实时荧光PCR检测蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫方法的建立

目的建立贾第鞭毛虫和隐孢子虫的基因检测方法。方法根据GenBank中贾第鞭毛虫和隐孢子虫相对保守序列,设计引物及其相应的Taqman探针。通过对引物和探针浓度、Taq酶以及反应条件等优化筛选后,建立检测贾第鞭毛虫和隐孢子虫的荧光PCR方法。结果贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测结果为阳性,对其它DNA样本如日本血吸虫、刚地弓形虫、溶组织内阿米巴、旋毛虫和阴道毛滴虫的检测均为阴性。本法的敏感性高,可检测到10～102copies/μl的DNA浓度。结论建立的基因检测方法,对贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测具有高度的特异性和敏感性,可用于饮用水和临床样本等的快速检测。     

利用荧光定量PCR技术对人肠道乳酸杆菌进行定量检测

目的应用荧光定量PCR技术对人粪便内乳酸杆菌进行定量检测,建立乳酸杆菌的荧光定量PCR检测体系。方法依据人肠道乳酸杆菌16S rDNA序列设计属特异性引物,应用荧光定量PCR技术检测乳酸杆菌的16S rDNA,对粪便中的乳酸杆菌进行定量检测和分析,并与用传统方法所获得的结果进行比较。结果荧光定量PCR检测乳酸杆菌和传统方法检测乳酸杆菌获得的结果接近,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论荧光定量PCR技术比传统方法省时、省力,且敏感性和特异性更高。     

原位PCR技术检测小鼠肺炎模型肺组织中b型流感嗜血杆菌DNA

用于肺炎病原检测的传统方法,如咽分泌物培养、血培养、血清学等有时不能反映肺炎病原学的真实情况。分子生物学方法虽广泛应用于肺炎的病原学检测,但其价值也与标本来源有关。我们建立小鼠b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza type b,Hib)肺炎模型;并采用传统聚合酶链反应(PCR)、DNA印迹(Southern blot)和原位PCR(in situ PCR,IS- PCR)检测石蜡包埋肺组织标本中的Hib,探讨IS- PCR等方法在石蜡包埋肺组织标本中检测Hib的使用价值。     

两种PCR方法检测狂犬病毒的敏感性和特异性比较

目的比较Nested-PCR和SYBR GreenⅠReal-Time PCR两种方法检测狂犬病毒的敏感性、特异性和时效性。方法对10倍连续稀释的狂犬病毒（疫苗株）核酸样品,采用Nested-PCR和SYBR GreenⅠReal-Time PCR方法进行平行检测,比较两种方法的敏感性;同时以登革热2型病毒、诺如病毒、星状病毒、EV71和乙型脑炎病毒核酸对两种方法的特异性进行评价。结果 SYBR GreenⅠReal-Time PCR方法可检测出2.3×106copies/μl核酸分子,与Nested-PCR方法相比,敏感度提高10倍。两种检测方法的特异性均好,与登革热2型病毒、诺如病毒、星状病毒、EV71和乙型脑炎病毒核酸均无交叉反应。SYBR GreenⅠReal-Time PCR方法检测花费3h,检测时间比Nested-PCR方法节省2h。结论与Nested-PCR相比,SYBR GreenⅠReal-Time PCR是相对高效的检测狂犬病毒的方法。     

胆囊炎家兔体表循经高温现象对棕色脂肪组织UCP1mRNA表达的影响

目的观察实验性胆囊炎家兔体表循经高温现象产生对棕色脂肪组织中解偶联蛋白1(UCP1)mRNA表达的影响,探讨脂肪组织与循经高温现象的相关性。方法建立实验性胆囊炎家兔模型,并设空白对照组。红外温度计采集胆经部位温度后取材,Real-Time PCR检测胆经脂肪组织中UCP1基因在mRNA水平上的表达。结果胆经部位温度组间比较,模型组较空白对照组明显增高(P0.05);Real-Time PCR检测模型组脂肪组织中UCP1mRNA的表达量明显高于空白对照组(P0.05)。结论实验性胆囊炎家兔体表循经高温现象产生部位的棕色脂肪组织中UCP1mRNA表达水平增高。     

建立设有内对照的Real-time PCR方法检测人血清中细小病毒B19

目的 建立设有内对照的TaqMan探针Real-time PCR方法 ,用于检测人血清中细小病毒B19.方法 人工合成2段DNA序列,克隆到T载体,线性化后进行DNA定量,分别作为模板标准品和内对照;合成1对引物和不同荧光素标记的2条探针,2条探针分别能与阳性模板或内对照结合,建立设有内对照的B19 Real-time PCR检测方法 .对方法 的稳定性进行了评价,并应用于人血清B19病毒检测.结果 获得了B19检测标准DNA和内对照DNA,确定了内对照的添加量,建立了使用内对照的Real-time PCR检测方法 .对160份血清标本进行了检测,检出2份阳性标本,病毒DNA浓度分别为2.1 × 105Geq/ml和3.6×103Geq/ml.结论 成功建立了人细小病毒B19 Real-time PCR检测方法 ,可用于人血清B19检测;由于使用了内对照,该方法 有利于排除假阴性检测结果 .     

