用差示PCR法筛选类风湿性关节炎滑膜细胞中的高表达基因

目的 筛选类风湿性关节炎（RA）滑膜细胞中的高表达基因,以探讨RA滑膜细胞发生肿瘤样增殖和侵蚀软骨的分子机理。方法 以骨性关节炎（osteoarthritis,OA)滑膜细胞作对照,采用差示PCR（differentially display PCR)方法,克隆RA滑膜细胞中高表达的cDNAs片段,经反向点杂交排除假阳性克隆后,将阳性克隆进行基因序列分析,结果共回收76仆差异条带,得到42个有插段的克隆,经反向点杂交后得到22个阳性克隆,对其中19个克隆进行基因序列分析表明,最长片段为501bp长,最短片段为145bp长,大部分在300bp,有13个克隆为已知基因,其中包括组织蛋白酶,其它6个克隆为未知序列,这些未知序列中除一个序列外酶,其它6个克隆为未知序列,这些未知序列中除一个序列外都为基因的非编码区,结论 差示PCR方法在筛选差异表达基因方面存在着很大的局限性,组织蛋白酶B可能与RA滑膜细胞的软骨侵蚀性有关。     

类风湿性关节炎滑膜细胞凋亡研究进展

类风湿关节炎（RA）是一种主要累及小关节的慢性自身免疫性疾病。研究表明，RA滑膜细胞与疾病的发展存在着某些相关性。RA来源的滑膜细胞主要是指淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和内皮细胞以及成纤维细胞，近来研究发现滑膜细胞的凋亡在RA的发病过程中起着十分重要的作用。     

人类风湿性关节炎B型滑膜细胞的分离、培养和纯化

目的 建立一种人类风湿性关节炎滑膜细胞的体外分离、培养和纯化方法.方法 关节镜下钳取膝关节滑膜组织,采用组织块培养法和酶消化法分离滑膜细胞.经台盼蓝拒染计数,将细胞按3.2×106接种于培养瓶,传代培养.从形态学、光镜、细胞免疫化学、生长特性鉴定细胞类型.结果 反复贴壁和多次消化达到形态学上的纯化要求,纯度达96%以上,活性率为98%,成纤维细胞经鼠抗人单克隆抗体染色阳性,符合B型滑膜细胞特征.结论 本研究建立了简单易行的滑膜细胞分离、培养和纯化方法.为类风湿性关节炎致病机制的研究和治疗提供极有意义的体外细胞模型.     

应用抑制消减杂交克隆支气管哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因

目的 探讨嗜酸细胞在支气管哮喘发病中的分子机制。方法 提取1名哮喘发作病人嗜酸细胞总RNA为实验子，治疗后作为对照的嗜酸细胞的RNA为驱动子。检测子、驱动子的总RNA由SMART cDNA合成方法合成双链cDNA，进而由抑制消减杂交方法获得消减杂交产物。消减杂交产物克隆到T载体建立消减文库，对部分克隆进行杂交筛选及序列比对。结果 消减杂交文库挑取400个克隆进行PCR扩增，阳性率约为80％。部分阳性克隆经2轮杂交筛选及序列对比后获得6个差异片段，涉及与编码炎症介质、细胞信号传导、能量代谢和细胞凋亡相关的基因。结论 抑制消减杂交技术有效地克隆了支气管哮喘发作期和缓解期嗜酸细胞差异表达的基因，为阐明嗜酸细胞在支气管哮喘发病中的分子机制奠定了良好的基础，并为临床防治支气管哮喘、寻找新的药物和方法提供了依据。     

类风湿性关节炎滑膜再生的组织学观察

本文通过13例不同时间类风湿性关节炎患者滑膜全切除术后所取标本的组织学观察,发现术后一个月再生滑膜已形成;能完全再生;临床分级早者再生尤完好,功能改善也佳。机械因素影响小,感染因素可延缓生长。     

成纤维样滑膜细胞Toll样受体在类风湿性关节炎的研究进展

Toll样受体（toll-like receptor,TLRs）是一种I型跨膜蛋白受体,可识别微生物上特定结构的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）和宿主自身损伤细胞产生的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns,DAMPs）,在天然免疫中发挥着重要作用。     

