组织工程新技术：胚胎干细胞滋养层细胞的培养及其预处理条件

背量：人胚胎干细胞的培养及相关研究一直是近年来国内外科学家关注的热点，而胎鼠成纤维细胞作为滋养层细胞则是胚胎干细胞培养中不可或缺的条件。目的：探讨胎鼠成纤维细胞作为滋养层细胞在培养、传代及预处理等方面的条件。设计：分组实验研究。地点和对象：解放军第四军医大学西京医院烧伤科完成，对象为一级昆明小鼠，孕龄12d左右，由该校实验动物中心提供。干预：用胰蛋白酶消化法培养胎鼠成纤维细胞，观察细胞在增殖、传代、冻存及复苏等方面的条件；用不同浓度的丝裂霉素对细胞进行预处理，利用MTT法测定细胞的生长曲线，筛选最佳浓度及作用时间。主要观察指标：胎鼠成纤维细胞的培养和预处理。结果：胎鼠成纤维细胞的增殖速度较快，在第4代以后细胞开始变形并趋于衰老；以20mg／L丝裂霉素处理细胞2h，可明显抑制细胞的增殖而不引起细胞的死亡。结论：作为滋养层细胞，胎鼠成纤维细胞应选择第4代以前的细胞，丝裂霉素处理条件为20mg／L作用2h。     

CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备

背景：小鼠胚胎成纤维细胞作为干细胞生长用饲养层,优于无饲养层,它能够分泌一些既促进干细胞生长又能抑制干细胞分化的因子。目的：建立CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层最佳的分离培养方法,分析丝裂霉素C抑制成纤维细胞增殖的最佳浓度与时间,用于培养诱导多能性干细胞。方法：取孕10～15dCF-1小鼠,分离胎鼠原代成纤维细胞,经不同质量浓度（5,10,15,20mg/L）丝裂霉素C处理不同时间（1,1.5,2,2.5,3h）制备饲养层,并观察其增殖情况。将人诱导多潜能干细胞或胚胎干细胞在丝裂霉素C处理过的饲养层上培养,观察细胞集落生长情况。结果与结论：制备CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的最佳胎龄为13.0～14.0d。丝裂霉素C抑制CF-1小鼠胚胎成纤维细胞增殖的最佳浓度及作用时间为10mg/L,2.5h,成纤维细胞饲养层可以维持5～7d。诱导多能性干细胞与胚胎干细胞在经10mg/L丝裂霉素C处理2.5h后饲养层上能发育成典型的＂鸟巢＂状干细胞集落。     

高效制备昆明鼠胚胎成纤维细胞饲养层

背景：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层是胚胎干细胞培养最常用的方法,能有效抑制胚胎干细胞分化并促进其增殖,但其制备过程繁琐,工作量大,准备周期长。目的：探索建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层简单、高效的培养体系。方法：取13.5d胎龄胎鼠用改良组织块法及简化酶消化法分离培养原代成纤维细胞,倒置显微镜下观察不同方法培养的原代和传代鼠胚胎成纤维细胞的生长形态、结构及细胞数量变化。收集鼠胚胎成纤维细胞进行冻存,复苏后细胞经不同浓度作用时间的丝裂霉素C处理,制备饲养层。结果与结论：两种简化方法培养的原代鼠胚胎成纤维细胞生长状态良好,得到高效优质足量细胞,操作过程简单,省去了多次消化、离心、细胞计数等繁琐操作,均适宜于鼠胚胎成纤维细胞的原代培养。简化复苏法复苏后的细胞,按其生长汇合情况,以丝裂霉素C10mg/L作用1.5～2.0h或1mg/L培养过夜,省时并可获得细胞生长状态最佳的饲养层。     

