食管癌相关基因2原核表达质粒的构建与诱导表达

目的：构建食管癌相关基因2（ECRG2）原核表达质粒，在大肠杆菌（E．coli）中诱导表达重组蛋白。方法：用聚合酶链反应法扩增ECRG2基因开放阅读框（ORF），构建表达载体pGDX-4T-1-ECRG2，测序鉴定后转化E．coli（BL21）进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，目的蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、Western免疫印迹鉴定。结果：SDS-PAGE测定GSr／ECRG2蛋白分子质量约34ku，Western blot验证出目的蛋白特异表达。结论：ECRG2ORF插入pGEX-4T-1质粒并在E．coli中成功表达。     

幽门螺杆菌omp11基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体的构建与表达

目的：构建幽门螺杆菌(H．pylori)外膜蛋白基因(omp11)与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,为幽门螺杆菌疫苗和诊断抗原的筛选奠定基础。方法：提取H．pylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA,用自行设计的PCR引物,从染色体DNA上扩增出omp11基因,将其克隆到表达载体pMAL-c2x中,用重组质粒转化大肠杆菌(E．coli TB1)。对重组质粒进行酶切鉴定,对目的基因片段进行测序。用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析。结果：用PCR方法扩增的omp11基因长度为561bp;经酶切鉴定和测序,插入到载体的基因片段与文献报道相一致;SDS-PAGE的结果显示,目的基因表达产物的相对分子质量为28000,融合蛋白的表达量占全菌总蛋白的30％。结论：作者构建的pMAL-c2x与omp11基因重组质粒在E．coli TB1中能够高效表达目的基因,该重组质粒的构建为H．pylori omp11基因的研究建立了重要的基础。     

人载脂蛋白M的表达与纯化

目的:表达人细胞外全长结构域重组人载脂蛋白M(apolipoprotein M,ApoM)并将其纯化.方法:利用人类肝脏cDNA文库做模板,聚合酶链反应(PCR)法扩增ApoM DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pGEXT相应住点,插入E.coli JM109,转化E.coli DL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达.结果:PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实在SDS-PAGE上出现一条560bp的基因片段.测序结果与GenBank公布的人ApoM基因序列完全一致.ApoM cDNA基因片段经IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子量24 kD左右出现新的蛋白条带.结论:成功克隆出人ApoM基因,重组表达出ApoM蛋白.     

耐辐射奇球菌超氧化物歧化酶基因的克隆和表达

目的 构建耐辐射奇球菌(D．rdiodurans)锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因的原核表达重组子,并在E．coli BL21(DE3)中表达。方法 用PCR方法自D.radiodurans基因组中扩增Mn-SOD目的片段。将该基因与原核表达质粒载体pET-30a( )连接,构建重组质粒pET-SOD,并转化表达宿主菌E．coli BL21(DE3)。用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组SOD蛋白表达,SDS-PAGE分析表达产物。结果 获得了D．radiodurans-Mn-SOD基因的pET原核表达重组质粒,该质粒经IPTG诱导能在E．coli BL21(DE3)中高效表达目的蛋白,蛋白活性可达51800u／g湿菌体。结论 成功构建了原核表达重组质粒pET-SOD,实现了SOD在原核细胞中的高效表达,表达产物活性较高,为重组D．radiodurans Mn-SOD的进一步研究和应用奠定了基础。     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的 构建可溶性DC-SIGN(sDC-SIGN)原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白.方法 采用PCR方法,从含人DC-SIGN cDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coli BL21 (DE3)诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose 4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1 300 bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符.纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38 000,Western bolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合.结论 获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础.     