应用抑制消减杂交克隆支气管哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因

目的 探讨嗜酸细胞在支气管哮喘发病中的分子机制。方法 提取1名哮喘发作病人嗜酸细胞总RNA为实验子,治疗后作为对照的嗜酸细胞的RNA为驱动子。检测子、驱动子的总RNA由SMART cDNA合成方法合成双链cDNA,进而由抑制消减杂交方法获得消减杂交产物。消减杂交产物克隆到T载体建立消减文库,对部分克隆进行杂交筛选及序列比对。结果 消减杂交文库挑取400个克隆进行PCR扩增,阳性率约为80%。部分阳性克隆经2轮杂交筛选及序列对比后获得6个差异片段,涉及与编码炎症介质、细胞信号传导、能量代谢和细胞凋亡相关的基因。结论 抑制消减杂交技术有效地克隆了支气管哮喘发作期和缓解期嗜酸细胞差异表达的基因,为阐明嗜酸细胞在支气管哮喘发病中的分子机制奠定了良好的基础,并为临床防治支气管哮喘、寻找新的药物和方法提供了依据。     

改良组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞

目的通过改良组织块细胞培养法,建立一种简单,可行的兔成纤维样滑膜细胞体外培养方法。方法无菌条件下取正常兔膝关节滑膜组织,剔净后剪成碎块,用灭菌滤纸吸掉组织上附着的水分,碎片接种于培养皿,观察细胞生长状况及形态特征。取第3代对数期细胞,用CCK-8法绘制其生长曲线,并用免疫荧光法检测波形蛋白的表达情况。结果体外培养的兔成纤维样滑膜细胞形态为长梭形纤维样,细胞生长力较旺盛,生长曲线为典型的"S"型,免疫荧光检测显示第3代细胞强表达波形蛋白。结论改良组织块法可以分离培养出兔成纤样维滑膜细胞,方法简便,成功率高,满足实验要求。     

类风湿关节炎病人滑膜细胞增生与fas和bcl-2基因的表达

目的探讨类风湿关节炎（ＲＡ）病人滑膜细胞增生是否与细胞凋亡有关。方法通过体外转录合成,并标记ｆａｓ及其配体（ｆａｓＬ）和ｂｃｌ－２ＲＮＡ探针,应用原位杂交方法检测１９例滑膜组织的基因表达。用免疫组织化学方法检测蛋白表达。用ＤＮＡ电泳和流式细胞分析仪检测细胞凋亡。结果７例ＲＡ病人滑膜衬里层细胞明显增生,其中６例有ｆａｓｍＲＮＡ表达,５例表达ｂｃｌ－２,而ｆａｓＬｍＲ－ＮＡ在所有病例均不表达。在ＲＡ滑膜衬里层中,ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ总是伴随ｆａｓ而表达,且ｆａｓ和ｂｃｌ－２的表达率较骨性关节炎（ＯＡ）及正常对照者（ＮＣ）明显增高（Ｐ＜０．０５）。免疫组织化学结果表明,ｆａｓ和ｂｃｌ－２蛋白在滑膜衬里层有表达。从６例ＲＡ、４例ＯＡ病人及３例正常对照者滑膜组织中提取ＤＮＡ,仅１例ＯＡ病人可见典型的ＤＮＡ梯形图形。培养的ＲＡ和ＯＡ病人滑膜细胞经流式细胞分析仪检测,表明自发凋亡的细胞很少（＜５％）。结论ＲＡ病人滑膜细胞内不存在明显的细胞凋亡现象,ｂｃｌ－２过量表达可能抑制了ＲＡ滑膜细胞凋亡,是ＲＡ滑膜细胞增生的原因之一。     

