士蓝染色法鉴定其标记率、锥虫蓝染色法检测细胞活力、MTT法检测标记干细胞的细胞增殖活力、以1mmol/Lβ-巯基乙醇及无血清DMEM培养液体外诱导标记细胞向神经细胞分化并用免疫组织化学奠定诱导后细胞、再次使用普鲁士蓝染色法鉴定神经细胞内的铁颗粒。结果与结论:普鲁士蓝染色对干细胞的标记率接近100%,锥虫蓝染色显示标记细胞的存活率为97%;MTT法检测发现标记干细胞的增殖活力与未标记干细胞相比差异无显著性意义(P0.05);以β-巯基乙醇诱导后大部分骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞、免疫组织化学阳性,再次普鲁士蓝染色显示铁颗粒位于神经细胞的细胞浆内。提示超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞后,对于干细胞的存活、增殖以及向神经细胞的分化无影响。     

MRI活体示踪心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞的移植

背景：干细胞移植的疗效和安全性评估均需要对体内干细胞的存活、分布、迁徙、增殖及分化进行连续监测。 目的：观察MRI示踪超顺磁性氧化铁标记的骨髓间充质干细胞在缺血心肌组织的分布、迁徙情况。 方法：直接贴壁法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞,获得的细胞进行免疫鉴定。以新型超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞,体外MRI成像确定其体内示踪的可行性。标记后锥虫蓝拒染试验、MTT比色试验分别检测标记细胞的活力、增殖情况。60只SD大鼠随机分为3组,制备大鼠心肌梗死模型2周后再次开胸移植含标记骨髓间充质干细胞的PBS混合液、含未标记骨髓间充质干细胞的PBS混合液和等量PBS。于移植后第1天、第3周行MRI检查,动态观察移植细胞的分布、迁徙,并根据MRI图像定位选择性行CD90免疫组化检查。 结果与结论：骨髓间充质干细胞标记后,普鲁士蓝染色见胞浆内蓝色铁颗粒,标记效率为99%,标记细胞与未标记细胞间锥虫蓝拒染率、MTT吸光度差异无显著性意义。体外MRI可检测到标记细胞,并在T2WI及T2W/FFE序列上呈低信号。细胞移植1 d后,在T2WI及T2W/FFE序列上可见标记细胞在梗死心肌边缘呈类圆形低信号;移植3周后,移植区域信号边界模糊,范围扩大,对比度降低。CD90免疫组化检测证实移植细胞可由梗死边缘向梗死区域迁徙。结果可见新型超顺磁性氧化铁可成功对大鼠骨髓间充质干细胞进行标记,细胞标记后可被MRI检测。     

SPIO、GFP双标NT-3基因修饰中脑神经干细胞的建立

目的 建立超顺磁氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)双标神经营养素3(neurotrophin 3,NT-3)基因修饰中脑神经干细胞.方法 以质粒pcDNA3-NT3、pGFPN1共转染第三代E14大鼠胚胎中脑神经干细胞并用SPIO标记.荧光显微镜检测GFP的表达;免疫细胞化学、western blot鉴定NT-3的表达;普鲁士蓝染色、透射电镜鉴定SPIO标记.结果 GFP在基因转染12 h后开始表达;免疫细胞化学、western blot表明细胞能正确表达NT-3;普鲁士蓝染色显示细胞标记率达100%,透射电镜显示SPIO颗粒位于吞饮小泡和胞浆内.结论 建立SPIO、GFP双标NT-3基因修饰中脑神经干细胞,为进一步开展帕金森病的细胞移植治疗研究奠定基础.     

超顺磁性氧化铁和DAPI双标记骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞目前已经成为重要的组织工程种子细胞,而若想深入研究其在体内外增殖、分化的规律,首先需要解决如何能高效、安全地标记骨髓间充质干细胞。 目的：观察超顺磁性氧化铁及DAPI对大鼠骨髓间充质干细胞的双标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响。 方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用超顺磁性氧化铁及DAPI双标记后分别用普鲁士蓝染色法和激光共聚焦显微镜观察其铁标记率及荧光标记率。用锥虫蓝检测细胞活力;MTT法检测标记干细胞增殖力;Calcein-AM/PI以及AO/PI双染细胞,检测细胞存活率以及凋亡率。 结果与结论：超顺磁性氧化铁及DAPI在体外双标记大鼠骨髓间充质干细胞效率高,可达100%;锥虫蓝染色显示标记细胞的存活率为97%;MTT法检测发现双标记干细胞组的活力以及增殖力与未标记干细胞组相比差异均无显著性意义(P > 0.05);Calcein-AM/PI染色,未标记细胞及双标记细胞的存活率分别为96%和95%;AO/PI染色,未标记及双标记细胞的凋亡率均为1%。提示超顺磁性氧化铁和DAPI双标记大鼠骨髓间充质干细胞后,对于干细胞的存活、增殖以及凋亡无影响。     

