回旋引导受体1在丙戊酸钠诱导神经干细胞分化过程中的表达和作用

目的 探讨丙戊酸钠(VPA)诱导神经干细胞(NSCs)向神经元分化过程中回旋引导受体1(Robo1)的表达及作用。方法 分离培养SD大鼠海马NSCs,正常NSCs和应用VPA处理NSCs各提取自10只SD大鼠。应用VPA处理后,免疫荧光技术检测NSCs向神经元标志物β-微管蛋白Ⅲ(Tuj1)阳性神经元分化的比例;利用基因芯片技术检测正常NSCs和VPA处理后NSCs中差异表达mRNA并进行生物信息学分析;通过Real-time PCR、Western blotting检测VPA诱导NSCs分化过程中Robo1 mRNA和蛋白的表达情况;Real-time PCR检测诱导分化后NSCs中Robo1 mRNA的动态变化;应用小干扰RNA下调NSCs中Robo1,Western blotting检测Robo1蛋白的表达情况,Real-time PCR和免疫荧光技术检测NSCs中神经元特异性标志物Tuj1和微管相关蛋白2(MAP-2)表达情况。结果 应用VPA处理NSCs可促进其向神经元分化;VPA处理组与对照组相比,Robo1 mRNA和蛋白的表达显著上调;NSCs诱导分化过程中Robo1表...     

丙戊酸钠诱导神经干细胞分化过程中肝配蛋白A3的表达

目的 探讨丙戊酸钠（VPA）促进神经干细胞分化过程中肝配蛋白A3（Efna3）的表达以及Efna3在神经系统里的表达模式。方法 分离培养SD大鼠海马神经干细胞,在VPA诱导分化后24 h和48 h,利用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）、免疫印迹法（Western blotting）和免疫荧光技术检测Efna3的动态表达;Real-time PCR检测Efna3在成年SD大鼠各组织以及神经干细胞、星形胶质细胞和神经元中的表达水平。 结果 VPA处理组与对照组相比,Efna3的表达量明显上升; Efna3在端脑和海马中呈现优势表达;Efna3在神经元中表达较高,而在星形胶质细胞中表达较低。 结论 VPA促进神经干细胞分化可能与Efna3的表达上调有关。     

骨形态发生蛋白/维甲酸诱导的神经特异性蛋白3在丙戊酸钠诱导神经干细胞向神经元分化过程中的作用

目的 探讨骨形态发生蛋白/维甲酸诱导的神经特异性蛋白3（Brinp3）在丙戊酸钠（VPA）诱导神经干细胞向神经元分化过程中的作用。方法 体外培养大鼠海马神经干细胞,运用Real-time PCR和Western blotting技术在VPA诱导神经干细胞分化后24 h和48 h检测Brinp3的表达;Real-time PCR检测Brinp3在成年大鼠各组织中以及在神经干细胞、星形胶质细胞和神经元中的表达水平;在神经干细胞中转染Brinp3小干扰RNA（siRNA）并诱导分化24 h后,运用Real-time PCR、Western blotting和免疫荧光技术检测Brinp3和神经元标志分子的表达。以上实验均包含5次生物学重复。结果 与对照组相比,VPA处理组中Brinp3的mRNA和蛋白水平在24 h和48 h均显著上调（P<0.05）;Brinp3在脑组织中呈优势表达;Brinp3在星形胶质细胞中表达较低,而在神经元中表达较高（P<0.001）;在神经干细胞中转染Brinp3 siRNA,诱导分化24 h后,Brinp3的表达被显著抑制（P<0.001）,神经元标志分子的表达均显著下调（P<0.01）,第4天分化成的神经元比例减少（P<0.001）。结论 Brinp3表达的上调可能介导了VPA促神经干细胞向神经元分化的功能。     