类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞增殖特性的体外研究

探讨类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）滑膜成纤维样细胞（fibroblast like synovial cells,FLS）体外培养时的增生特点,观察沙利度胺（thalidomide）、白芍总苷（total glucosides of peony,TGP）、艾拉莫德（iuratimod, T 614）在体外实验中对RA FLS细胞增殖分化特性的影响。方法:关节镜、关节活检针取RA患者滑膜组织或抽取膝关节积液分离滑膜细胞并培养和鉴定,MTT法和反转录 聚合酶链反应(RT PCR)法分别观察沙利度胺、TGP、T 614对FLS细胞存活分数（SF）的影响和RA FLS的c fos mRNA表达。结果: 体外培养传代的RA FLS为非恶性无限制增生。沙利度胺、TGP和T 614对RA FLS的细胞染色和表面标记等特征无明显影响,但对RA FLS的SF值均有不同程度的抑制（P<0.05）;3种制剂中沙利度胺对FLS的SF抑制率最强,T 614对FLS的作用最小（P<0.05）。生理剂量的沙利度胺和高剂量TGP干预时RA组药物浓度与FLS的SF值呈负相关（P<0.05）。RA FLS的c fos mRNA表达率高,加入沙利度胺、TGP和T 614共孵育3?d后c fos的表达率下降, 以沙利度胺作用最明显（P<0.05）。结论:在无炎症因子刺激时,体外培养的RA FLS呈良性增生方式。在实验剂量下沙利度胺、TGP和T 614均通过抑制c fos的表达、降低FLS增殖能力等不同途径发挥对RA滑膜细胞的免疫调节作用。     

Rho激酶抑制剂对类风湿关节炎患者滑膜单核巨噬细胞分泌炎症因子的影响

目的 研究类风湿关节炎(RA)患者关节滑膜单核巨噬细胞Rho激酶(ROK)活化情况,并探讨该激酶抑制剂对滑膜单核巨噬细胞分泌炎症细胞因子的影响.方法 单核巨噬细胞分离采用Ficoll密度梯度离心法和黏附法;ROK活性用磷酸化MYPTl蛋白表达来表示,磷酸化MYPTl蛋白检测采用免疫印迹法,单核巨噬细胞活性检测采用MTT法,细胞因子水平采用ELISA检测.结果 新鲜分离的RA患者关节滑液单核巨噬细胞ROK活性显著高于自身配对的和正常对照组外周血单核细胞;新鲜分离的RA患者滑液单核巨噬细胞磷酸化MYPTl表达量与RA患者DAS28评分呈正相关关系(r=0.69,P<0.05),ROK抑制剂Y27632在抑制RA滑膜单核巨噬细胞ROK活性的同时,对肿瘤坏死因子(TNr)α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6等炎症细胞因子分泌也有显著抑制作用,但对抗炎细胞因子IL-10分泌没有影响.结论 RA滑液巨噬细胞中ROK处于异常活化状态,并与RA疾病活动有关.ROK特异性抑制剂对RA滑液巨噬细胞分泌多种炎症细胞因子均有抑制作用,提示ROK可能是治疗RA滑膜炎症的潜在靶点.     

Screening of aplastic anaemia-related genes in bone marrow CD4+ T cells by suppressive subtractive hybridization

Background CD4(+) T cells play a crucial role in the pathogenesis of aplastic anaemia. However, the mechanisms of over-proliferation, activation, infiltration of bone marrow and damage to haematopoietic cells of CD4(+) T cells in aplastic anaemia are unclear. Therefore, we screened differentially expressed genes of bone marrow CD4(+) T cells of aplastic anaemia patients and normal donors by suppressive subtractive hybridization to investigate the pathogenesis of aplastic anaemia. Methods The bone marrow mononuclear cells of a first visit aplastic anaemia patient and a healthy donor of the same age and sex were isolated using lymphocyte separating medium by density gradient centrifugation. With the patients as “tester” and donor as “driver”, their CD4(+ )T cells were separated with magnetic bead sorting and a cDNA library established by suppressive subtractive hybridization. Then 15 of the resulting subtracted cDNA clones were randomly selected for DNA sequencing and homological analysis. With semiquantitative RT-PCR, bone marrow samples from 20 patients with aplastic anaemia and 20 healthy donors assessed the expression levels of differentially expressed genes from SSH library.Results PCR detected 89 clones in the library containing an inserted fragment of 100 bp to 700 bp. Among 15 sequenced clones, 12 were known genes including 3 repeated genes. Compared with normal donors, there were 9/12 genes over-expressed in bone marrow CD4(+ )T cells of patients with aplastic anaemia. The effects of these genes included protein synthesis, biology oxidation, signal transduction, proliferative regulation and cell migration. Not all these genes had been reported in the mechanisms of haematopoietic damage mediated by CD4(+) T cells in aplastic anaemia. Conclusions Screening and cloning genes, which regulate functions of CD4(+) T cells, are helpful in elucidating the mechanisms of over proliferation, activation, infiltrating bone marrow and damaging haematopoietic cells of CD4(+) T cells in aplastic anaemia.     

