小干扰RNA沉默EGFR基因对卵巢癌细胞侵袭力的影响

目的 通过小干扰RNA(siRNA)沉默表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达,旨在探讨其对卵巢癌SKOV3细胞体外侵袭力影响.方法 体外构建靶向EGFR基因siRNA质粒和阴性对照质粒, Lipofectamin 2000介导转染到SKOV3细胞中.实验分空白对照组、非特异性转染组、特异性转染组.采用RT-PCR和免疫细胞化学法检测EGFR基因mRNA和蛋白表达水平;采用平板克隆形成法检测细胞生长增殖能力;采用Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭力.结果 特异性转染组细胞EGFR mRNA 的表达与其他两组相比明显减弱(F=50.45,q=12.87、11.72,P<0.01),EGFR 蛋白表达明显下调(F=61.54,q=14.58、11.46,P<0.01);细胞生长增殖能力减弱(F=130.12,q=21.12、18.15,P<0.01);体外侵袭力明显降低(F=34.09,q=11.26、8.34,P<0.01).结论 siRNA可以有效抑制SKOV3细胞EGFR基因的表达,从而抑制SKOV3细胞增殖和侵袭能力.     

RNA干扰-转录后水平的基因沉默

随着人类基因组计划的初步完成,生命科学也随之进入后基因组计划的时代.在各种研究基因功能的方法中,RNA水平使目的基因沉默无疑是目前研究的新点和热点,特别是双链RNA(dsRNA)介导的转录后水平的基因沉默(PTGS),更是快速关闭基因的途径,目前在植物、线虫、果蝇和小鼠早期胚胎中均有发现和证实.这一现象的发现和应用将有助于基因功能及其在信号传导、病毒抵御机制等方面的研究,并有可能开创基因治疗的新模式.     

RNAi靶向沉默c-FLIP(L)基因对大肠癌细胞凋亡的影响

目的应用RNAi技术将c-FLIP(L)对应的SiRNA片段对大肠癌细胞株SW480凋亡的影响,明确RNAi靶向沉默c-FLIP基因在TRAIL介导的凋亡途径中的作用。方法与c-FLIP(L)对应的SiRNA片段转染入细胞,半定量RT-PCR法判断干扰前后FLIPmRNA水平的变化,Westernblot分析FLIP蛋白水平变化,比较分析干扰前后细胞对介导的凋亡敏感性的改变及转染前后TRAIL诱导的细胞凋亡的情况。结果 c-FLIP(L)可以减低SW480中FLIPmRNA和蛋白水平(P0.01),转染FLIP-siRNA后,TRAIL对大肠癌胞株SW480的遏制作用显著加强(P0.05),TRAIL介导凋亡明显增高(P0.05)。结论 RNAi靶向沉默c-FLIP(L)并能提高SW480对TRAIL灵敏度并诱使SW480凋亡。     

RNA干扰——一种有力的基因沉默工具

RNA干扰(RNAi)自从1998年被阐明以来,一直是科学研究的一大热点。短短几年,基于此机制建立的技术,在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机制研究等领域得到了广泛应用,已经成为一种有力的基因沉默方法。尤其对非编码RNA中的短干扰RNA与微小RNA的研究日益受到重视。本文从RNAi技术的发展、作用机制及应用等方面进行综述。     