干预脑脂质结合蛋白表达对神经干细胞分化作用的影响

目的 探讨脑脂结合蛋白（BLBP）在大鼠海马神经干细胞（NSCs）向神经元分化中的作用。方法 构建BLBP过表达腺病毒和干扰慢病毒载体,并从大鼠胚胎海马组织中分离培养神经干细胞,采用Nestin免疫荧光鉴定NSCs;将体外培养的NSCs分为4组：腺病毒阴性对照组（Ad-NC组）,BLBP过表达腺病毒组（Ad-BLBP组）,慢病毒阴性对照组（LV-NC-RNAi组）和BLBP干扰慢病毒感染组(LV-BLBP-RNAi组)。Real-time PCR和Western blotting检测各组细胞中BLBP表达;病毒感染4 d后免疫荧光检测分化细胞中βⅢ微管蛋白（Tuj1）阳性神经元数量。结果 Ad-BLBP组较Ad-NC组NSCs分化为神经元的数量少,突起短而少;LV-BLBP-RNAi组较LV-NC-RNAi组NSCs分化为神经元的数量明显增多,突起多而长。结论 下调BLBP的表达能够促进体外培养的NSCs向神经元分化。     

糖皮质激素对大鼠下丘脑亨廷顿蛋白相关蛋白1表达的影响

目的 探讨外源性糖皮质激素对大鼠下丘脑亨廷顿蛋白相关蛋白1（HAP1）表达的影响。 方法 成年雄性Wistar大鼠80只,随机分为实验对照组（注射生理盐水）、皮质酮注射组、皮质酮+皮质酮受体拮抗剂(RU38486)注射组、饮用氢化可的松组。皮质酮注射［(5mg/(kg.12h)］组又分为注射持续1d、3d、5d、7d组;皮质酮+皮质酮受体拮抗剂(RU38486)注射［(10mg/(kg.12h)］组注射持续3d;饮用氢化可的松组大鼠饮用水中加氢化可的松（0.01g/L）,连续1个月。应用RT-PCR、免疫印迹法观察大鼠下丘脑HAP1表达的变化。 结果 注射皮质酮1d和3d后,下丘脑HAP1表达明显减少,其mRNA的表达明显下调,5d后HAP1开始回升,7d 后恢复到正常水平,HAP1 mRNA表达5d后明显增加,并高于正常水平;长期(一个月)饮用氢化可的松的大鼠,其下丘脑中HAP1的表达明显减少;在皮质酮注射的同时注射RU38486,可以对抗由皮质酮注射所引起的下丘脑HAP1的变化。 结论 外源性过量糖皮质激素能影响下丘脑HAP1的表达,下丘脑中的HAP1可能参与下丘脑神经元或神经内分泌细胞的功能活动。     

亨廷顿蛋白相关蛋白-1在成年大鼠脑内的定位

目的:探讨亨廷顿蛋白相关蛋白1(HAP1)在成年大鼠脑内的分布.方法:健康成年大鼠取脑做连续冠状切片,免疫组织化学方法观察HAP1在脑内的表达.结果:大量的HAP-1表达出现在海马、齿状回、隔核、黑质、红核、连合下核、连合下器、脊髓前庭核、臂旁核、大脑脚基底部、束间核、后屈束、穹窿、被盖腹侧区、嘴侧线形中缝核以及丘脑、下丘脑各区;蜗背侧核、背侧纵束、前庭内侧核、中缝背核背侧部、中缝背核腹侧部、中缝背核腹外侧部、中央灰质等处的表达稍弱;其余像嗅球、大脑皮层各区、小脑皮层等处均有表达但强度极低,Stigmoid小体数目的变化趋势与HAP1基本一致.结论:HAP1广泛分布于脑的各部,推测HAP1可能参与了脑的多种生理功能.     

亨廷顿蛋白相关蛋白1在大鼠脊髓中的定位及与初级传入神经元的关系

本文首次通过免疫组织化学技术和免疫印迹方法(Western blotting)观察了亨廷顿蛋白相关蛋白1(huntingtin associated protein 1，HAP1)在大鼠脊髓和背根节中的分布以及HAP1与Gfiffonia simplicifolia Ⅰ-B4结合位点在背根节初级传入神经元的共存，并观察了单侧背根切断和辣椒素(capsaicin)损毁实验对脊髓背角HAP1表达水平的变化。     