人canstatin基因克隆及其重组蛋白表达

目的克隆人血管能抑素canstatin基因,重组表达canstatin蛋白.方法从人胎盘组织中提取总RNA做模板,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增canstatin cDNA,转入克隆载体pUCm-T,再转化E.coli DH5α,挑选阳性克隆,测定基因序列.酶切克隆载体目的基因,插入表达载体pET-22b( ),转化E.coli BL21,诱导表达重组蛋白.结果RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实与目的基因长度一致.RT-PCR产物与pUCm-T的连接产物转化E.coli DH 5α,篮白斑筛选后,选6个白色菌落做酶切鉴定,证实其中1个为阳性克隆,测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致.将pUCm-T上目的基因片段酶切后插入pET-22b( ),转化E.coli BL21,挑选7个菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中1个克隆表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24 000左右出现新的蛋白条带.结论成功克隆出canstatin基因,重组表达出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础.     

艰难梭菌毒素A羧基端基因的克隆与表达

目的:克隆并表达艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区 (CDTAR)基因.方法:PCR扩增CDTAR基因并将其克隆到表达载体pET-22b( ),重组质粒转化到E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对表达产物进行分析.结果:构建了含CDTAR基因的重组质粒pET-CDTAR,IPTG诱导后SDS-PAGE显示表达出Mr约为35.7 ku的重组蛋白,占菌体总蛋白的36.1%,可溶性表达占上清的22.2%,包涵体中约占24.9%.结论:成功克隆了CDTAR基因,并构建表达了CDTAR重组蛋白,为进一步研究CDTAR功能及研制艰难梭菌疫苗奠定了基础.     

人类生精相关基因TSARG6的原核表达和抗体制备

目的 构建人类生精相关基因pGEX-KG/TSARG6原核表达载体,原核表达、制备并鉴定多克隆抗体.方法 以人类睾丸cDNA文库为模板,用PCR方法扩增得到TSARG6基因开放阅读框(ORF)全长序列,插入原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入E.coli JM109细菌,IPTG 诱导表达GST/TSARG6融合蛋白,采用SDS-PAGE 和Western blot鉴定融合蛋白,免疫家兔,制备抗TSARG6 多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性.结果 经测序验证,我们成功构建了pGEX-KG/TSARG6 重组质粒;转化重组质粒的E.coli JM109细菌经 IPTG 37℃诱导3 h后高效表达GST/TSARG6融合蛋白;Western blot 实验结果显示制备的多克隆抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了TSARG6基因的原核表达和多克隆抗体制备,为TSARG6的后续功能研究提供了有力的工具.     

人canstatin基因原核载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的：构建人血管能抑素canstatin基因原核表达载体,表达并纯化出其重组蛋白.方法：从人胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增canstatin cDNA,克隆进质粒pUCm-T,转化E coli DH5α,测序正确后,酶切目的基因片段,插入质粒pET-22b（＋）,转化E.coli BL21,IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白.结果：电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因canstatin长度一致.RT-PCR纯化产物与载体pUCm-T连接后,经蓝白斑筛选,挑出6个白色菌落做酶切鉴定.其中一个菌落被证实为阳性克隆,测定其基因序列,结果显示与Genbank公布的canstatin基因序列完全一致.将canstatin cDNA,插入质粒pET-22b（＋）,转化E.coli BL21,培养过夜后,挑选7个白色菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中一个克隆表达蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量24000左右出现新的蛋白表达条带,诱导1、2、3、4 h后,表达蛋白分别占菌体总蛋白的18.2%、18.8%、23.0%和23.4%.将诱导3 h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,125和250 mmol/L咪唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带.结论：成功构建人canstatin基因原核表达载体,表达并纯化出canstatin重组蛋白,为深入研究其临床应用打下基础.     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的;获得JEV E蛋白基因,构建重组表达载体并在E.coli中高效表达.方法:参照GeneBank中的日本乙型脑炎病毒SA14-14株序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增E基因全长,克隆至PUCm-T载体,经测序证实后克隆至原核表达载体pET32a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析.结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了JEV E蛋白基因全长1500bp,成功构建了重组质粒pET-32a/JEV E,SDS-PAGE分析显示目的蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌中获得表达,表达量占总菌体蛋白的35%.结论:在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白,为ELISA早期诊断试剂盒的研制和E蛋白基因结构与功能的分析奠定了基础.     