高效制备昆明鼠胚胎成纤维细胞饲养层

背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层是胚胎干细胞培养最常用的方法,能有效抑制胚胎干细胞分化并促进其增殖,但其制备过程繁琐,工作量大,准备周期长。目的:探索建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层简单、高效的培养体系。方法:取13.5d胎龄胎鼠用改良组织块法及简化酶消化法分离培养原代成纤维细胞,倒置显微镜下观察不同方法培养的原代和传代鼠胚胎成纤维细胞的生长形态、结构及细胞数量变化。收集鼠胚胎成纤维细胞进行冻存,复苏后细胞经不同浓度作用时间的丝裂霉素C处理,制备饲养层。结果与结论:两种简化方法培养的原代鼠胚胎成纤维细胞生长状态良好,得到高效优质足量细胞,操作过程简单,省去了多次消化、离心、细胞计数等繁琐操作,均适宜于鼠胚胎成纤维细胞的原代培养。简化复苏法复苏后的细胞,按其生长汇合情况,以丝裂霉素C10mg/L作用1.5～2.0h或1mg/L培养过夜,省时并可获得细胞生长状态最佳的饲养层。     

人胚胎成纤维细胞饲养层的制备

背景：极小胚胎样干细胞是近年来发现的一种具有类似胚胎干细胞生物学特性的非造血干细胞，但对其体外培养扩增的方法报道极少。有研究推测，人胚胎成纤维细胞能为人骨髓极小胚胎样干细胞体外培养扩增提供良好的微环境。
　　目的：从人胚胎躯干中分离、培养人胚胎成纤维细胞，制备人胚胎成纤维细胞饲养层用于人骨髓极小胚胎样干细胞的培养。
　　方法：利用胰酶消化法从孕5-9周龄人胚胎躯干中分离培养人胚胎成纤维细胞。制作饲养层，使用不同浓度丝裂霉素C处理后，用于培养分选后的人骨髓极小胚胎样干细胞，以细胞形态、生长曲线作为胚胎成纤维细胞和饲养层的评价指标。
　　结果与结论：从人胚胎中成功分离培养出人胚胎成纤维细胞，该细胞可传代24代以上，且经过传代及冻存复苏后生物学特性无改变。丝裂酶素C低于12 mg/L时，人胚胎成纤维细胞增殖不能完全抑制；高于14 mg/L，人胚胎成纤维细胞可能死亡。12 mg/L丝裂霉素C作用3 h后能较好地抑制人胚胎成纤维细胞的增殖，并且保持其活力约2周，可以在很长一段时间内用作人骨髓极小胚胎样干细胞的饲养层。     

ICR小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备

背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性,且效果优于无饲养层单独添加一些细胞因子,而且可以为上述两种细胞提供类似的胚胎发育环境.目的:建立稳定高效的ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于培养人胚胎干细胞及诱导多能性干细胞.方法:使用胰蛋白酶消化法分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察不同的胰蛋白酶水平及消化时间对获取小鼠胚胎成纤维细胞的量及其增殖活性的影响;利用不同质量浓度丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞1,1.5,2,2.5,3,3.5 h制备饲养层细胞,MTT法检测其增殖活性,探索其制备饲养层的最佳条件.结果与结论:分离ICR小鼠胚胎原代成纤维细胞最佳胰蛋白酶浓度为0.05%,消化时间为12～15 min,丝裂酶素最佳作用质量浓度和时间为10 mg/L作用2.5 h,成纤维细胞饲养层可以维持8～12 d.0.05%胰蛋白酶消化15～20 min效果优于0.15%,0.25%胰蛋白酶消化;10 mg/L丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞2.5 h能有效抑制其增殖,表明该条件下的饲养层细胞能很好的支持胚胎干细胞及诱导多能性干细胞生长.     

