以金色分枝杆菌为模式菌株筛选抗结核活性化合物可行性研究

目的评估以金色分枝杆菌作为结核分枝杆菌模式菌株筛选抗结核抑制剂的可行性。方法以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv建立细胞水平的抑制剂高通量筛选模型,对本单位化合物库部分样品进行筛选,获得具有抗结核活性的化合物;进一步比较模式菌株金色分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌及谷氨酸棒状杆菌对具有较强抗结核活性样品的敏感性差异。结果利用基于结核分枝杆菌建立的全细胞筛选模型,从本单位化合物库的5万个样品中筛选得到67个最低抑菌浓度≤5μg/ml的化合物。对金色分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌和谷氨酸棒状杆菌有抑制活性的样品分别有22个(32.84%)、10个(14.93%)、12个(17.91%)和6个(8.96%),其中抑菌活性与抗结核活性差异在4倍以内的样品分别有16个(72.73%)、5个(50%)、7个(58.33%)和3个(50%)。结论相对于其他3种模式菌株,金色分枝杆菌对本单位样品库化合物的敏感性与结核分枝杆菌的最为接近,以金色分枝杆菌为模式菌株开展抑制剂筛选研究更有可能获得具有抗结核活性的化合物。     

以结核分枝杆菌H_(37)Rv莽草酸脱氢酶为靶点的高通量筛选模型的建立及应用

目的建立以结核分枝杆菌莽草酸脱氢酶为靶点的新型抗结核药物高通量筛选模型;用此模型筛选莽草酸脱氢酶抑制剂;进一步评价化合物对莽草酸脱氢酶活性的影响。方法表达并纯化结核分枝杆菌H37Rv莽草酸脱氢酶;利用还原型辅酶II(NADPH)在溶液中的光吸收,测定酶的活性,构建了该酶抑制剂的高通量筛选模型;用Z′因子法评价该模型的可靠性,并对5万余个化合物进行筛选;测定了各抑制剂的IC50并对抑制剂6186050的酶抑制动力学进行了研究;用菌液稀释法评价了抑制剂对某些临床分离菌株包括耐药菌株的影响。结果得到了重组莽草酸脱氢酶;测得比活力为20987U/mg,所建的莽草酸脱氢酶高通量筛选模型Z′因子为0.76,符合高通量筛选的要求;对5万余个化合物进行筛选得到9个抑制率较高的化合物;抑制剂6186050为竞争性可逆抑制剂;抑制剂6230384和6186050对海分枝杆菌的最低抑菌浓度(MIC)都是32μg/ml。结论建立了稳定性好、灵敏度较高的结核分枝杆菌莽草酸脱氢酶抑制剂高通量药物筛选模型,应用该模型筛选得到的抑制剂可能具有抑菌活性。     

核糖体蛋白L12-L10相互作用抑制剂的筛选及其抗结核活性的研究

目的以L12-L10相互作用为靶点筛选具有抗结核活性的先导化合物。方法应用酵母双杂交模型AH109(pAD-L12+pBD-L10)通过生长抑制方法筛选阳性化合物,以AH109(pAD-T+pBD-53)作为对照;通过96孔板法检测阳性化合物对耻垢分枝杆菌的抑制活性;应用定量微孔板快速显色法(MABA)检测抗结核杆菌活性;通过β-半乳糖苷酶活性定量检测判断阳性化合物在模型上对L12-L10相互作用的阻断活性;应用体外蛋白表达系统检测阳性化合物对蛋白表达的抑制作用;应用平皿二倍稀释法检测阳性化合物的药敏作用。结果筛选到4个在模型上具有活性的阳性化合物,其对耻垢分枝杆菌具有比较好的抑制活性,其最小抑制浓度(MIC)在3.125~12.5μg/ml之间;其中IBM-T275对结核分枝杆菌标准株和临床分离株均具有比较好的抑制活性,MIC在5~10μg/ml之间,而对细菌抑制活性较低,其MIC均在64μg/ml以上;IBM-T275能够抑制酵母模型内β-半乳糖苷酶的表达,并且能够体外抑制蛋白表达,其IC50为12.57μg/ml。结论筛选到1个具有抗结核杆菌活性的阳性化合物,其抗结核活性可能与阻断L12-L10蛋白相互作用相关。     