重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

人黑色素瘤抗原MAGE-A10的基因克隆及原核表达

目的:扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A10(melanoma antigen A10)cDNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达. 方法:从人黑色素瘤细胞系LiBr中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A10 cDNA,插入载体pMD18-T中. 测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达载体pGEX-4T-3-MAGE-A10,转化大肠杆菌BL21株进行表达. 经IPTG诱导表达,谷胱甘肽亲和层析获得重组目的蛋白. 结果:成功获得MAGE-A10编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致. 可以获得部分可溶性的原核重组蛋白,经亲和层析和分析,证实融合蛋白占总量的58.9%. SDS-PAGE分析其相对分子质量(Mr)为67 000,Western blot证实为目的蛋白. 结论:成功获得MAGE-A10 cDNA,构建得原核表达载体并获得高效表达. 本研究为制备MAGE-A10 mAb及研究MAGE-A10可能参与肿瘤发生发展的机制奠定了基础.     

人类5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶N端部分的克隆和表达

目的 :克隆人 5 ,10 亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTH FR)N端部分编码基因 ,构建重组表达载体并对其诱导表达 .方法 :通过RT PCR方法扩增出人胎肝组织MTHFR的N端部分 1116bp的核苷酸序列 ,克隆于载体pGEM Teasy ,测序分析后亚克隆于表达载体pGEX 4T 2 ,构建重组表达载体pGEX MTHFR(N) .结果 :经过转化E .coliJM10 9和BL2 1后 ,诱导表达出Mr 为 66× 10 3的蛋白 .SDS PAGE分析显示 ,表达量占全菌总蛋白质的 3 1%.结论 :获得了人MTHFR(N)编码基因及其原核表达菌株 ,对研究人MTHFR的生物学功能具有重要的意义 .     

人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的：构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体，大肠杆菌表达其融合蛋白．方法：采用反转录．聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2cDNA中，分别扩增出Heparanase编码基因，用限制性内切酶BamHI消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1中，经酶切鉴定与测序证实后，连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体，以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点，转化大肠杆菌BL21菌株，异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白．结果：构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实，与GenBank登录结果完全一致；双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3．1及pRSET；SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功．结论：成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体，成功正确表达了6His／Heparanase融合蛋白     

人高迁移率族蛋白1基因的克隆和表达

目的：克隆人高迁移率族蛋白1(HMG—1)编码基因，构建重组表达载体并对其诱导表达．方法：通过RT—PCR方法扩增出人外周血单个核细胞中HMG—1的编码基因，克隆于载体pGEM—T easy，测序分析后亚克隆于表达载体pGEx—4T—2，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导4h后可表达M，约56000的融合蛋白GST—HMGl．结果：克隆了人HMG—1的编码基因，构建了融合蛋白的重组表达质粒pGEx—HMGl，表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测，占全菌总蛋白的0．23．结论：获得了人HMG—1编码基因及其原核表达产物，对研究人HMG—1的生物学功能及其mAb的制备具有重要意义．     