应用抑制性消减杂交筛选志贺菌基因转移耐多药相关基因

目的:应用抑制性消减杂交技术初步筛选志贺菌基因转移耐多药相关基因。方法:以志贺菌基因转移耐多药株DNA为检测子,以其敏感株DNA为驱赶子,构建DNA消减文库,采用PCR鉴定及斑点杂交进行筛选,并随机挑取阳性克隆测序,所得结果在GenBank中进行同源性比较和分析。结果:成功构建了志贺菌基因转移耐多药株的特异性DNA消减杂交文库。选取部分阳性克隆进行杂交筛选,其中5个测序成功,与GenBank数据库进行初步比对,3个可能为新基因,2个为已知基因(Tn3926转座子部分的转座酶基因及23SrRNA核糖体核糖核酸)。结论:成功构建了志贺菌基因转移耐多药株的特异性DNA消减杂交文库并获得了其耐多药相关基因,提示转座子介导的耐药机制可能在志贺菌基因转移耐多药中起重要作用。     

Screening and cloning of differentially expressed genes in placentas from pa-tients of pregnancy-induced hypertension by suppression subtractive hybridization

Suppresssion subtractive hybridization (SSH) was preformed to compare gene expression profiles of PIH pa-tients and normal pregnancy placentas. The subtraetive eDNA library of PIH placenta was set up and sereedned. Differ-ential cDNAs were cloned, and sequenced by T 7 primer methodology. One hundred and three differential eDNAs were isolated by SSH. Sequencing and BLAST analysis showed 90 inserts shared more than 95% homolog with sequences in the GenBank/EMBL database. We identified 36 putative genes including pregnancy-specific glycoprotein gene( BC005924), serine protease inhibitor gene ( BC012868 ), VEGFR-1 gene ( AF063657) etc.     

苗药验方四大血对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡和焦亡的影响

目的 探讨苗药验方四大血（SX）对人类风湿性关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLSs）凋亡和焦亡的影响。方法 数据库检索RA及凋亡、焦亡相关靶蛋白;韦恩软件分析获得与RA相关凋亡及焦亡蛋白;RA-凋亡-焦亡靶蛋白互作（PPI）网络构建以获取RA中凋亡和焦亡重要靶蛋白;Autodock vina软件进行分子对接验证SX主要活性成分与凋亡和焦亡相关蛋白的结合能力,并通过PyMoL软件进行可视化。人源第2代RA-FLSs MH7A细胞检测SX对MH7A细胞抑制率后分为空白对照组、雷公藤多甘片阳性对照组（TGT组,5 mg/L）及 5、10、20、40 mg/L SX 组,采用 Wound- healing 实验、Transwell 法、ELISA 法及Western blot法分别检测MH7A细胞的迁移和侵袭能力、凋亡和焦亡相关蛋白。结果 获得RA相关凋亡靶蛋白9个、焦亡靶蛋白15个、RA-凋亡-焦亡重叠靶蛋白4个,SX主要活性成分与TNF-α、Fas、Bax等靶蛋白均具有较高亲和力;与空白组相比,给药处理24、48、72 h,随着SX浓度增加,对MH7A细胞抑制率增加（P<0.05）,药物作用6、12、24 h,同一时间点内MH7A细胞划痕修复率随SX浓度增加而减少（P<0.05）;药物作用24 h,20、40 mg/L SX组MH7A细胞侵袭个数减少（P<0.05）;20、40 mg/L SX组和TGT组TNF-α、IL-1β、IL-18的表达水平均下降（P<0.05）;20、40 mg/L SX组Bax/Bcl-2比值均增加（P<0.05）;5、40 mg/L SX组Caspase-1表达量均减少（P<0.05）;20、40 mg/L SX组Fas和FasL表达量均增加（P<0.05）。结论 SX可诱导MH7A细胞凋亡、抑制其焦亡,减缓炎症反应,其作用机制可能与下调TNF-α、IL-1β、IL-18细胞因子水平,上调Bax、Fas、FasL,抑制Bcl-2和Caspase-1蛋白表达有关。     