以丙氨酸消旋酶为靶点的高通量抗结核药物筛选模型的建立及应用

目的建立以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的新型高通量抗结核药物筛选模型,筛选丙氨酸消旋酶的抑制剂,获得以丙氨酸消旋酶为靶点的新型抗结核药物先导物。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,pET28a表达质粒为载体,将alr基因克隆至pET28a,构建pET28a::alr重组表达质粒,表达并纯化得到重组结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶;通过测定反应产物NADH在340 nm处光密度变化速率,检测酶反应活性,构建并优化该酶抑制剂的高通量筛选模型;应用该模型对化合物库进行筛选;测定活性化合物IC50以及对结核分枝杆菌的MIC。结果成功构建了结核分枝杆菌alr基因的表达载体;得到了纯度较高的重组丙氨酸消旋酶,测得该酶的比活力为13.53 kU/mg;所建立的丙氨酸消旋酶高通量筛选模型稳定性高,符合高通量筛选的要求;通过对70 000个化合物进行筛选,得到了5个活性较高的化合物,其中,IMB-XZ5对结核分枝杆菌的MIC为4~8μg/ml,且对结核分枝杆菌的作用具有较高的特异性。结论建立了稳定性好、灵敏度较高的结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶抑制剂高通量筛选模型,应用该模型筛选得到了具有较好抗结核活性的丙氨酸消旋酶抑制剂。     

PLK1 PBD靶向抗肿瘤抑制剂的筛选及活性研究

目的筛选靶向PLK1 PBD的抗肿瘤小分子抑制剂,对其抗肿瘤效果进行体外评价,为抗肿瘤药物提供先导化合物。方法利用荧光偏振模型初筛PLK1 PBD抑制剂;通过MTT法寻找初筛阳性化合物的敏感细胞系;利用流式细胞仪检测化合物对细胞周期和凋亡的影响;通过分子对接技术探讨化合物与PLK1 PBD结合方式;利用划痕实验测定化合物对肿瘤细胞迁移的影响。结果从20 000个化合物中筛选得到活性化合物1097C11,MTT结果显示其能抑制多种肿瘤细胞系的增殖;流式细胞仪检测其能够促进肿瘤细胞凋亡,在25μmol/L时,晚期凋亡达到77.02%;能导致细胞G1/M期阻滞,分子对接结果显示1097C11与PLK1 PBD结构域具有良好的亲和性,细胞迁移结果显示1097C11能够抑制HCT-116细胞的迁移,在20μmol/L时,迁移率低至33.4%。结论化合物1097C11具有较好的抗肿瘤活性,并有望成为靶向PLK1 PBD的抗肿瘤先导化合物。     

南蛇藤素和扁蒴藤素显著下调HLA-B*2705启动子的活性

目的： 利用高通量药物筛选方式,为寻找潜在的脊柱关节炎（SpA）新的治疗药物提供理论依据。方法: 选取12 264小分子化合物分别使用293T-HLA-B27和 HeLa- HLA-B27稳定细胞株,观察对HLA- B*2705启动子有调节作用的化合物,筛选能够下调HLA-B*2705启动子活性的阳性化合物：启动子活性>150%为激动剂,启动子活性<60％为抑制剂。并且对进一步筛选出的抑制剂进行细胞毒性试验及半数抑制浓度/半数效应浓度（IC50/ EC50）检测,筛选出具有较好剂量－效应的阳性化合物。结果：(1)使用293T-HLA-B27细胞第1次筛选出624种阳性化合物,阳性率为5.1%; (2)使用HeLa-HLA-B27细胞株对上述624种化合物进行再次筛选,有70种化合物再次显示出对B*2705启动子活性的增强或者抑制作用;(3)进行EC50/IC50检测的40种化合物中,6种化合物为抑制剂,表现出较好的剂量－效应曲线,其中南蛇藤素和扁蒴藤素均为雷公藤类衍生物。结论：南蛇藤素和扁蒴藤素可下调HLA-B27表达, 提示在今后针对HLA-B*2705相关的SpA患者治疗中, 它们可能是值得研究的潜在有效化合物。     