RNA干扰靶向沉默HER2/neu基因对卵巢癌细胞株SK-OV-3的影响

目的：观察siRNA表达质粒稳定转染靶向沉默HER2/neu基因对SK OV 3卵巢癌细胞株的影响。方法：针对HER2/neu基因序列构建短发夹状siRNA真核表达载体(pGenesil 1 HER2/neu),转染卵巢癌细胞株SK OV 3,G418筛选出稳定转染株后,采用RT PCR和Western Blot法观察HER2/neu基因的沉默效果;CCK 8比色分析检测细胞体外增殖活力;流式细胞仪检测细胞周期。结果：测序证实成功构建HER2/neu的2个短发夹状siRNA真核表达质粒;稳定转染SK OV 3细胞后,转染了特异性HER 2/neu siRNA的细胞HER 2/neu mRNA及p185蛋白水平均明显低于亲本细胞及转染无义对照序列的细胞;CCK 8比色分析显示HER 2/neu基因沉默的细胞存活分数明显低于HER 2/neu基因高表达的细胞（P=0.000）;流式细胞仪细胞周期分析也显示,HER 2/neu基因沉默的细胞处于凋亡状态及非增殖期的比例明显增加（P均<0.01）,而处于合成期的比例却显著减少（P≤0.001）。结论：靶向HER2/neu基因的短发夹状siRNA可从转录及翻译水平有效地沉默HER 2/neu基因;HER 2/neu基因沉默的SK OV 3卵巢癌细胞增殖明显受抑制。     

基因沉默与RNA干扰

生物体经过漫长的进化和自然选择后逐渐形成了对异常基因活动进行监控和防御的能力,这种天然免疫机制在最近几年的研究中得到了进一步认识。所谓异常基因活动是指病毒基因侵入和复制,转座子和转基因表达。正常基因活动几乎不产生双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),而异常基     

RNA干扰EGFR基因对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响

目的构建表皮生长因子受体（EGFR）基因的小干扰RNA（siRNA）质粒,转染人卵巢癌细胞株sk-ov3后检测RNA干扰（RNAi）对EGFR基因表达及细胞对化疗药物敏感性的影响。方法体外构建EGFR小发卡状RNA（shRNA）的表达质粒,脂质体法介导将其转染入skov3细胞。实验分为正常对照组、非特异性转染组和特异性转染组。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测EGFR mRNA的表达,使用免疫细胞化学法（ICC）检测EGFR蛋白的表达。使用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）测定EGFR shRNA转染skov3细胞后细胞对顺铂敏感性的改变。结果EGFR shRNA转染组细胞EGFR mRNA的表达与其他两组相比明显减弱（F=87.73,q=16.81、15.33,P〈0.01）,EGFR蛋白表达明显下调（F=69.29,q=14.71、13.57,P〈0.01）;顺铂敏感性比正常对照组提高了约3倍。结论靶向EGFR基因的序列特异性shRNA可有效抑制skov3细胞中EGFR基因的表达,增强skov3细胞对顺铂的敏感性。     

沉默ERCC1基因对卵巢癌细胞A2780顺铂耐药性的影响

目的：研究RNA干扰切除修复交叉互补基因1（ERCC1）的表达后,卵巢癌细胞A2780对顺铂耐药性的变化。方法：A2780细胞分别转染ERCC1基因的siRNA和GFPsiRNA,并给予顺铂（使其终浓度达到3μmol／L）,蛋白质印迹法分别检测顺铂给药前后ERCC1蛋白的表达,并用MTT法检测顺铂不同浓度下A2780细胞的存活率。结果：①转染ERCC1 siRNA后,实验组蛋白质表达量较对照组显著降低;@ERCC1 siRNA＋顺铂组的ERCC1蛋白表达要弱于ERCC1 siRNA＋PBS组,而GFPsiRNA＋顺铂组的蛋白表达要弱于GFPsiRNA＋PBS组;③顺铂（浓度在0．75—12μmol／L之间）呈浓度依赖性地降低A2780细胞的存活率;④在相同浓度顺铂的作用下,与GFPsiRNA组相比,ERCC1 siRNA组的顺铂量效曲线左移。结论：顺铂能抑制沉默ERCC1基因后A2780细胞的生长,且在一定浓度范围内呈浓度依赖性;ERCC1是参与顺铂耐药性产生的重要因素之一。     