应用抑制性消减杂交技术筛选脂肪细胞分化相关基因

目的:利用脂肪分化细胞模型筛选与脂肪细胞分化相关的差异性表达基因。方法:采用抑制性消减杂交技术,以诱导分化后的人前体脂肪细胞系SW872总RNA为Tester,诱导分化前的人前体脂肪细胞系SW872为Driver,将消减杂交获得的DNA片段与pGM-T载体连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,并与GenBank数据库进行同源性分析,获得差异性表达基因。结果:扩增消减cDNA文库获得135个白色克隆,随机挑选64个进行测序,共获得34个阳性克隆基因。结论:本研究成功构建了脂肪细胞分化差异性表达基因的消减cDNA文库,筛选出了与脂肪细胞分化相关的差异表达基因。     

类风湿关节炎患者滑液NK-22细胞对成纤维样滑膜细胞增殖的影响及其机制研究

目的探讨类风湿关节炎患者滑液NK-22细胞对成纤维样滑膜细胞增殖的影响及其可能机制。方法采用流式细胞术检测20例RA患者及20例健康对照外周血(peripheral blood,PB)、10例RA患者滑液(synovial fluid,SF)中NK-22细胞(NKp44+CCR6+NK细胞)比例。流式细胞术分选滑液NK-22细胞,鉴定细胞纯度;体外悬浮培养2周,佛波酯(PMA()20ng/ml)和ionomycin(0.5μmol/L)刺激后NK-22细胞培养上清液分别作用于成纤维样滑膜细胞(fibroblastlike synoviocytes,FLS)24 h、48 h、72 h、96 h,MTT法检测成纤维样滑膜细胞增殖情况。ELISA检测NK-22细胞培养上清中IL-22、T0.N05F)-;αR浓A度患。者结滑果液①NKR-A22患细者胞外比周例血为N4K.5-62%2细,明胞显比高例于为自0身.9外56周%,血明比显例高1于.31健5%康(对P<照0.外05)周。血②N流K式-22分细选胞2比×1例04个0.0N0K3%-2(2P细<胞,细胞纯度>90%。③PMA和ionomycin刺激后NK-22细胞培养上清作用于成纤维样滑膜细胞24 h、48 h、72 h、96 h可明显刺激成纤维样滑膜细胞增殖(P<0.05)。④PMA和ionomycin刺激后NK-22细胞培养上清中IL-22、TNF-α浓度分别为941.82 pg/ml和368.10 pg/ml。结论类风湿关节炎患者关节液NK-22细胞可明显刺激成纤维样滑膜细胞增殖,其可能机制与NK-22细胞能分泌白介素-22(IL-22)、肿瘤坏死因子(TNF-α)有关。     

抑制性消减杂交筛选与克隆果蝇七氟烷敏感性相关基因

目的 采用抑制性消减杂交(SSH)方法筛选与克隆果蝇七氟烷敏感性相关的基因,以进一步研究吸人麻醉药的作用机制.方法 以对七氟烷敏感和耐药的果蝇品系为研究模型,以野生型黑腹果蝇作为对照,应用SSH方法筛选与吸人麻醉药七氟烷敏感性相关的候选基因.结果 筛选到的差异片段中,在敏感品系中高调的有77个.低调的有56个;在耐药品系中高调的有58个,低调的有52个;在敏感品系中高调而耐药品系中低调的有4个.经过与果蝇基因库比对,确定了其中大部分基因的功能,发现这些基因均非位于Y染色体上;与吸入麻醉药敏感性相关的基因大部分位于第2号染色体上.结论 本实验结果与先前有的学者用遗传学方法定位所得结果基本一致,七氟烷麻醉相关基因定位于2号染色体上,为常染色体显性遗传,并且果蝇对吸入麻醉药的敏感性在雌性与雄性间无差异,为进一步研究吸人麻醉药的作用机制提供了新的思路和方法.