应用丙戊酸钠调节组蛋白乙酰化对肿瘤细胞周期相关蛋白的调控作用

目的 探讨应用组蛋白脱乙酰酶抑制剂丙戊酸钠(VPA)调节染色体组蛋白低乙酰化修饰水平对肿瘤细胞增殖周期相关蛋白Cyclin A、Cyclin DI、Cyclin E和P21waf/cipl的调控作用. 方法 应用0.75～4.00 mmol/ VPA干预肝癌细胞HepG2、胃癌细胞BGC-823、乳腺癌细胞MCF-7 48 h后,PI标记流式细胞术检测细胞周期;间接免疫荧光法分析Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E、P21waf/cip1蛋白表达;RT-PCR检测分析Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E、P21waf/cip1 mRNA表达. 结果 HepG2、BGC-823、MCF-7这3种细胞系培养48 h后,流式细胞术分析可见0.75～4.00 mmol/L、VPA实验组随药物浓度的增加而出现逐渐递增的细胞增殖周期G1期阻滞趋势.HepG2、BGC-823细胞Cyclin A蛋白及mRNA表达被明显下调;MCF-7细胞Cyclin A蛋白及mRNA表达在两个浓度组均未见明显变化;Cyclin D1蛋白及mRNA表达在3个细胞系均被明显下调;P21waf/cip1蛋白及mRNA表达在3个细胞均被明显上调;Cyclin E蛋白及mRNA表达则未见明显变化. 结论 应用VPA干预组蛋白乙酰化修饰可对HepG2、BGC-823、MCF-7细胞Cyc-lin D1、P21waf/cip1表达起明显的调控作用;对Cychn A的调控作用则随肿瘤细胞来源及表型的不同而有所差异,而对Cyclin E则无明显的调控作用.在VPA诱导肿瘤细胞增殖周期G1期阻滞过程中,下调CyclinD1和上调P21waf/cip1蛋白及mRNA表达可能是其共同作用途径.     

链脲佐菌素敏感的胰岛细胞表达亨廷顿蛋白相关蛋白1

目的探讨亨廷顿蛋白相关蛋白1（HAP1）在大鼠胰岛中的定位.方法应用一次性大剂量腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin）的方法选择性破坏大鼠胰岛B细胞复制糖尿病模型,免疫组织化学ABC法显示胰岛内HAP1和胰岛素免疫反应性.结果在正常大鼠胰腺内,HAP1选择性表达于胰岛内,HAP1免疫反应阳性细胞呈短条索状或团状分布在每个胰岛内,主要位于胰岛的中央部,与胰岛B细胞的分布十分相似.注射链脲佐菌素的大鼠,胰岛中含HAP1的细胞数量在注射链脲佐菌素3d后已明显减少,并随着注射后动物存活时间的延长而进一步进行性减少;在注射后4周的大鼠,胰岛中仅有少数散在分布的HAP1免疫反应弱阳性细胞.链脲佐菌素对胰岛中表达HAP1细胞的影响与对表达胰岛素细胞的影响一致.结论HAP1也存在于胰岛内,并主要定位于链脲佐菌素敏感的B细胞内.     

寒冷应激对大鼠肾上腺髓质亨廷顿蛋白相关蛋白1表达的影响

目的 探讨亨廷顿蛋白相关蛋白1(HAP1)在大鼠肾上腺髓质的超微结构定位,以及寒冷应激对大鼠肾上腺髓质HAP1表达的影响. 方法 成年雄性Wistar大鼠14只,2只用于免疫电镜研究,12只用于寒冷实验研究.寒冷实验中,将动物随机分为对照组和寒冷组,每组6只,寒冷组动物放置4℃环境下,12h后用免疫组织化学和Western blotting方法 检测大鼠肾上腺髓质HAP1表达的变化. 结果 免疫电镜结果 显示,HAP1免疫反应产物分布在肾上腺髓质细胞分泌颗粒外膜及分泌颗粒间的膜性细胞器上.寒冷组大鼠肾上腺髓质HAP1的表达明显减少,和对照组比较有显著性差异( P <0.01). 结论 HAP1可能与肾上腺髓质细胞内分泌颗粒及位于分泌颗粒内的肾上腺素/去甲肾上腺素的运输和释放有关.     