RNA干扰沉默雄激素受体基因对前列腺癌细胞生长的抑制作用研究

目的设计、合成针对雄激素受体(AR)基因的具有高干扰效率的si RNA,观察其对前列腺癌细胞的生长抑制作用。方法设计、合成多个针对AR的si RNA,转染前列腺癌细胞LNCaP,筛选出对AR基因干扰效率最高的ARsi RNA,用RT-PCR检测AR mRNA水平,并计算细胞生长抑制率。结果采用Silencer si RNA Construction Kit成功合成了ARsi RNA,转染LN-CaP细胞,筛选出一个对其生长抑制作用最强的si RNA,并证实AR mRNA水平显著下降,LNCaP细胞的生长抑制率为78.2%。结论针对雄激素受体的si RNA可沉默雄激素受体基因,并抑制前列腺癌细胞的生长。     

RNA干扰EGFR基因对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响

目的 构建表皮生长因子受体(EGFR)基因的小干扰RNA(siRNA)质粒,转染人卵巢癌细胞株skov3后检测RNA干扰(RNAi)对EGFR基因表达及细胞对化疗药物敏感性的影响.方法 体外构建EGFR小发卡状RNA(shRNA)的表达质粒,脂质体法介导将其转染入skov3细胞.实验分为正常对照组、非特异性转染组和特异性转染组.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测EGFR mRNA的表达,使用免疫细胞化学法(ICC)检测EGFR蛋白的表达.使用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测定EGFR shRNA转染skov3细胞后细胞对顺铂敏感性的改变.结果 EGFR shRNA转染组细胞EGFR mRNA的表达与其他两组相比明显减弱(F=87.73,q=16.81、15.33,P＜0.01),EGFR蛋白表达明显下调(F=69.29,q=14.71、13.57,P＜0.01);顺铂敏感性比正常对照组提高了约3倍.结论 靶向EGFR基因的序列特异性shRNA可有效抑制skov3细胞中EGFR基因的表达,增强skov3细胞对顺铂的敏感性.     

沉默Nek2基因对卵巢癌SKOV3细胞周期的影响

目的：研究RNA干扰NIMA相关激酶2（Nek2）表达对卵巢癌细胞SKOV3细胞周期的影响及其相关的分子机制。方法将针对Nek2基因的siRNA转染至SKOV3细胞中,采用流式细胞技术检测SKOV3细胞周期变化,并用Westernblot技术检测Nek2‐siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞48h后,与细胞周期相关的因子cyclinB1、CDK1及P27蛋白表达水平以及ERK1／2磷酸化水平的变化。结果空白对照组、阴性对照组和RNA干扰组中处于G2／M期的细胞比例分别为13．72％、12．27％和1．56％,与两对照组比较,处于G2／M期的干扰组细胞明显减少（P＜0．05）。Nek2基因沉默后,与两对照组比较,SK‐OV3细胞内cyclinB1和CDK1的蛋白表达水平明显下降,P27的蛋白表达水平明显上调,SKOV3细胞内ERK1／2磷酸化水平明显下降（P＜0．05）。结论沉默Nek2基因,可阻止卵巢癌SKOV3细胞启动有丝分裂,从而抑制其增殖。     

RNA干扰抑制PARP-1基因表达对卵巢癌细胞增殖及耐药性的影响

目的研究PARP-1基因在卵巢癌化疗耐药发生机制中的作用,探讨以该基因为靶向的小干扰RNA(siR-NA)能否有效逆转C13*细胞对顺铂(CDDP)的耐药性。方法采用实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)和蛋白印迹法(Western blotting)检测C13*、OV2008细胞中PARP-1 mRNA和蛋白表达差异;转染PARP1-siRNA后,通过RFQ-PCR和Western法验证干扰效果;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察转染后细胞对CDDP敏感性变化及对细胞增殖活性的影响。结果 C13*细胞中PARP-1 mRNA和蛋白的表达量分别是OV2008细胞表达量的(2.12±0.97)和(1.89±0.23)倍;特异性PARP1-siRNA能有效降低C13*细胞中PARP-1 mRNA、蛋白水平及其对顺铂的半数抑制浓度(IC50),分别下降(71.23±5.41)%、(73.84±3.78)%和(89.77±10.06)%(P<0.05),且C13*细胞的生长活力明显下降(P<0.05)。结论 PARP-1蛋白在卵巢上皮性癌细胞中的表达与顺铂敏感性相关;靶向PARP-1基因的siRNA可在转录和翻译水平抑制PARP-1基因表达,并能有效逆转C13*细胞对CDDP的耐药性。     