鼠胚成纤维细胞的培养条件及滋养层制备

背景:鼠胚成纤维细胞经丝裂霉素C处理或Y射线照射阻断其有丝分裂后,铺层的细胞可保持活力但不增殖,并能够在生长过程中产生促进胚胎十细胞生长的因子和抑制胚胎干细胞分化的因子,但其生命期有限.目的:探讨分离小鼠胚胎成纤维细胞的最适胚龄与培养条件,以及用其制备细胞饲养层的效果.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-11/2006-07在广东省计划生育专科医院实验室完成.材料:清洁级昆明系孕7.5,10.5,13.5,16.5,19.5 d雌鼠各5只.方法:无菌取上述各孕龄小鼠胚胎分离鼠胚成纤维细胞,调整细胞浓度为1×107L-1、1×109L-1 1×1011 L-1,胰酶消化传代.当胚胎成纤维细胞生长并相互接触时,加入丝裂霉素C作用2-4 h,用无钙无镁PBS配制的胰蛋白酶液消化2～5 min,终止后用吸管吹打皿底,使细胞充分分离,以含10%胎牛血清的DMEM液调整细胞浓度为5×108 L-1,将该悬液移入明胶处理的培养皿内常规培养,制备鼠胚成纤维细胞饲养层.主要观察指标:胎龄、细胞浓度、传代次数对鼠胚成纤维细胞生长增殖的影响.不同胎龄鼠胚成纤维细胞饲养层制备效果.结果:7.5～19.5 d鼠胚均可分离出成纤维细胞,但7.5 d.10.5 d鼠胚分离所得成纤维细胞数最少,寿命短,且混有大量杂细胞:13.5d鼠胚分离所得成纤维细胞数量多,增殖快,所含杂细胞少:16.5～19.5 d鼠胚分离所得成纤维细胞生长状态不良,增殖缓慢,杂细胞较多.同等条件下与1x107 L-1、1×1011 L-1浓度比较,1×109 L-1浓度的鼠胚成纤维细胞生长状况良好,铺层时间适中,细胞寿命最长(P＜0.05).以13.5 d鼠胚成纤维细胞经初代培养后传4代,成功建立了成纤维细胞株,相同条件下1～代细胞形态,体积、生长状况无明显差别.7.5～19.5 d鼠胚成纤维细胞制备的饲养层,铺层时间基本相似(P＜0.05),细胞寿命均可维持一二周.结论:分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胎龄及细胞浓度分别为13.5d与1×109 L-1,4代以内传代次数不影响鼠胚成纤维细胞的生长增殖,且不同胎龄所制备的饲养层细胞寿命无差别.     

成纤维细胞生长因子支持人胚胎干细胞在无饲养层中的生长(英文)

背景:人胚胎干细胞是一种全能型细胞,可以分化为3个胚层的组织,目前国内对其无饲养层生长的研究较少.成纤维细胞生长因子是维持胚胎干细胞不分化状态的重要因子.目的:探讨长期培养过程中不同质量浓度成纤维细胞生长因子对人胚胎干细胞未分化状态和全能性维持的影响.方法:两株人胚胎干细胞在鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中培养3代,分别转移到含100,160,250 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中培养8代.从培养皿中移出胚胎干细胞,用IV胶原酶消化聚集成团的细胞,观察细胞分化状态和全能性情况.收集传8代后的胚胎干细胞,种植于SCID小鼠体内.对所得细胞做形态学评估,并进行碱性磷酸酶染色、表面标记免疫组化检测、RT-PCR检测OCT-4的表达、体内致瘤情况.结果与结论:在含160,250 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中,两株人胚胎干细胞可以保持原有性状,即细胞克隆呈圆形,核质比较高,中间大片区域为未分化细胞,周围为分化细胞;呈碱性磷酸酶强阳性表达;表达OCT-4转录因子蛋白;细胞表面标志SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81均呈阳性表达;聚集成团的胚胎干细胞培养10 d后形成拟胚体;种植于SCID小鼠体内可得含3个胚层组织的畸胎瘤.含100 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基不足以维持人胚胎干细胞的长期增殖,4代以后大部分细胞分化死亡.提示成纤维细胞生长因子质量浓度达160 μg/L以上时,可以单独支持人胚胎干细胞的体外稳定增殖,且不影响细胞分化状态和全能性.     