基于吩噻嗪类化合物的新型抗结核小分子化合物的设计、合成及活性研究

目的 借助计算机虚拟筛选技术设计并合成新型抗结核小分子化合物.方法 以氯丙嗪为模板分子,利用Discovery studio 3.0构建相应的3D药效团模型,并对虚拟化合物库进行筛选;对筛选结果进行手动择优选择,化学合成目标化合物并进行体外抗结核分枝杆菌的活性评价.结果 筛选得到活性化合物15个,并合成其中13个,其中化合物9(多巴胺)在体外对结核分枝杆菌表现出中等强度的抑制作用,MIC为8.0 μg/ml.结论 通过药效团的方法筛选得到了结构较吩噻嗪类化合物简单的抗结核活性小分子多巴胺,该化合物作为抗结核分枝杆菌的先导化合物,较吩噻嗪类具有更大的结构修饰空间.     

评价不同的打分函数对虚拟筛选β-分泌酶抑制剂富集率的影响

目的研究多种打分函数对计算机虚拟筛选β-分泌酶(β-secretase,BACE-1)抑制剂的影响。方法采用分子对接软件Surflex虚拟筛选了50个BACE-1的抑制剂和9950个无活性分子,同时应用5种打分函数对筛选的结果分别应用单个打分函数和多个打分函数组合得分排序。结果单独以Surflex_score一个函数抽提对接后的结合模式再进行打分排序后富集率为40,将Surflex_score和D_score两个函数组合后排序可获得48的富集率。结论组合多种不同的打分函数比单个打分函数打分能获得更多的活性化合物。     

3',4',5,7-四(二乙基磷酰基)-木犀草素对碱性脂肪酶活性影响机制的研究

目的探讨黄酮类化合物3',4',5,7-四(二乙基磷酰基)-木犀草素对碱性脂肪酶活性的影响。方法采用3',4',5,7-四(二乙基磷酰基)-木犀草素作为抑制剂,以改进后的铜皂法测定脂肪酶活性,测定3',4',5,7-四(二乙基磷酰基)-木犀草素的浓度与脂肪酶活性的关系,得出该化合物对脂肪酶活性影响,并测定其IC50值。结果该化合物对碱性脂肪酶活性的抑制作用为非竞争性抑制,其IC50为3.17×10-7mol/L。米氏常数K m=100 mmol/L,抑制常数K i=2.7×10-7mol/L。结论 3',4',5,7-四(二乙基磷酰基)-木犀草素对碱性脂肪酶的抑制机制是其与酶的活性部位以外的基团作用而导致酶活性降低,呈非竞争性抑制。     

以SAH水解酶为靶位的抗病毒筛选模型的建立与应用

目的　建立SAH水解酶体外抗病毒筛选模型。方法　由大鼠肝经分级硫酸铵沉淀及各种柱层析 (DEAE5 2 ,羟基磷灰石及SephadexG 10 0 )分离 ,纯化SAH水解酶。用同位素标记底物 ,以合成方向建立酶活性测定及抑制剂筛选方法。结果　纯化的SAH水解酶在SDS PAGE电泳上呈单一蛋白带 ,表现相对分子质量为 45 0 0 0 ,其底物腺苷的米式常数值为 (6 32± 0 17) μmol L。已知SAH水解酶抑制剂 S DHPA的IC50 为 7 6 μmol L。用消旋及位置异构体DHPA证实S DHPA抑制SAH水解酶活性的结构特异性很强。用此模型筛选不同结构化合物 42个 ,未发现抑制活性强于S DHPA的化合物。结论　由大鼠肝提纯SAH水解酶 ,并建立了体外模型 ,可用于抗病毒化合物筛选及酶抑制剂动力学研究     