从多潜能干细胞诱导成神经前体细胞及其分化探讨

目的探讨诱导多潜能干细胞在体外分化为神经前体细胞。方法采用N2B27作为选择培养基,多步法贴壁培养把诱导多潜能干细胞诱导为神经前体细胞。结果免疫荧光染色发现,该细胞神经干细胞的标记物巢蛋白阳性,有极个别的β-微管蛋白Ⅲ(β-Tub-Ⅲ)阳性细胞。在分化培养基内培养7d后,β-Tub-Ⅲ阳性细胞增多。结论本实验初步表明,诱导多潜能干细胞在体外可以被诱导为有一定神经特征的神经前体细胞,该细胞有望用于细胞移植治疗缺血性脑损伤。     

胶质细胞源性神经营养因子诱导神经干细胞分化过程中bHLH转录因子的表达变化

目的观察胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF）对神经干细胞分化的影响,探讨碱性螺旋环螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）转录因子是否参与在此过程中。方法无菌条件下取孕14。16d胎鼠端脑进行神经干细胞体外培养,将第三代神经球分为对照组和GDNF组,分化1、3、7d细胞进行免疫荧光染色并计算β-tubulinIII阳性率,荧光定量PCR技术检测bHLH基因Hes-1、Hes．5、Mash-1的表达变化。结果免疫荧光染色结果显示,分化1、3、7d时,β-tubulinlll阳性细胞比率分别为：对照组：（3．76±1．14）％、（7．40±1．25）％、（12．65±1．58）％;GDNF组：（7．29±1．57）％、（19．80±1．67）％、（27．55±2．03）％,GDNF组神经元分化率明显高于对照组（P〈0．05）。荧光定量PCR结果显示,Hes-1和Hes-5在分化1、3、7d均保持极低表达,各时间点间比较无明显差异;Mash-1表达则在分化1、3、7d内持续上升,各时间点间比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论GDNF能通过Mash-1的激活来诱导神经干细胞分化为更多的神经元,并且此过程中bHLH转录因子表达有明显特异性,将为日后进行神经干细胞定向分化的机制研究奠定基础。     

大鼠胚胎神经干细胞与永生化神经干细胞系C17.2定向分化为神经元潜能的差异

目的 对比大鼠早期胚胎神经干细胞( NSCs)与永生化神经干细胞系C17.2(C17.2-NSC)定向分化为神经元潜能的差异,确立适用于诱导NSCs定向分化为神经元高内涵药物筛选的NSCs筛选模型. 方法 C17.2-NSC、17d胚胎海马NSCs(E17-NSC)及11d胚胎大脑皮层NSCs(E11-NSC)均设定对照组和实验组,对照组与实验组的细胞在含有2％ (v/v) B27的DMEM/F12培养液中,分别经0μmol/L和1μmol/L维甲酸(RA)在37℃、5％CO2常规培养条件下诱导分化5d,通过免疫组织化学技术检测对照组与实验组中NSCs或前体细胞特异性标志蛋白巢蛋白(Nestin)及神经元特异性标志蛋白βⅢ微管蛋白(Tuj1)表达量的差异. 结果 与对照组相比,C17.2-NSC经1μμmol/L RA诱导后未定向分化为神经元,而E17-NSC及E11-NSC经1μmol/L RA诱导后可有效定向分化为神经元. 结论 相对于C17.2-NSC,大鼠早期胚胎NSCs定向分化为神经元的潜能更强,适用于诱导NSCs定向分化为神经元的高内涵药物筛选.     