昆明白小鼠胎鼠成纤维细胞不同接种密度对人胚胎干细胞的影响

目的:以昆明白小鼠胎鼠成纤维细胞作为饲养细胞,观察其不同接种密度对人胚胎干细胞的克隆生长情况及分化率的影响。方法:实验于2003-07/2005-03华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。首先进行小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养。选取2～5代的小鼠胚胎成纤维细胞,待其至对数生长期倒掉或吸掉培养基,加入含10mg/L丝裂霉素C的细胞全培养液5mL,置37℃,体积分数0.05的CO2饱和湿度温箱中培养二三小时,在6孔板中加入0.1%明胶包被,放置30min以上,倒掉或吸掉含丝裂霉素C的培养基,磷酸盐缓冲液(-)清洗5遍,尽量除去丝裂霉素C,加入2mL0.05%的胰蛋白酶消化细胞,镜下观察,当细胞间出现裂隙,细胞变圆时(约2～4min),立即加入等量的全培养液终止消化,并用吸管反复吹打,使之成为单细胞悬液,在细胞计数板中央放置专用的盖玻片,用玻璃虹吸管吸取细胞,让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹槽处流出悬液,至盖玻片下被液体充满为止。用细胞计数板计算活细胞数,并分别按3×108、5×108、1×109L-1密度接种,机械法平均分人胚胎干细胞克隆,5个克隆/孔接种于不同密度的小鼠胚胎成纤维细胞上。观察克隆的生长情况及分化率,分化率=(完全分化克隆数 部分分化克隆数)/(完全分化克隆数 部分分化克隆数 未分化的克隆数)。结果:胚胎干细胞克隆在3×108L-1密度的小鼠胚胎成纤维细胞上生长极易分化,贴壁48h后无生长,72～96h分化率(98.0±2.0)%;接种于5×108L-1的小鼠胚胎成纤维细胞上后,胚胎干细胞生长与分化共存,贴壁后48h部分克隆生长,下次传代前分化率分化效率为(30.0±5.0)%;在1×109L-1小鼠胚胎成纤维细胞上,胚胎干细胞克隆贴壁后48h即开始生长,分化率为(1.0±0.2)%。3组之间分化率差异有显著性意义(P<0.05)。结论:以昆明白小鼠胎鼠成纤维细胞作为饲养细胞,1×109L-1可以起到促进胚胎干细胞的增殖,并抑制其分化的作用。     

小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育

背景:到目前为止已建立了数百个小鼠胚胎干细胞系,一般情况下实验室培养的胚胎干细胞有3个细胞来源,即胚泡内的内细胞群、胚胎生殖嵴的原始生殖细胞和应用克降技术制造人体胚胎并提取干细胞.目的:尝试用自制的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养小鼠胚胎干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-12/2007-09在辽宁医学院完成.材料:妊娠14.5 d的孕鼠40只,由辽宁医学院实验动物中心提供.方法:无菌条件下剪开孕鼠子宫壁,取出胚胎,去除头、尾、内脏和四肢后采用胰蛋白酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理3.5 h后接种于6孔板中,细胞贴壁后即为成纤维细胞饲养层.收集3.5 d的小鼠囊胚,在显微镜下将囊胚置于上述6孔板的中央,五六_人后取隆起生长的内细胞团块,分离后再培养.主要观察指标:成纤维细胞饲养层的制备情况,胚胎干细胞的生长状态、碱性磷酸酶染色结果及分化趋势.结果:光镜下小鼠胚胎成纤维细胞呈不规则形,生长较快,传代比例为1:4,经丝裂霉素C处理后细胞贴壁较慢,失去分裂增殖能力.小鼠囊胚孵出透明带的时间为24～72 h,从胞膜中孵出约为1 d,3～5 d后可形成胚胎干细胞集落,7 d后集落呈"鸟巢"状.组织化学染色后可见细胞内有大量的蓝紫色颗粒沉积,连续培养20 d,期间不换培养液,可见胚胎干细胞团分化为亮度较小、界限清楚的单核细胞.结论:小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