五种药用石斛内生真菌抑制HIV-1整合酶活性研究

目的 评价5种药用石斛内生真菌发酵产物抑制HIV-1整合酶的活性.方法 将分离自石斛的202株内生真菌提取物共404个采用高通量ELISA法评价其抑制HIV-l整合酶活性;对抑制活性大于100％的样品进行量效关系考察并进行体外抑制肿瘤细胞活性筛选.结果 筛选得到19个对HIV-l整合酶抑制活性大于80％的样品,其中样品5119F、5297F、5097F、5140J和5211F的抑制率分别达到117.96％、113.53％、108.62％、103.74％和109.02％,其对应的IC50值分别为0.02024、0.003125、0.00862、0.01007 和 0.01192 mg/ml.结论石斛属药用植物内生真菌是一个潜在的、丰富的用于筛选HIV-1整合酶抑制剂的资源库,值得进一步研究和开发.     

以PLK1 PBD为靶点的小分子抑制剂筛选及其抗癌活性研究

目的利用荧光偏振模型进行PLK1 PBD抑制剂的高通量筛选,并对阳性化合6143D7的抗癌效果进行体外评价。方法采用噻唑蓝比色法检测初筛阳性化合物对不同细胞系增殖的影响;流式细胞术检测化合物对细胞周期以及凋亡率的影响;分子对接检测化合物与PLK1 PBD结构域的亲和性。结果利用荧光偏振模型得到的阳性化合物6143D7经噻唑蓝比色法检测显示能抑制癌细胞的增殖;流式细胞仪检测显示该化合物加药组G2/M期细胞比例高于对照组并能促进细胞凋亡;分子对接结果表明化合物与PLK1 PBD结构域的亲和性良好。结论该化合物通过抑制PLK1 PBD结构域的活性发挥抗癌作用,有望成为靶向PLK1的抗肿瘤先导化合物。     

具胆碱酯酶活性的抗人血清丁酰胆碱酯酶单克隆抗体3A5

目的研究具抗原酶活性的抗人血清丁酰胆碱酯酶单抗3A5的催化特性及活性位点。方法利用酶促反应动力学方法测定3A5的Km及Kcat/Km;根据胆碱酯酶抑制剂对其催化活性的影响情况分析其活性位点。结果3A5催化丁酰胆碱酯酶特异性底物的水解符合米.曼氏方程规律,但Kcat/Km明显小于抗原酶;丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF明显抑制其胆碱酯酶活性,胆碱酯酶活性中心催化位点抑制剂吡啶斯的明及活性中心阴离子位点抑制剂四甲基铵则分别对其产生竞争性及非竞争性可逆抑制。结论3A5具有与抗原酶相似但较弱的催化活性,具有与天然胆碱酯酶相似的活性中心催化位点及阴离子位点。     

卡斯帕酶-3抑制剂的高通量筛选及活性化合物F03ZA-575的初步研究

目的筛选并初步研究微生物来源的卡斯帕酶-3(Caspases-3)抑制剂活性化合物。方法使用E.coli异源表达的卡斯帕酶-3作为靶酶,建立基于Caspase-3酶抑制剂的体外高通量筛选模型并对微生物来源的共计10026个次级代谢产物提取物进行了筛选。使用有机溶剂萃取、硅胶柱和LH-20柱层析、高压液相分离等方法从代谢产物中分离活性化合物并经各种理化性质及NMR分析等对活性化合物的结构进行确定。结果从10026个微生物来源的代谢产物中筛选获得了10个阳性样品。其中,从1株真菌的代谢产物中分离得到的化合物F03ZA-575对Caspase-3酶显示出较强的抑制活性,结构解析确认该化合物与Duclauxin同质。结论该化合物对Caspase-3酶的抑制活性将有助于揭示其抗肿瘤作用的机制。     