用PCR扩增tim基因检测蓝氏贾第鞭毛虫

采用聚合酶链反应 (PCR)对蓝氏贾第鞭毛虫 (Giardialamblia)的磷酸丙糖异构酶 (triosephosphateisomerase ,缩写为tim)基因进行特异性扩增 ,结果扩增出 1条 6 83bp的DNA片段。此方法的特异性可高达10 0 % ,而其它DNA样本 ,如日本血吸虫 (Schistosomajaponicum)、刚地弓形虫 (Toxoplasmagondii)、微小隐孢子虫 (Cryptosporidiumparvum)、溶组织内阿米巴 (Entamoebahistolytica)、旋毛虫 (Trichinellaspiralis)和阴道毛滴虫 (Trichomonasvaginalis) ,以及人体血细胞等均未出现扩增反应。本法的敏感性也很高 ,可检测到0 4pg贾第虫包囊的DNA。 13株来自不同地理位置和 或宿主的贾第虫DNA样本在PCR中均各产生 1条长为 6 83bp的目的片段。上述结果表明本实验建立的检测贾第虫的PCR方法有效     

腹泻相关致病菌基因芯片的制备及应用

目的确定引起人类感染性腹泻的11种病原微生物,并制备芯片用于检测门诊腹泻患者粪便标本中的致病菌。方法根据本院2009年1月至2012年12月期间腹泻门诊的粪便病原菌检测数据,采用生物信息学的方法,收集11种病原菌的所有基因序列,设计引物及探针,优化并制备芯片,PCR扩增杂交并对杂交结果进行分析。用该芯片对本院保存的163个肠道致病菌临床分离株进行鉴定来评价芯片的特异性,用芯片来检测掺有不同浓度沙门氏菌的粪便标本评价芯片的灵敏度。同时收集2010年6月至2013年3月在本院就诊的1052份腹泻患者粪便标本,平行进行PCR扩增、细菌培养、基因芯片检测,比较不同检测方法的阳性率。结果成功制备了腹泻相关11种致病菌检测芯片。应用制备的芯片检测了163个临床分离株,准确率达100％。与PCR方法比较,基因芯片检测沙门氏菌的灵敏度达102CFU／ml,比PCR法检测灵敏度高10倍。用该芯片对临床1052份腹泻患者腹泻标本进行检测,与传统的培养法及PCR法比较,有较高的阳性检出率,达36％,比常规细菌培养阳性率高13％（X2=2．28,P〈0．05）,比PCR检出率高4％（X2=5．16,P〉0．05）。结论成功制备11种腹泻相关致病菌基因芯片,能同时对11种腹泻致病菌进行检测,有较好的特异性和灵敏度,有更高的阳性率,可以用于临床检测。     

用PCR扩增tim基因检测蓝氏贾第鞭毛虫

采用聚合酶链反应(PCR)对蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)的磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,缩写为tim)基因进行特异性扩增,结果扩增出1条683bp的DNA片段.此方法的特异性可高达100%,而其它DNA样本,如日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis),以及人体血细胞等均未出现扩增反应.本法的敏感性也很高,可检测到0.4pg贾第虫包囊的DNA.13株来自不同地理位置和/或宿主的贾第虫DNA样本在PCR中均各产生1条长为683bp的目的片段.上述结果表明本实验建立的检测贾第虫的PCR方法有效.     

用PCR扩增tim基因检测蓝氏贾第鞭毛虫

采用聚合酶链反应(PCR)对蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)的磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,缩写为tim)基因进行特异性扩增,结果扩增出1条683bp的DNA片段.此方法的特异性可高达100%,而其它DNA样本,如日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis),以及人体血细胞等均未出现扩增反应.本法的敏感性也很高,可检测到0.4pg贾第虫包囊的DNA.13株来自不同地理位置和/或宿主的贾第虫DNA样本在PCR中均各产生1条长为683bp的目的片段.上述结果表明本实验建立的检测贾第虫的PCR方法有效.