小鼠胰腺干细胞在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下的体外连续传代培养

背景:胰腺干细胞具有分裂与高度分化潜能的特性,可以在体外进行成功分离和培养,但体外如何对其进行有效扩增是亟待解决的问题.目的:在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下体外传代培养小鼠胰腺干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在广西中医学院基础医学院细胞无菌培养室完成.材料:SPF级新生昆明小鼠20只,孕14 d昆明小鼠多只,均购自广西中医学院实验动物中心. 方法:取SPF级新生昆明小鼠的胰腺组织,V型胶原酶消化,未消化完全的组织块自然沉降后,收集上层的含细胞离散液,离心弃上清,加入含角质细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清低糖DMEM培养基,在经多聚赖氨酸溶液处理的24孔板中培养.取孕14 d昆明小鼠,剖腹取胎鼠,去除头部及内脏,将躯干及四肢采用组织块胰蛋白酶消化法分离培养成纤维细胞,调整密度为5×108L-1接种于24孔板中, 传至第3代经丝裂霉素适当处理制备饲养层细胞.取原代培养5 d的胰腺干细胞,按30个/cm2密度种入铺有饲养层细胞的孔板中,当胰腺干细胞铺满小孔底部面积的80%时继续传代.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态变化,原代培养48 h对细胞进行碱性磷酸酶染色,通过免疫组织化学染色鉴定胰腺干细胞特异分子标志物巢蛋白的表达.分别于传代后2,3,4,5 d检测碱性磷酸酶、巢蛋白和胰十二指肠同源盒基因1的表达. 结果:原代培养的来源于胰腺组织的细胞中,可见一些大、圆、单个核的细胞,胞浆折光性强,核浆比例大,呈附壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达胰腺干细胞特异性分子标志巢蛋白,且具有活跃的分裂增殖能力.在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层条件下对胰腺干细胞进行体外传代培养,可连续传至第3代,各代胰腺干细胞仍保持大、圆、单个核、核浆比例大及增殖能力强等特性,传代后各时间点碱性磷酸酶、巢蛋白染色均呈阳性,胰十二指肠同源盒基因1蛋白染色呈阴性反应,可保持未分化状态. 结论:以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,经丝裂霉素C处理后可分泌供胰腺干细胞生长所需的因子,并抑制胰腺干细胞的自主分化,体外连续传至第3代仍能够保持较好的生长特性、高度增殖能力及未分化状态.     

三种不同饲养层上人胚胎干细胞生长状态的比较

背景:人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性.以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞作为饲养层尽管能够维持胚胎干细胞的未分化状态,但存在细胞克隆不饱满、平铺情况明显等问题.目的:制备小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合饲养层,观察人胚胎干细胞在其上面的生长状态.设计:多样本观察比较.单位:海南医学院附属医院生殖医学中心.材料:实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成.包皮来自于行包皮环切的儿童,由海南医学院附属医院泌尿外科提供,儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定.清洁级孕12.5～14.5 d的胎鼠11只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.方法:胎鼠麻醉后去除头、四肢和内脏,按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养,待生长汇合后冻存部分原代细胞,用丝裂霉素C处理2.0～3.0 h后,按1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层.人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上.上述两种成纤维细胞分别计数后,按1∶0,3∶1,1∶1,1∶3,0∶1比例混合,然后以1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即混合饲养层.观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态,并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测.撤除饲养层,观察人胚胎干细胞体外分化情况.主要观察指标:①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较.②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较.③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测.④体外分化实验.结果:①:生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满,而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实,其克隆形态显著好于其他两种饲养层.②:小鼠胚胎成纤维细胞:人包皮成纤维细胞按1∶1混合时,人胚胎干细胞显著堆积生长,克隆边缘清晰、隆起明显且饱满,按1:3混合时无明显变化,优于其余3种混合比例.③:碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性,分别在200～300 bp和300～400 bp处可见OCT-4和端粒酶mRNA表达的特异性条带.④:能形成拟胚体,贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞.?＃ 结论:①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比,两者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养,获得更佳的克隆形态.②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1∶1时效果较好.     

三种不同饲养层上人胚胎干细胞生长状态的比较

背景：人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞作为饲养层尽管能够维持胚胎干细胞的未分化状态，但存在细胞克隆不饱满、平铺情况明显等问题。 目的：制备小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合饲养层，观察人胚胎干细胞在其上面的生长状态。 设计：多样本观察比较。 单位：海南医学院附属医院生殖医学中心。 材料：实验于2006—04／2007—07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成。包皮来自于行包皮环切的儿童，由海南医学院附属医院泌尿外科提供，儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。人胚胎干细胞系HN—1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定。清洁级孕12．6-14．5d的胎鼠11只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。 方法：胎鼠麻醉后去除头、四肢和内脏，按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养，待生长汇合后冻存部分原代细胞，用丝裂霉素c处理2．0—3．0h后，按1 × 10^8 L^-1密度接种于明胶包被的中心皿内，UPd,鼠胚胎成纤维细胞饲养层。人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上。上述两种成纤维细胞分别计数后，按1：0，3：1，1：1，1：3，0：1比例混合，然后以1 × 10^8 L^-1密度接种于明胶包被的中心皿内，即混合饲养层。观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态，并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测。撤除饲养层，观察人胚胎干细胞体外分化情况。 主要观察指标：①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较。②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长?     

