肝细胞癌候选相关基因IDD01的克隆与鉴定

目的鉴定表达序列标签(EST)在肝细胞癌(HCC)和癌旁非癌组织表达,扩增其全长.方法采用半定量RT-PCR方法,对21例HCC患者的癌组织和癌旁非癌组织EST mRNA的表达情况进行检测,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术扩增、测序获得全长,Blast检索GenBank.结果此EST在HCC癌组织中高表达,癌旁非癌组织中低表达(P＜0.05);序列全长为1 333 bp,含有完整开放阅读框(ORF)和Poly(A)尾;Blast检索为一功能未知基因.结论获得一个和HCC相关候选新基因,为进一步研究其功能打下基础.     

肝细胞癌相关差异表达基因和药物预测的生物信息学分析

目的 通过生物信息学方法筛选肝细胞癌(HCC)相关差异表达基因(DEGs)及潜在治疗药物.方法 从GEO数据库中选取GSE45436、GSE84402、GSE62232和GSE101685,使用R软件分析得到DEGs.随后对DEGs进行GO和KEGG分析,并构建PPI网络、筛选核心基因.最后进行生存分析和筛选潜在治疗药...     

NGX6基因在肝细胞癌中的表达及意义

目的:探讨NGX6基因在肝细胞癌及癌旁组织中有无表达及其与临床病理特征的关系.方法:肝细胞癌患者组织标本分为癌与癌旁对照组,应用RT-PCR检测45例肝细胞癌及配对癌旁组织NGX6表达,并对其表达和各临床病理参数的关系进行分析.结果:癌组织NGX6阳性表达率35.5%(16/45),NGX6表达强度相对值为0.245±0.060;癌旁组织阳性表达率为77.8%(35/45),强度相对值为0.352±0.113;癌与癌旁组织的表达阳性率及强度比较差异有统计学意义(P<0.05);肝细胞癌组织NGX6表达与TNM分期(x2=6.106,P=0.042)、淋巴结转移(x2:5.237,P=0.022)有关.结论:NGX6基因转录水平的表达降低或缺失,可能在原发性肝细胞癌的发生过程中起了重要作用,NGX6基因表达水平有可能作为一项早期预测肝癌发生发展的指标.     

7NGX6基因在肝细胞癌中的表达及意义

目的：探讨NGX6基因在肝细胞癌及癌旁组织中有无表达及其与临床病理特征的关系。方法：肝细胞癌患者组织标本分为癌与癌旁对照组,应用RT-PCR检测45例肝细胞癌及配对癌旁组织NGX6表达,并对其表达和各临床病理参数的关系进行分析。结果：癌组织NGX6阳性表达率35.5%（16/45）,NGX6表达强度相对值为0.245&#177;0.060;癌旁组织阳性表达率为77.8%（35/45）,强度相对值为0.352&#177;0.113;癌与癌旁组织的表达阳性率及强度比较差异有统计学意义（P〈0.05）;肝细胞癌组织NGX6表达与TNM分期（χ^2=6.106,P=0.042）、淋巴结转移（χ^2=5.237,P=0.022）有关。结论：NGX6基因转录水平的表达降低或缺失,可能在原发性肝细胞癌的发生过程中起了重要作用,NGX6基因表达水平有可能作为一项早期预测肝癌发生发展的指标。     

肝细胞癌组织中HBx基因缺失型突变体真核表达载体的构建和鉴定

目的 构建缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431真核表达载体.方法 以pGM-T/HBx-d382和pGM-T/HBx-d431质粒为模板,PCR扩增含Kpn Ⅰ和Apa Ⅰ酶切位点的HBx基因片段.双酶切后再与载体pcDNA3载体重组连接.重组质粒转化到大肠杆菌DH5a后,经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体.结果 成功构建了重组pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体,经DNA序列测定与比对,重组前后HBx基因片段序列一致.结论 pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体构建成功,可为HBx基因缺失型突变体,特别是HBx-d382基因的生物学功能研究提供基因材料.     

肝细胞癌患者组织中MAGE-1基因的原核表达及鉴定

目的:克隆MAGE-1基因并对其进行原核表达及鉴定。方法:通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从原发性肝癌的细胞中扩增MAGE-1基因片段,将该片段克隆在原核表达载体PET-32a中,重组克隆转化大肠杆菌BL21(DE3),表达的蛋白以His亲和柱层析纯化,并用Dot-blot和Western-blot对其进行鉴定。结果:经RT-PCR扩增出930bp基因片段,经测序分析后的DNA序列与Genbank中的报道序列同源程度达98%,构建含重组表达载体PET32-M1的工程菌,经IPTG诱导表达、纯化,MAGE-1蛋白浓度为0.48mg/ml,经Dot-blot和Western-blot检测,纯化蛋白可以与商业化的驴抗MAGE-1的多抗结合。结论:成功扩增了肝细胞肝癌中的MAGE-1基因全长cDNA并对其进行了原核表达与鉴定,为进一步研究MAGE-1基因的功能和研制有临床价值的全人抗MAGE-1抗体奠定了基础。     