抗肠道病毒71型外壳蛋白1卵黄抗体的制备和鉴定

目的 克隆肠道病毒71型（EV71）BrCr株外壳蛋白1（VP1）基因,构建原核表达载体PET28a/VP1,表达VP1重组蛋白,以VP1免疫产蛋母鸡,获得抗VP1的鸡免疫球蛋白（IgY）.方法 培养Vero细胞,利用Vero细胞增殖肠道病毒EV71 BrCr株,提取病毒总RNA,利用RT-PCR扩增出VP1目的基因,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切获得目的基因,插入原核表达载体pET-28a,重组子同时BamHⅠ,EcoRⅠ双酶切和测序鉴定,转化入感受态工程菌E.coli BL21（DE3）,获得阳性重组工程菌,经IPTG诱导获得表达融合蛋白,试剂盒纯化蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,用VP1蛋白免疫开产母鸡,收集鸡蛋,利用EGG stractTM IgY Purification System试剂盒提取卵黄抗体IgY,间接ELISA测滴度,SDS-PAGE和Western blotting验证其表达量和免疫活性.结果 本实验成功扩增出肠道病毒EV71 BrCr株VP1基因,获得了含重组表达质粒pET28a/VP1的阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1蛋白,VP1经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,利用纯化后VP1蛋白免疫产蛋母鸡,提取的IgY经ELISA 鉴定后其滴度为1：104,SDS-PAGE和Western blotting证实为抗VP1的特异性IgY.结论 成功的从EV71 BrCr株扩增出VP1基因,构建了PET28a/VP1表达载体,获得高效表达融合蛋白,免疫产蛋母鸡后制备高效价抗VP1蛋白的特异性IgY.     

A型流感病毒株A/Henan/703/2001(H3N2)核蛋白部分序列的原核表达

目的构建A型流感病毒核蛋白（NP）基因部分序列的原核表达质粒。并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法采用PCB方法扩增NP基因部分序列,并定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中。转化大肠杆菌BL21．将阳性菌落经IPTG诱导目的基因融合蛋白的表达。结果扩增到NP基因部分序列,构建成重组表达质粒pGEX—S NP,并在大肠杆菌中进行了表达。结论成功构建A型流感病毒NP部分基因序列的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了目的基因融合蛋白。     

蚯蚓纤溶酶PI_(239)基因在杆状病毒中的表达

利用基因重组技术将PI2 39基因通过细菌 /杆状病毒 (Bac to Bac)表达系统构建重组杆状病毒表达载体 ,载体采用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 ,将重组病毒转染昆虫Sf9细胞 ,细胞出现明显病变。SDS PAGE电泳可以见到相对分子质量 3 .0万位置有蛋白表达 ,免疫印记结果表明该条带可以与PI2 39抗体反应。提示蚯蚓纤溶酶PI2 39重组蛋白已经获得表达 ,为进一步研究蚯蚓纤溶酶PI2 39基因的生物学活性奠定了基础     

人ALEX2部分cDNA序列的克隆与表达

目的：克隆人ALEX2基因部分片段的cDNA,构建重组表达载体并诱导其表达．方法：通过RT—PCR技术从人胚胎脑组织中特异扩增出ALEX2基因部分编码序列片断(630—1058位核苷酸),克隆入pGEM—Teasy载体中,测序后亚克隆于表达载体pGEX-4T-3中,酶切鉴定正确,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导4h后,可表达Mc417000的目的蛋白．结果：特异扩增出大小约440bp的片断,经测序与已知序列完全一致,构建了融合蛋白的重组表达质粒PGEX-ALEX2,表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测,占菌体总蛋白量的15．5%．结论：获得了人ALEX2部分基因编码片断及其原核表达产物,为下一步ALEX2 mAb的制备和研究其生物学功能奠定了基础．     

人细小病毒B19 NS1片段全长的克隆及表达

目的 :克隆人细小病毒B1 9非结构蛋白 1 (NS1 )全长基因 ,构建重组表达载体并诱导表达。　方法 :利用聚合酶链反应 (PCR)和分子克隆技术 ,从我科保存的B1 9阳性标本XA2 0中扩增NS1片段全长 ,构建NS1 pGEM T easy克隆载体并测序分析 ,测序证实序列正确后亚克隆于pQE30表达载体中 ,并转化至M1 5感受态菌中 ,经IPTG诱导可表达 770 0 0的融合蛋白。　结果 :成功克隆了人细小病毒B1 9NS1全长基因 ,构建了融合蛋白NS1 pQE30的重组表达质粒 ,表达的融合蛋白经 1 2 %SDS PAGE电泳证实为 770 0 0。　结论 :获得人细小病毒B1 9NS1全长基因及原核表达产物 ,对进一步研究NS1的生物学活性及其单克隆抗体的制备有重要意义。