超顺磁氧化铁和EGFP双标NGF基因修饰中脑神经干细胞的建立

目的:建立超顺磁氧化铁(SPIO)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双标神经生长因子(NGF)基因修饰中脑神经干细胞。方法:以质粒pcDNA3-hNGF、pEGFPN1共转染第三代大鼠胚胎中脑神经干细胞并用SPIO标记。荧光显微镜检测EGFP的表达;免疫细胞化学、Western Blot鉴定NGF的表达;普鲁士蓝染色、透射电镜鉴定SPIO标记。结果:EGFP在基因转染12h后开始表达;免疫细胞化学、Western Blot表明细胞能正确表达NGF;普鲁士蓝染色显示细胞标记率达100%,透射电镜显示SPIO颗粒位于吞饮小泡和胞浆内。结论:建立了SPIO、EG-FP双标记NGF基因修饰中脑神经干细胞,为进一步开展细胞移植治疗帕金森病的研究奠定基础。     

超顺磁性氧化铁标记脐带间充质干细胞后的活体MRI示踪

背景：核磁成像以其有效成像时间长,空间、时间分辨率高,对比度好的优点,在细胞活体示踪中显现出其独有的优势。 目的：观察超顺磁性氧化铁标记人脐带间充质干细胞的适宜浓度,及标记后干细胞移植入心肌梗死实验犬体内的MRI示踪成像。 方法：无菌条件下留取健康新生儿脐带,分离培养间充质干细胞并进行细胞表面标志检测。不同质量浓度的超顺磁性氧化铁标记第3代人脐带间充质干细胞,采用开胸冠状动脉结扎法建立犬心肌梗死模型并经心电图和病理对模型进行鉴定。56 mg/L超顺磁性氧化铁标记干细胞后移植实验组,相同质量浓度超顺磁性氧化铁注射对照组,分别于移植前、移植后第7,28天行核磁显像,第14,28天进行心肌病理检测。 结果与结论：分离得到的人脐带间充质干细胞表达间充质干细胞表面标记CD29,CD44及CD105均在90%以上,不表达造血细胞系的特征CD14,CD34与CD45。超顺磁性氧化铁质量浓度在14-84 mg/L时,对细胞增殖与活性无明显影响,标记率接近100%。心电图及组织病理检测均显示心肌梗死模型制作成功。56 mg/L的超顺磁性氧化铁标记细胞并移植后,核磁可对移植细胞清晰显像;病理检测可见普鲁士蓝染色阳性的细胞,生长方向同心肌细胞一致。提示14-84 mg/L范围的超顺磁性氧化铁可有效标记人脐带间充质干细胞,且核磁可以对超顺磁性氧化铁标记的人脐带间充质干细胞进行活体示踪。     

MRI活体示踪超顺磁性氧化铁标记兔骨髓间充质干细胞的自体皮下移植

背景：高磁场MRI已被成功应用于示踪移植超顺磁性氧化铁标记骨髓基质干细胞的研究,但目前还有应用低磁场MRI示踪移植干细胞的报道。 目的：探讨用0.2 T MRI活体示踪自体皮下移植磁化标记骨髓基质干细胞的分布和迁移的可行性。 方法：从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,采用超顺磁性氧化铁和BrdU双重标记后,与壳聚糖复合植入兔自体大腿皮下。自体皮下移植未标记骨髓基质干细胞和皮下单纯注射超顺磁性氧化铁为对照。 结果与结论：超顺磁性氧化铁标记骨髓基质干细胞经普鲁士蓝染色和电镜检查证实细胞胞浆含致密铁颗粒。超顺磁性氧化铁标记后自体皮下移植的兔骨髓基质干细胞在GRET2*WI序列成像时产生特征性的低信号改变至少维持8周,且信号逐渐从移植部位进入组织深处。但普鲁士蓝染色和BrdU免疫组化显示大部分的移植细胞仍停留在原移植部位。提示体外超顺磁性氧化铁能有效地标记骨髓基质干细胞,利用0.2 T MRI活体示踪自体皮下移植的超顺磁性氧化铁标记兔骨髓基质干细胞分布和迁移是可行的。