肝细胞癌p53基因的突变与表达

目的：对HCC患者的肝组织和外周血单核细胞（PBMC）进行突变p53基因、p53蛋白和HBX的检测并作比较,以助评估它们与HCC发生的关系。方法：从HCC患者肝组织和PBMC中提取DNA,用PCR/SSCP和PCR/RFLP法分析p53基因突变。HCC中HBx与p53蛋白表达用免疫组化法检测。结果：HCC标本35.8%（5/14)显示p53基因第7外显子突变发生在249密码子。同样的PBMC标本中亦测到p53基因第7外显子有突变。免疫组化分析HCC肝组织中p53蛋白检出率为28.6%,而HBx在大多数标本中均有表达。结论：在HCC,p53基因突变热点在第7外显子,p53基因突变率与p53蛋白检出率均约30%～40%,HBx较善遍地存在于所测的HCC标本中。这提示p53蛋白与HBx蛋白相互作用可能是HCC发病机制中的重要一步。     

广西肝细胞癌SCP-1基因的表达

目的：检测SCP-1基因在广西人肝细胞癌中的表达情况。方法：应用SCP-1单克隆抗体。对33例肝细胞癌组织进行免疫组织化学法(SP法)检测。结果：发现28例阳性,SCP-1阳性颗粒均位于细胞质;正常的肝细胞为阴性。SCP-1在肝细胞癌组织中表达频率为84．85％(28／33)。结论：SCP-1在肝细胞癌组织中有高频率的表达,提示SCP-1将可能成为用于人肝细胞癌免疫治疗的靶抗原。     

Potential role of novel hepatocellular carcinoma-associated gene IDD01 in promoting tumorigenesis of HepG2 cell line

Background We have used suppression subtractive hybridization to construct a subtracted cDNA library of hepatocellular carcinoma （HCC） and isolated a panel of differential expression sequence tag （ESTs）. By using bioinformatics and rapid amplification of cDNA ends （RACE）, we found a novel HCC-associated gene IDD01. To further investigate its function, a recombinant eukaryotic vector pEGFP/ORF was constructed and transfected into the HepG2 cell line. Methods The open reading frame （ORF） of IDD01 was amplified by RT-PCR, digested with Bamh Ⅰ and Hind Ⅲ, and subcloned into the pEGFP-C1 vector. The ligation reaction was conducted with T4 DNA ligase, and the recombinant vector was named pEGFP/ORF. Untransfer control （control group）, pEGFP-C1 （HepG2/C1 group） and pEGFP/ORF （HepG2/ORF group） transfer groups were designed. Gene transfer was conducted with lipofectamine. To obtain stable transfection in HepG2 cells, selection was initiated with 500 μg/ml G418. Cellular IDD01 mRNA levels were assayed by semi-quantitative RT-PCR. The MTT colorimetric method and flow cytometry were used to determine the cell proliferation. The tumorigenic potential of transformed cells was determined from their ability to grow as anchorage-independent colonies on soft agar. Transient transfections were performed to observe subcellular location of GFP-IDD01 fusion protein. Results A 778 bp specific band of ORF was obtained by RT-PCR, and the positive clone of recombinant plasmid pEGFP/ORF （5.5 Kb） was identified by restriction endonuclease cleavage and sequence. The brightness ratio of IDD01 mRNA was not obvious between control and pEGFP/C1 groups, whereas the ratio of pEGFP/ORF was higher than that in the other two groups. After culture for 24-72 hours, the A490 values in pEGFP/ORF were higher than those in the other two groups （P〈0.01）. On histograms of flow cytometry, the S phase ratio of HepG2/ORF cells was significantly higher than that of the control and HepG2/C1 groups. The HepG2/ORF cells were able to form more colonies in soft agar compared with other HepG2 cell lines （P〈0.01）. GFP-IDD01 fusion protein predominantly localized in the plasma, whereas EGFP protein diffused all over the cell. Conclusion The IDD01 gene is a positive effector in cell proliferation and contributes to the carcinogenesis and progression of HCC. This gene may serve as a potential target for pharmaceutical intervention of HCC.     