激活的星形胶质细胞分泌聚集素蛋白及其对海马神经干细胞向神经元分化的促进作用

目的 探讨切割穹隆海马伞的侧海马提取液“激活”的星形胶质细胞分泌聚集素蛋白（CLU）及体外CLU诱导海马神经干细胞分化为神经元的情况。
方法 分别用切割穹隆海马伞的海马提取液、正常海马提取液、DMEM/F12 培养基培养星形胶质细胞,制备切割12h、24h、48h组,正常组和对照组条件培养基;ELISA检测比较不同条件培养基中CLU蛋白的浓度;体外细胞培养采用CLU诱导海马神经干细胞分化,设诱导组和空白对照组,7d后通过微管相关蛋白2（MAP-2）免疫荧光及Hoechst标记观察海马神经干细胞向神经元的分化情况。 结果 正常组和对照组条件培养基中CLU浓度较低,约为（0.1037±0.0119）ng/L和（0.1170±0.0078）ng/L;切割组12h、24h、48h条件培养基中其浓度明显增高,分别为（0.1940±0.0364）ng/L、（0.4250±0.0724）ng/L和（0.2903±0.0472）ng/L,以24h组最高,约为正常组和对照组的4倍。CLU诱导组中MAP-2阳性细胞数明显高于空白对照组（P<0.05）,其占总细胞数的百分比分别为(11.67±2.57)%和（4.52±1.54）%,且诱导组中MAP-2阳性细胞突起更长、更丰富。 结论 切割穹隆海马伞侧海马提取液“激活”的星形胶质细胞可分泌更多的CLU,体外细胞培养中CLU可促进海马神经干细胞向成熟的神经元分化。     

神经干细胞分化调控机制的研究进展

神经干细胞（NSCs）是一类具有自我更新和多方向分化潜能的干细胞,可以分化为神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。自从1992年Reynolds等从小鼠纹状体中分离到神经干细胞之后,相关的研究已经取得了很大的进展。然而由于中枢神经系统内神经干细胞数量较少,而神经系统损伤后移植的外源的神经干细胞大多分化为神经胶质细胞,进而形成瘢痕组织,限制了神经系统的恢复。因此,如何实现神经干细胞的定向诱导分化成为当前该领域的核心问题。     

纤维蛋白支架促进神经干细胞向神经元分化并抑制星形胶质细胞增生

目的探讨纤维蛋白支架对神经干细胞和星形胶质细胞分化及增殖的影响。方法分别培养胚胎大鼠脊髓来源的神经干细胞和新生鼠脊髓神经胶质细胞,接种于纤维蛋白支架上,同时用多聚赖氨酸修饰的玻片作为对照。于体外培养不同时间后,用神经丝蛋白(NF200)对神经细胞进行免疫荧光染色,测量各复孔(n=4)内NF阳性细胞的突起长度,计算其平均值;用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)对胶质细胞进行染色,各复孔(n=4)内统计5个不同视野的胶质细胞总数和GFAP阳性细胞数,计算GFAP阳性细胞相对数量的平均值。比较在纤维蛋白支架和玻片上神经干细胞分化、神经纤维延伸及神经胶质细胞增殖的差异。同时用免疫印迹技术对荧光染色结果进行验证。上述实验各重复3次。结果纤维蛋白支架组的NF阳性纤维明显长于对照组,GFAP阳性星形胶质细胞相对数量明显少于对照组,GFAP的表达水平明显低于对照组。结论纤维蛋白支架可促进神经干细胞向神经细胞分化,并有利于神经纤维的延伸而抑制星形胶质细胞的增殖和成熟。     

红细胞生成素激活的星形胶质细胞条件培养液对神经干细胞促分化作用及对分化后细胞的保护作用

目的 观察红细胞生成素激活的星形胶质细胞条件培养液（EACM）对神经干细胞促分化作用及对分化后细胞的保护作用。 方法 原代培养神经干细胞和1型星形胶质细胞,收集红细胞生成素(EPO)刺激的星形胶质细胞上清液,用于神经干细胞分化实验的研究。对分化后的细胞进行免疫细胞化学染色,计算其分化为神经元的比率;同时利用FeSO₄和H₂O₂制造细胞损伤模型,用EACM继续培养48h,然后检测细胞活性和存活细胞数。 结果 EACM组神经干细胞分化明显,神经元比率较星形胶质细胞上清组和对照组均有明显增加。分化后的细胞中加入H₂O₂后,继续用EACM培养的实验组吸光度(A)值和细胞存活百分比均较对照组高。 结论 红细胞生成素激活的星形胶质细胞条件培养液对神经干细胞有促其向神经元分化的作用,并对分化后的细胞有保护作用。