蛋白激酶A抑制剂H-89通过调节核糖体蛋白S6激酶1的磷酸化阻断SP600125诱导的CMK细胞多倍体化

目的研究核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)翻译后修饰在巨核细胞倍体化调控方面的作用。方法 c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125和蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89单独或联合处理CMK原始巨核细胞白血病细胞。碘化丙啶(PI)染色,结合流式细胞术检测DNA的相对量,从而进行DNA倍体分析;Western blot法检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)下游靶分子S6K1表达和磷酸化修饰(Thr389和Thr421/Ser424)的变化。使用分子对接和激酶活性检测分析H-89与S6K1结合的关系以及对激酶活性的影响。结果 SP600125以时间和剂量依赖的方式诱导CMK细胞多倍体化,同时,上调S6K1的Thr421/Ser424磷酸化和下调Thr389的磷酸化。H-89不但部分阻断SP600125诱导CMK细胞多倍体化,而且下调S6K1的Thr421/Ser424磷酸化和上调Thr389磷酸化。分子对接和激酶活性分析发现H-89通过占据ATP结合位点,抑制S6K1活性。值得注意的是,H-89和SP600125均抑制PKA的活性,而且两者联合进一步抑制了PKA的活性,表明H-89阻断SP600125诱导CMK多倍体化与其对PKA的作用无关,而与S6K1磷酸化修饰状态的改变有关。结论 H-89通过调节S6K1磷酸化阻断SP600125诱导CMK细胞多倍体化。     

蛋白激酶A抑制剂H-89通过调节核糖体蛋白S6激酶1的磷酸化阻断SP600125诱导的CMK细胞多倍体化北大核心CSCD

目的研究核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)翻译后修饰在巨核细胞倍体化调控方面的作用。方法 c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125和蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89单独或联合处理CMK原始巨核细胞白血病细胞。碘化丙啶(PI)染色,结合流式细胞术检测DNA的相对量,从而进行DNA倍体分析;Western blot法检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)下游靶分子S6K1表达和磷酸化修饰(Thr389和Thr421/Ser424)的变化。使用分子对接和激酶活性检测分析H-89与S6K1结合的关系以及对激酶活性的影响。结果 SP600125以时间和剂量依赖的方式诱导CMK细胞多倍体化,同时,上调S6K1的Thr421/Ser424磷酸化和下调Thr389的磷酸化。H-89不但部分阻断SP600125诱导CMK细胞多倍体化,而且下调S6K1的Thr421/Ser424磷酸化和上调Thr389磷酸化。分子对接和激酶活性分析发现H-89通过占据ATP结合位点,抑制S6K1活性。值得注意的是,H-89和SP600125均抑制PKA的活性,而且两者联合进一步抑制了PKA的活性,表明H-89阻断SP600125诱导CMK多倍体化与其对PKA的作用无关,而与S6K1磷酸化修饰状态的改变有关。结论 H-89通过调节S6K1磷酸化阻断SP600125诱导CMK细胞多倍体化。     

抗耐药性结核病新药的先导化合物筛选

目的 采用结核分枝杆菌(Mtb)H37Rv对从上海陶塑生物科技有限公司购买的生物活性化合物库L4000进行抑制剂筛选,以获得具有成药前景的抗结核先导化合物.方法 采用已经建立的Mtb H37Rv细胞水平的抑制剂高通量筛选模型对化合物库L4000的7285个样品进行筛选,并测定初筛阳性化合物对H37Rv以及临床多药耐药结...     