人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的：构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体，大肠杆菌表达其融合蛋白．方法：采用反转录．聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2cDNA中，分别扩增出Heparanase编码基因，用限制性内切酶BamHI消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1中，经酶切鉴定与测序证实后，连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体，以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点，转化大肠杆菌BL21菌株，异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白．结果：构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实，与GenBank登录结果完全一致；双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3．1及pRSET；SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功．结论：成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体，成功正确表达了6His／Heparanase融合蛋白     

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体转化表达菌DH5α后 ,经过IPTG诱导 ,表达出 2 6kDa左右的CFP10 -ESAT6融合蛋白。SDS -PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h表达量最高 ,表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中 ,表达量占全菌蛋白质的 4 0 % ,Westernblotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni-NTA柱纯化后 ,获得了纯度为 98%的重组蛋白。结论 :成功构建MTblhp -esat6融合基因 ,成功构建原核表达载体pQE30 -CFP10 -ESAT6 ,并获得重组CFP10 -ESAT6融合蛋白 ,为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

凋亡抑制基因survivin表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin(SVV)的编码序列,构建含SVV基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌发病中的作用奠定基础. 方法:根据已发表的SVV基因的核苷酸序列设计并合成一对引物,以HL-60细胞系抽提的RNA为模板进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.0中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.0-SVV和DNA序列测定进行鉴定. 用脂质体法将pcDNA3.0-SVV导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组化法和RT-PCR鉴定其表达. 结果:RT-PCR扩增出长445 bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.0后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致. pcDNA3.0-SVV在HepG2细胞中有稳定表达. 结论:成功克隆了SVV的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.0-SVV,有助于对SVV基因在肝癌发生中的致瘤机制做进一步研究.     

HSA-TP5融合基因表达载体的构建及其真核表达

目的：构建人血清白蛋白（HSA）-胸腺五肽（TP5）融合蛋白表达载体,并在毕赤酵母中表达,阐明其生物学活性。方法：利用基因重组技术构建HSA-TP5融合基因,并转染至毕赤酵母中从而构建其真核表达体系,通过琼脂糖凝胶电泳分离及试剂盒纯化获得PPICZαC-HSA-TP5真核重组表达质粒;采用两步发酵法对HSA-TP5基因工程菌进行高密度发酵,对发酵液上清蛋白沉淀浓缩,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、阳离子交换层析及疏水层析等方法分离纯化蛋白;采用MTT法检测该融合蛋白促淋巴细胞增殖活性。结果：PCR法获得HSA目的基因片段长度为1 845 bp。酶切鉴定融合质粒HSA-TP5-pPICZαC得到片段长度为707 bp。测序分析,目的基因HSA和TP5序列与GenBank公布的基因序列完全一致,并正向连接融合。PCR法鉴定PPICZαC-HSA-TP5真核重组质粒与酵母基因组DNA整合,与对照组比较,转化组出现基因片段长度为1 860 bp。SDS-PAGE分析,在甲醇诱导后72 h内,随着诱导时间延长,HSA-TP5融合蛋白表达量逐步升高。利用阳离子交换层析及AKTA多功能蛋白纯化系统纯化得到HSA-TP5融合蛋白。MTT法检测,HSA-TP5融合蛋白与TP5蛋白具有一致的促淋巴细胞增殖活性。结论：通过构建HSA-TP5毕赤酵母真核表达体系可获得HSA-TP5融合蛋白并具有生物学活性。     

铜绿假单胞菌外毒素A原核表达载体的构建及表达

目的 对铜绿假单胞茵外毒素A(PEA)全基因进行基因克隆,构建原核表达质粒并进行表达.方法 从铜绿假单胞茵中提取基因组DNA,设计PCR引物扩增出带信号肽的PEA目的 基因,经HindⅢ和EcoR Ⅰ消化后,与PET-32a裁体进行连接重组.用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等方法鉴定构建成功后.IPTG诱导目的 基因表达.结果 SDS-PAGE电泳结果显示,在分子量78 KD处有一条明显的新生蛋白带.表达的融合蛋白量约占细茵总蛋白的35%.结论 PET-32a-PEA原核表达质粒的成功构建及表达.为进一步研究有效的基因工程疫苗和免疫导向治疗的基因重组毒素奠定了基础.     

mompS-linker-flaA融合基因原核表达载体的构建及诱导表达

目的在嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)和鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)基因间加入一段柔性链接头(Linker),以构建mompS-Linker-flaA融合表达载体,并使其在大肠杆菌中表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建含mompS-Linker-flaA基因的重组质粒pET-LpSLF,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-Linker-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblotting进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了嗜肺军团菌906bp的mompS及1440bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSLF,SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-LpSLF在原核系统中得到了表达。结论嗜肺军团菌mompS-Linker-flaA基因在大肠杆菌中得到了表达,为进一步从分子水平研究其免疫原性、免疫保护性及其在临床诊断上的应用价值提供研究基础。     

以绿色荧光蛋白为报告基因的酿酒酵母表达载体的构建

目的：构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的酿酒酵母表达载体。方法：利用通用载体质粒融合系统（UPS），首先将GFP片断连入donor载体，随后在Cre酶作用下与acceptor载体融合，获得了带有GFP片断的酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）表达载体。结果：成功构建了以GFP为报告基因的酿酒酵母载体，并在酵母中得到表达。结论：GFP是一种理想的报告基因。同时，利用UPS能够高效、简便地进行酵母表达载体的构建。     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。