应用mRNA差异显示技术筛选卵巢癌耐药相关基因

目的 筛选卵巢癌泰素耐药相关基因。方法 采用间歇诱导法建立了卵巢癌泰素耐药细胞株Ｓｋｏｖ３／Ｔａｘｌ－２５;采用ｍＲＮＡ ＤＤ比较Ｓｋｏｖ３／Ｔａｘｏｌ－２５对泰素耐药增加４４倍,同时对顺铂也产生了耐药。比较Ｓｋｏｖ３和Ｓｋｏｖ３／Ｔａｘｏｌ－２５的ｍＲＮＡ,获得２２个差异条带。对其中５个差异条带进行了ＤＮＡ序列测定,有３个与已知的基因高度同源,分别为ｔＰＡ、Ｋｉａａ０３７２和ＬＤＬＣ。２个为未知     

HPV-16 E6基因沉默对宫颈癌CaSki细胞的影响

目的: 研究特异性抑制HPV E6基因的表达对宫颈癌CaSki细胞的影响. 方法: 构建表达HPV-16 E6基因siRNA重组质粒,体外转染CaSki细胞后检测E6 mRNA表达变化及E6主要作用靶分子P53的蛋白变化;流式细胞术分析细胞周期. 结果: 特异RNAi表达质粒转染CaSki细胞后明显降低了E6 mRNA水平,且P53蛋白水平增高. 流式细胞仪测定发现细胞停滞在G0-G1期,细胞增殖受到抑制. 结论: 采用RNA干扰技术能沉默CaSki细胞中整合的HPV-16 E6基因的表达,使细胞中抑癌蛋白P53水平增高,导致肿瘤细胞生长停滞.     

shRNA介导胰岛素样生长因子Ⅰ类受体基因沉默诱导人肺癌A549细胞凋亡的体内外研究

目的评价RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术对人肺癌A549细胞系中胰岛素样生长因子Ⅰ类受体（IGF-IR）表达的抑制作用及其体内外抑瘤效应。方法将IGF-IR特异shRNA转染人肺癌A549细胞株,检测IGF-IR表达水平和bcl-2及caspase-3的表达变化;MTT法检测体外培养细胞的生长抑制率;流式细胞技术检测细胞增殖周期;Western印迹法分析Akt和ERK磷酸化程度;荷瘤裸鼠肺癌模型中观察瘤内注射的抑瘤效应及凋亡情况。结果IGF-IR表达抑制率达89．8％,bcl-2表达为对照组的46％±6％,caspase-3激活为对照组的156％±8％,Akt、ERK磷酸化分别为对照组的20％和36％±3％;肿瘤细胞活力明显下降;直接瘤内注射后肿瘤体积减少至对照组的40％-50％,并促进肿瘤细胞凋亡。结论运用RNAi技术能有效抑制A549细胞IGF-IR的表达,使细胞增殖能力减弱,凋亡增加,瘤体生长受抑。     

siRNA干扰沉默bFGF基因对肺腺癌A549增殖和凋亡的影响

目的利用小分子RNA干扰沉默碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因的表达,探讨其对肺腺癌A549细胞Oct-4表达、细胞增殖和凋亡的影响。方法将A549细胞分为转染干扰质粒组(干扰质粒组)、转染阴性对照质粒组(阴性对照组)和未转染质粒组(空白对照组)。采用Real-Time PCR检测质粒干扰后A549细胞bFGF基因mRNA表达的变化;Western Blot检测Oct-4蛋白表达的变化;CCK-8比色分析法绘制生长曲线观察细胞增殖能力变化及Annexin-V-PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果 Real-Time PCR结果显示质粒干扰后A549细胞中bFGFmRNA表达下降(P<0.01);Western Blot显示干扰组A549细胞Oct-4蛋白表达下降(P<0.01);生长曲线结果显示干扰质粒组细胞增殖活力下降明显(第2～4天P<0.0 5,第6～7天P<0.01);流式细胞仪检测凋亡结果显示细胞凋亡增加(P<0.0 5)。结论靶向bFGF基因的小分子RNA可以抑制bFGF表达;bFGF基因被抑制后下调Oct-4表达,细胞凋亡增加,增殖能力下降。     