人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性比较

背景:不同来源饲养层条件下,人胚胎干细胞是否具有相同或相似的生物学特性尚不清楚,该问题的解决有利于建立标准化的饲养层体系.目的:观察比较人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性是否相同?设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09,2009-02在中国科学院昆明动物所完成.材料:清洁级孕12.5～13.5 d的ICR小鼠2只,由昆明医学院动物中心提供.永生化人成纤维细胞由美国约翰霍普金斯大学医学院建系并赠送,人胚胎干细胞株BG02由中国科学院昆明动物所提供.方法:无菌条件下取ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,永生化人成纤维细胞按常规培养,两种细胞经γ射线处理后,以2.5×10~4/cm~3接种在明胶包被的6孔板中.取人胚胎干细胞,分别接种在小鼠胚胎成纤维细胞或永生化人成纤维细胞饲养层上,加入含β-巯基乙醇的DMEM/F12培养基,使用前添加碱性成纤维细胞生长因子.主要观察指标:两种饲养层上的人胚胎干细胞的形态、特异性标记表达、Oct-4阳性率、细胞倍增时间.结果:培养在小鼠胚胎成纤维细胞和永生化人成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞,其形态相似,呈圆形或椭圆形集落;均表达SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81和Sct-4,但不表达SSEA-1.与小鼠胚胎成纤维细胞饲养层比较,永生化人成纤维细胞饲养层上人胚胎干细胞Oct-4阳性细胞率明显升高(P<0.05),倍增时间明显延长(P<0.05).结论:人源和鼠源成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞体外培养生物学特性存在明显差异.     

鸡胚胎干细胞分离方法和培养体系的优化

背景:胚胎干细胞是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的无限增殖细胞系。而鸡胚胎干细胞则是从X期鸡胚的胚盘分离而来。目的:优化鸡胚胎干细胞分离方法和离体培养体系。方法:采用滤纸纸环-发环的方法从X期鸡胚分离胚盘细胞,并采用STO细胞作为饲养层和大鼠肝细胞(BRL)条件培养基(CM)+细胞因子作为离体培养体系对分离的胚盘细胞进行培养。结果与结论:滤纸纸环-发环法获得的完整胚盘率为75%～85%,克隆形成率约为50%。BRL-CM+饲养层培养体系,鸡胚胎干细胞可传至7代,而BRL-CM+饲养层+细胞因子培养体系,鸡胚胎干细胞可传至25代。分离到的鸡胚胎干细胞,经碱性磷酸酶染色、SSEA-1染色鉴定,表明鸡胚胎干细胞处于未分化状态。提示,实验不仅优化了鸡胚胎的分离方法,获得完整且杂质少的胚盘,而且进一步优化了鸡胚胎干细胞体外培养体系。     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备

背景：建立一种既可以大量制备,又易于保存并保持较高活性的饲养层细胞是人胚胎干细胞培养研究的重要环节。 目的：建立昆明小鼠胚胎成纤维细胞的最佳分离培养方法,评价其用于人胚胎干细胞饲养层研究的可行性。方法：用不同浓度胰蛋白酶分步消化法体外分离和培养昆明小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性,制备胚胎成纤维细胞饲养层,检测人胚胎干细胞在饲养层上培养的生长状态。〈br〉 结果与结论：制备昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的最佳胎龄为13.5 d。不同浓度胰蛋白酶分步消化法制备的胚胎成纤维细胞生长状态好,获得的成纤维细胞纯度高,增殖活跃。冻存2周,1,3,6个月内复苏的细胞存活率差异无显著性意义。小鼠胚胎成纤维细胞在第2-4代增殖旺盛,第5代以后细胞增殖活力明显下降。人胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞长期传代后呈典型的未分化形态,碱性磷酸酶和过碘酸-雪夫染色均为阳性。结果表明建立的昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养法可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。     