磷酸二酯酶4抑制剂药效团模型的构建

目的 构建磷酸二酯酶4（PDE4）抑制剂药效团模型，为中草药的相关虚拟筛选研究提供新的方法。 方法 以22个具有PDE4抑制活性的化合物作为训练集化合物，其半数抑制浓度（IC50）范围在0．042～23000nmol·L^-1。利用Catalyst／HypoGen系统，对训练集化合物进行构象分析，通过对训练集化合物多个构象进行叠合，提取药效团特征及三维空间限制构建药效团模型。结合数据库搜索命中率筛选最优药效团。结果 最优药效团模型包含2个氢键受体、1个脂性疏水基团和1个芳香环特征，排除体积数为6个。模型相关系数、Totalcost值、Fixedcost值、Nullcost值、△cost值和Configuration cost值分别为0．9047、117．7、90．84、180.4、62．7和15．71。利用所得较优模型对MDL药物数据报道数据库进行搜索，该模型的命中已知活性化合物数与命中已知活性化合物总数比值为58．95％。 结论 利用Catalyst系统构建的PDE4抑制剂药效团具有较好的预测能力，可作为提问结构用于数据库的搜索，有助于中草药中具有抑制PDE4活性的化合物的虚拟筛选研究。     

BMP-2表达上调剂的筛选及其抗骨质疏松活性研究

目的筛选上调骨形态发生蛋白2(BMP-2)表达的新型小分子活性化合物,为研发抗骨质疏松药物提供先导化合物。方法应用国家新药(微生物)筛选实验室前期建立的BMP-2表达上调剂的高通量筛选模型,对化合物库中10 000余个化合物进行筛选,以染料木素作为阳性对照;应用实时定量PCR和Western blot方法检测活性化合物对U-2OS细胞BMP-2 mRNA和蛋白表达水平的影响。在mRNA水平考察了活性化合物对Runx2表达的影响,Western blot法检测活性化合物对Smad1/5/8蛋白磷酸化水平的影响;用PNPP法检测碱性磷酸酶活性,验证活性化合物体外促进成骨细胞分化的作用。结果在BMP-2表达上调剂模型细胞上筛选得到活性化合物E19773,其在模型细胞上的EC50为46.2μmol/L;实时定量PCR结果显示,化合物E19773能够提高U-2OS细胞BMP-2和Runx2的mRNA表达水平;Western blot结果显示,Smad1/5/8蛋白磷酸化水平明显升高;碱性磷酸酶结果表明E19773能够在体外促进成骨细胞的分化。结论化合物E19773在0.75~50μmol/L浓度范围内能明显上调BMP-2的表达,主要通过Smads通路来调控细胞成骨分化,是活性较好的BMP-2上调剂。     

靶向PLK1 PBD小分子抑制剂荧光偏振高通量筛选模型的建立

目的建立适用于靶向PLK1 PBD小分子抑制剂规模化筛选的荧光偏振高通量筛选模型。方法以pE T-28a-PLK1 PBD质粒转化E.coli Rosetta BL21(DE3),诱导表达并纯化PLK1 PBD蛋白。利用荧光偏振原理,以FITC-Poloboxtide作为分子探针,优选分子探针和PLK1 PBD最佳工作浓度,建立适用于PLK1 PBD小分子抑制剂筛选的荧光偏振高通量筛选模型。同时采用上述建立的荧光偏振筛选模型检测poloxin的抑制活性。结果成功诱导表达并纯化PLK1 PBD蛋白。选用30 nmol/L分子探针和200 nmol/L PLK1 PBD蛋白建立荧光偏振高通量筛选模型,其Z'因子可达0.74。基于该方法,检测poloxin的抑制活性,其IC_(50)值为(4.27±0.69)μmol/L。结论成功建立了适用于靶向PLK1 PBD小分子抑制剂筛选的荧光偏振高通量筛选模型。