hTERT基因反义cDNA转染对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响

目的: 研究反义hTERT基因对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响.方法: 构建反义hTERT基因的真核表达载体,采用LIPOFCTAMINETM Reagent转染卵巢癌细胞系SKOV3,通过RT-PCR、Trap-ELASA、生长曲线、裸鼠体内致瘤能力等方法比较转染前后细胞hTERT基因表达、端粒酶活性、细胞生长、致瘤性等方面的变化.结果:转化细胞系细胞hTERT基因的表达受到抑制,端粒酶活性下调,肿瘤细胞的增殖与生长速度明显降低,细胞的克隆形成能力及裸鼠体内的成瘤能力下降,肿瘤的恶性表型部分逆转.结论:应用反义技术下调hTERT基因表达可有效降低端粒酶活性并部分逆转卵巢癌细胞的恶性表型,hTERT基因可望成为卵巢癌基因治疗的新靶点.     

人卵巢癌细胞系A2780中肿瘤干细胞的分离及鉴定

目的从人卵巢癌细胞系A2780中分离并鉴定卵巢癌干细胞。方法将A2780细胞置于含人重组表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、人重组碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、牛血清白蛋白和人胰岛素的无血清培养基中培养,采用连续传代诱导培养肿瘤干细胞,对每代分离出来的肿瘤干细胞进行流式检测,并对第4代肿瘤干细胞进行免疫荧光检测和逆向分化实验。结果从A2780细胞中成功分离出肿瘤干细胞,在上述无血清培养基中呈悬浮生长,具有很强的自我更新能力,流式检测显示随着传代诱导,CD133阳性率依次升高,免疫荧光进一步证实了CD133是卵巢癌干细胞的表面标记物,诱导分化实验说明其可逆向分化成为A2780肿瘤细胞。结论体外培养的卵巢癌细胞株A2780中存在卵巢癌干细胞,并能将其分离培养和诱导分化。     

利用RNAi技术抑制Bcl 2基因表达增强肺腺癌A549细胞放射敏感性

目的利用RNAi技术抑制Bcl 2基因的表达,观察其对肺腺癌A549细胞凋亡和放射敏感性变化的影响。方法构建Bcl 2基因的干扰质粒pBcl 2 siRNA,稳定转染人肺腺癌A549细胞,同时设立转染无意义链组、空载体组和未转染组。采用Real time RT PCR和Western blot方法, 观察Bcl 2基因在mRNA和蛋白水平表达的变化。采用流式细胞术和克隆形成方法,检测RNA干扰对A549细胞放射敏感性的影响。结果成功构建bcl 2 siRNA质粒,转染A549细胞,获得稳定转染细胞株A549/Bcl2 Ins;Bcl 2mRNA、 Bcl 2蛋白表达明显降低;A549/Bcl2 Ins凋亡率［（10.11±0.92）%］明显高于对照组,6Gy X线照射后凋亡率［（28.81±1.10）%］明显高于对照组及未照射组;A549/Bcl2 Ins的D0和Dq值分别为1.399和1.298,明显低于转染无意义序列细胞株A549/Bcl2 Neg(1.695和2.480)、转染空载体细胞株A549/SD (1.706和2.227)和空白对照细胞A549(1.816和2.777)。结论RNAi技术可以有效抑制肺腺癌A549细胞Bcl 2基因的表达,增强A549细胞对X线的放射敏感性。