具G418抗性NIH3T3细胞饲养层的制备

背景:建立具有抗药(新霉素或潮霉素)性的饲养层细胞是转染外源目的基因胚胎干细胞阳性克隆的筛选必备条件。建成的具有抗药性的NIH3T3细胞系可用于胚胎干细胞其他目的基因的筛选。目的:建立具有G418抗性的NIH3T3细胞系,用于转染pTet-on基因的胚胎干细胞阳性细胞克隆筛选的饲养层。设计:细胞培养观察及DNA检测。单位:中国医科大学实验动物部。材料:NIH3T3细胞由中国医科大学细胞生物教研室惠赠,pWL/neo质粒为美国哈佛大学医学院金壮教授惠赠。G418、白血病抑制因子(胚胎干细胞GRO106U/mL)、DMEM为GIBCOBRL产品,丝裂霉素-C、DIG标记及检测试剂盒为Roche产品,脂质体为Invitrogen产品,均购自沈阳联星生物技术有限公司。方法:①通过脂质体转染的方法,将含有neo基因的质粒pWL/neo导入NIH3T3细胞中。②将细胞传至25mL培养瓶中,加入梯度浓度的G418继续培养,通过观察细胞生长及死亡情况测定G418对NIH3T3细胞最小致死量。③将转染的细胞进行传代,挑取单个细胞的克隆至24孔培养板继续进行筛选扩增,选用正常的NIH3T3细胞加入相同剂量的G418的选择性培养基作为筛选的阴性对照。④采用较低的细胞密度铺板,加入含最小致死量G418的DMEM培养基进行再次筛选;同时选用正常的NIH3T3细胞为对照,使用含有最小致死量G418及未加G418的DMEM培养基进行培养,采用光学显微镜对G418抗性NIH3T3细胞进行观察。⑤选用具有G418抗性的NIH3T3细胞和小鼠胚胎成纤维细胞分别作为饲养层细胞进行传代,采用光学显微镜对培养后胚胎干细胞-D3细胞进行观察,并制备细胞DNA,对其进行PCR和southernblot鉴定。主要观察指标:①G418对NIH3T3细胞最小致死量的测定结果。②G418抗性NIH3T3细胞的筛选结果。③G418抗性NIH3T3细胞的生长观察结果。④胚胎干细胞-D3细胞生长观察结果及G418抗性NIH3T3细胞的鉴定。结果:①G418对NIH3T3细胞最小致死量为500mg/L。②经过500mg/LG418压力筛选后,获得了抗G418细胞克隆。③抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异。④饲养层培养的胚胎干细胞呈集落形状生长,边缘光滑,保持未分化的状态。用特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段,Southernblot鉴定结果表明neo基因片段已整合入G418抗性NIH3T3细胞中。结论:成功地培育了G418抗性NIH3T3细胞,生长在G418抗性NIH3T3细胞饲养层上胚胎干细胞细胞基本保持正常胚胎干细胞细胞特征。     

鸡胚胎干细胞分离方法和培养体系的优化

背景：胚胎干细胞是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的无限增殖细胞系。而鸡胚胎干细胞则是从X期鸡胚的胚盘分离而来。目的：优化鸡胚胎干细胞分离方法和离体培养体系。方法：采用滤纸纸环-发环的方法从X期鸡胚分离胚盘细胞,并采用STO细胞作为饲养层和大鼠肝细胞（BRL）条件培养基（CM）＋细胞因子作为离体培养体系对分离的胚盘细胞进行培养。结果与结论：滤纸纸环-发环法获得的完整胚盘率为75%～85%,克隆形成率约为50%。BRL-CM＋饲养层培养体系,鸡胚胎干细胞可传至7代,而BRL-CM＋饲养层＋细胞因子培养体系,鸡胚胎干细胞可传至25代。分离到的鸡胚胎干细胞,经碱性磷酸酶染色、SSEA-1染色鉴定,表明鸡胚胎干细胞处于未分化状态。提示,实验不仅优化了鸡胚胎的分离方法,获得完整且杂质少的胚盘,而且进一步优化了鸡胚胎干细胞体外培养体系。